全 文 ：生 物 技 术 2010 年 20(3)
Ω序列和 Kozak序列、3′端的多腺苷酸序列 poly(A)、切割序
列和加工序列、3′端多联终止密码子序列及 Nos 终止子，这些
元件有利于外源基因在受体植物中高效表达。融合杀虫基因
不但可以减少由于同源性造成的反式失活现象，而且可以使
不同基因同时等量表达，一旦融合基因插入植物基因组中有
利于转基因高效表达的位点，几个基因就可以同时发挥作用，
从而减缓昆虫对转基因产生抗性的进程，也扩大了抗虫基因
的杀虫谱［4，11］。
图 4 转基因烟草 vgbM基因 Western blot分析
Fig. 4 Western blot analysis of vgbM gene of transgenic tobacco plants
1，positive control ;2 ，nontransgenic group ;3 － 7，the transgenic tobacco
plants;M，marker.
表 1 转基因烟草离体叶的抗虫性实验
Table 1 Bioassay of in vitro leaves from transgenic tobacco plants for eval-
uating resistance to insect
转基因植株抗性类型
The type of resistance
of transgenic Plants
校正死亡率
Corrected ratio
of death larva
高抗植株数
Numbers of high
resistance to insect
抗性植株所占比例
The propotion of
resistant plants
高抗植株
High － resistant plant
> 80% 15* 46. 8%
中抗植株
Middle － resistant plant
50 ～ 80% 11 34. 5%
抵抗或不抗植株
Low or non resistant plant
< 50% 6* 18. 7%
总计 Total 35 100%
邓肯新复极差测验:* ，差异显著水平(P < 0. 05) ;，极显著水平
(P < 0. 001)。
Duncan＇s test (LSR) :* ，significance at P < 0. 05 lever;，extreme
significance at P < 0. 001 level.
透明颤菌能合成血红蛋白以适应在贫氧的环境生活，它
具有结合氧的特性，具有增强光合作用，可大幅提高植物生物
量［6］，本实验首次将 VHb 基因和融合杀虫基因，构建成双价
基因植物表达载体，导入烟草中的研究表明:可通过分子育种
培育作物抗虫，稳产新品种，该双价基因表达载体在生产应用
中具有潜在的应用价值，也为本实验室通过分子育种培育高
产，稳产抗虫棉花新品种奠定了技术基础。
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芸薹属类黄酮 3′ －羟化酶基因家族 RNA干扰载体的构建
陈倩，闫楠，马丽娟，柴友荣*
(西南大学农学与生物科技学院，农业部生物技术与作物品质改良重点实验室，重庆市作物品质改良重点实验室，
重庆市油菜工程技术研究中心，重庆 400716)
摘要:目的:构建芸薹属类黄酮 3′羟化酶(F3′H)基因家族的 RNAi载体。方法:采用 PCR克隆了 607bp的芸薹属 F3’H基因
家族的 RNAi片段，将其反义片段、正义片段分别采用 NcoⅠ + AatⅡ、BamHⅠ + XbaⅠ插入到改进型植物 RNAi 基础载体 pF-
GC5941M的启动子与间隔区、间隔区与终止子之间，形成 11 366bp 的重组载体 pFGC5941M － BF3′HI (简称为 pBF3′HI) ，复合
PCR鉴定后转化根癌农杆菌，获得工程菌株。结果:载体构建成功。结论:构建了 RNAi 载体 pBF3′HI，可用于芸薹属植物花色、
种皮色泽、茎叶色彩等性状的机理研究和遗传修饰。
关键词:芸薹属;类黄酮 3′ －羟化酶(F3′H) ;RNAi;载体
中图分类号:Q782 文献标识码:A doi:10. 3969 / j. issn. 1004 － 311X. 2010. 03. 008
Construction of RNAi Vector of Brassica Flavonoid 3′ －Hydroxylase Gene Family
CHEN Qian，YAN Nan，MA Li － juan，CHAI You － rong*
(Chongqing Rapeseed Technology Research Center;Chongqing Key Laboratory of Crop Quality Improvement;Key Lab of Biotechnology ＆ Crop Quality
Improvement of Ministry of Agriculture;College of Agronomy and Biotechnology，Southwest University，Chongqing 400716，China)
Abstract:Objective:Constructing of an RNAi vector of Brassica flavonoid 3′ － Hydroxylase (F3′H)gene family. Method:An 607bp
RNAi fragment targeted to Brassica F3’H gene family was cloned. Its antisense and sense fragments were inserted to the promoter － spacer
and spacer － terminator cloning sites of an improved plant RNAi basic vector pFGC5941M using NcoⅠ + AatⅡ and BamHⅠ + XbaⅠ
double digestions respectively. The resulted 11 366 bp recombinant vector was pFGC5941M － BF3′HⅠ (simplified as pBF3′HI). After
verification by multiple PCR，it was transformed into Agrobacterium to form engineering strain. Result:The vector was successfully con-
structed. Conclusion:The RNAi pBF3′HI was constructed，which can be used for mechanism dissection and genetic modification of Bras-
sica flower colors，seed coat pigments and plant surface anthocyanin pigmentation.
Key words:Brassica;flavonoid 3′ － hydroxylase (F3′H) ;RNAi;vector
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2010 年 20(3) 生 物 技 术
收稿日期:2009 － 12 － 06;修回日期:2010 － 01 － 29
基金项目:国家高技术研究发展计划(863 计划)专题课题(“甘蓝型油
菜类黄酮途径功能基因克隆及黄籽性状代谢工程研究”，
2006AA10Z110) ;重庆市科技攻关项目(“油菜分子育种及品质检测技
术研究”，CSTC2009AB1030)资助
作者简介:陈倩(1987 －) ，女，四川绵阳人，农学专业本科生，Email:
chenqian1010@ 126. com。* 通讯作者:柴友荣(1968 －) ，男，重庆巫山
人，研究员，博导，从事分子生物学、分子遗传学、植物分子育种研究，
发表论文 94 篇(SCI论文 24 篇) ，Email:chaiyourong1@ 163. com。
芸薹属(Brassica)与模式植物拟南芥(Arabidopsis thali-
ana)同属于十字花科，有多种重要的农作物，如禹氏三角中的
甘蓝型油菜(B. napus，AACC)是重要油料作物，白菜(B. ra-
pa，AA)和芥菜(B. juncea，AABB)是蔬菜和油料作物，甘蓝
(B. oleracea，CC)是蔬菜和观赏植物，其中甘蓝型油菜是由二
倍体物种白菜和甘蓝通过天然远缘杂交和染色体加倍而产生
的异源四倍体物种［1］。
类黄酮(flavonoids)物质是广泛存在于植物界的重要次生
物质，对植物的生长发育、抗病性、抗逆性、品质形成及根瘤共
生等有重要的生理意义［2］。芸薹属花瓣和花粉中的色素主要
为黄酮醇类，与吸引昆虫异花授粉、繁殖种子紧密相关，也是
金黄色菜花的观赏价值之所在。黄酮醇、黄酮等还是白菜、甘
蓝等芸薹属蔬菜茎叶中的重要保健性成分，具有清除自由基
和增加人体抗氧化活性的作用。紫菜苔、羽衣甘蓝等植株体
内的紫红色色素是花青素苷，它既是很好的天然色素，在人体
内也具有抗氧化的保健价值，还是羽衣甘蓝等的观赏价值之
所在。原花青素(单宁)是油菜等植物种皮中黑褐色色素的主
要成分，降低种皮色素可以减少油菜籽初榨油的色素污染，提
高菜籽饼粕的饲用经济价值。在相同遗传背景下，黄籽油菜
比黑籽油菜具有种皮薄，出油量高，油和饼粕中色素、木质素
含量低等优点，黄籽是油菜遗传改良重要性状［2，3］。甘蓝型油
菜中不存在天然的黄籽基因型，但通过远缘杂交培育的黄籽
甘蓝型油菜存在黄籽表型欠稳定、一致性差的问题。
类黄酮物质的生物合成均需要类黄酮 3′ －羟化酶(F3′H)
的参与，它在类黄酮途径中催化早期反应步骤，仅位于查尔酮
合酶(CHS)和查尔酮异构酶(CHI)之后，与黄烷酮 3 －羟化酶
(F3H)具有平行关系。F3′H 是细胞色素 P450 家族的一个重
要成员，能在辅因子 NADPH和 O2 的作用下，羟化柚皮苷和二
氢山柰酚 B －环上 3′位置，形成圣草酚和二氢槲皮素，进而合
成黄酮醇、花青素苷、原花青素等［2，3］。
RNA干扰(RNAi)是一种转录后水平的基因沉默技术，相
对于反义及共抑制技术，可获得更高的基因沉默效率。构建
可转录为 dsRNA的植物表达载体转化植物，可实现植物中目
标基因的可遗传的基因沉默，用于基因功能鉴定和创造分子
育种新材料［4］。
作者课题组此前已经克隆了甘蓝型油菜 F3′H 基因 2 个
成员［5］、白菜 F3′H 基因和甘蓝 F3′H 基因的全长 cDNA 和基
因组序列。目前尚未见有芸薹属 F3′H 基因植物表达载体构
建和转基因研究的报道，本研究构建了芸薹属 F3′H 基因家族
的 RNAi载体，将促进芸薹属类黄酮性状的分子机理研究和分
子育种。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 实验材料
甘蓝型油菜(Brassica napus)的黑籽保持系 5B 由重庆市
油菜工程技术研究中心提供，其基因组总 DNA 和生殖器官
(蕾、花、开花后 10、20、30 d的种子)混合总 cDNA由此前的研
究制备。
大肠杆菌(Escherichia coli)菌株 DH5α、根癌农杆菌菌株
LBA4404 由作者实验室保存。RNA 干扰载体 pFGC5941
(AY310901. 1)购自国际拟南芥生物资源中心，pFGC5941M 是
由本课题组在 pFGC5941 的基础上改进而成，改进之处是采用
来自甘蓝型油菜的 BnPAP2 基因第 2 内含子(BnPAP2I2)替换
了 pFGC5941 上过长的 PhChsA 间隔区，并在间隔区与启动子
间增加了一个 AatⅡ切点。
1. 1. 2 试剂
分子试剂均为生物技术级，pMD19 － T载体、DNA Ligation
Kit Ver. 2. 0、λ － HindⅢ DNA marker 为大连宝生物(TaKaRa)
产品。Easy － Taq DNA 聚合酶及 buffer、dNTPs、DL2000 plus
DNA marker、琼脂糖等为北京全式金(Transgen)产品。Biospin
胶回收试剂盒、Biospin 质粒小量提取试剂盒为杭州博日
(BioFlux)产品。限制性内切酶及 Buffer 为 MBI Fermentas 产
品。引物合成和测序由上海英骏(Invitrogen)商业完成。分析
纯试剂氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)、链
霉素(Str)等购自上海生工。
1. 1. 3 仪器
Eppendorf微量移液器系列(0. 1 ～ 1 000 μl)、Eppendorf
Minispin Space微量离心机、Gene spec I 快速核酸蛋白自动分
析仪，MJ PTC － 200 梯度 PCR仪，DYY －12 型电泳仪及水平电
泳槽，FR － 200A全自动紫外与可见分析仪，超净工作台、恒温
振荡器、恒温培养箱、冰箱、水浴锅等。
1. 1. 4 培养基
LB培养基，视载体不同而补充抗生素。
1. 2 方法
1. 2. 1 芸薹属 F3′H基因家族干扰片段的扩增
以 5B 总 cDNA 为模板，采用正向引物 FBTT7I (GGATC-
CGACGTCAATTTCGCTAGCCGACCA，下划线处为 BamHⅠ和
AatⅡ切点)与反向引物 RBTT7I (TCTAGACCATGGTTAGAGT-
TCCACCCTCAC，下划线处为 XbaⅠ和 NcoⅠ切点)组合，扩增
芸薹属 F3′H基因家族干扰片段 BF3′HI，50μl 标准 PCR 体系
含 0. 5μl 模板和 1. 5U Easy － Taq DNA 聚合酶，反应条件为:
94℃预变性 2min;94℃变性 1min，58℃退火 1min，72℃延伸
1min，30 个循环;最后 72℃延伸 10min。电泳照相后，切胶回
收目的条带，与 pMD19 － T 连接重组为 pMD19 － T － BF3′HI，
转化 DH5α，PCR阳性的克隆子菌液送样采用 M13F测序。
1. 2. 2 芸薹属 F3’H基因家族 RNA干扰载体的构建与鉴定
取 pMD19 － T － BF3′HI和 pFGC5941M质粒，均进行NcoⅠ
+ AatⅡ双酶切至完全，电泳后分别回收反义片段 BF3′HIA 和
开环的 pFGC5941M骨架，采用 T4 DNA 连接酶将二者于 16℃
连接 12h，得到重组质粒 pFGC5941M － BF3′HIA，转化 DH5α，
菌液 PCR阳性的单克隆提取质粒。
采用 BamHⅠ + XbaⅠ分别对 pMD19 － T － BF3′HI 和 pF-
GC5941M － BF3′HIA进行完全双酶切，电泳后分别回收正义片
段 BF3′HIS 和开环的 pFGC5941M － BF3′HIA 骨架，采用 T4
DNA连接酶将两者于 16℃ 连接 12h，得到重组质粒 pF-
GC5941M － BF3′HI，转化 DH5α，对克隆子菌液进行复合 PCR
检测，阳性克隆子即为芸薹属 F3′H基因家族 RNA干扰载体。
1. 2. 3 工程菌株的获得
从鉴定无误的大肠杆菌单克隆菌液中抽提 pFGC5941M －
BF3′HI质粒，用液氮冷激法转化根癌农杆菌 LBA4404(感受态
细胞制备同 DH5α) ，LB 平板和单克隆菌液均采用 Kan
(100mg /L)、Rif (40mg /L)和 Str (20mg /L)三重筛选，菌液
PCR鉴定同 1. 3，阳性单克隆培养后作为植物转化的工程菌
株。
2 结果与分析
2. 1 芸薹属 F3′H基因家族干扰片段的克隆
引物组合 FBTT7I + RBTT7I扩增 5B总 cDNA模板后，PCR
产物电泳后得到一条与预期大小一致的特异条带(图 1)。将
其回收，与 pMD19 － T连接，转化 DH5α，PCR阳性的 2 个单克
9
生 物 技 术 2010 年 20(3)
隆菌液测序后实际长度均为 607bp，序列一致，它对应于 BnF3′H1基因，与其 mRNA对应区段完全一致(图 1)。
图 1 BF3′HI的扩增(A)和序列(B)
Figure 1 Amplification (A)and sequence (B)of BF3′HI
2. 2 芸薹属 F3′H基因家族 RNA干扰载体的构建与检测
设计并合成了间隔区正向引物 FBnPAP2I2 (ATTTAAAT-
GACGTCAGGTTTACATTCAAGACACA)、间隔区反向引物 RBn-
PAP2I2 (GGATCCACCTAAGCATGCATTTGAAAA)、启动子 3′
正向引物 F35S3N (GGAAGTTCATTTCATTTGGAGAG)和终止
子 5′ 反向引物 ROCST5N (GCTCAGGTTTTTTACAACGTG-
CAC)。
pMD19 － T － BF3′HI经 NcoⅠ + AatⅡ完全双酶切后，除 T
－载体条带外，产生了与预期 593bp 一致的条带，但它与一个
500bp左右的融合而形成一个宽带(详见讨论) ，特异回收该
593bp的反义片段，记为 BF3′ HIA(图 2A)。pFGC5941M 经
NcoⅠ + AatⅡ完全双酶切，得到了开环的载体骨架(图 2B) ，回
收。BF3′HIA 与 pFGC5941M 骨架连接，得到 pFGC5941M －
BF3′HIA，转化 DH5α，抗 Kan 单克隆菌液采用引物组合
F35S3N + FBTT7I 和 RBnPAP2I2 + RBTT7I 进行 PCR 鉴定，分
别扩增出了与预期 711bp和 774bp 一致的条带(图 2C) ，说明
反义片段已按正确方向插入到启动子与间隔区之间，形成了
中间载体 pFGC5941M － BF3′HIA。
采用 BamHⅠ + XbaⅠ对 pMD19 － T － BF3′ HI 和 pF-
GC5941M － BF3′HIA 质粒进行双酶切，前者产生了与预期
605bp一致的正义片段 BF3′HIS(图 2D) ，后者产生了与预期
一致的 pFGC5941M － BF3′HIA 开环骨架(图 2E) ，回收二者，
连接重组，得到干扰载体 pFGC5941M － BF3′HI，转化 DH5α。
抗 Kan 单克隆菌液采用引物组合 FBnPAP2I2 + RBTT7I 和
ROCST5N + FBTT7I 进行检测，扩增出了与预期 788bp 和
726bp一致的条带(图 2F) ，说明正义片段已按正确方向插入
到间隔区与终止子间。同时，对单克隆菌液还采用 F35S3N +
RBnPAP2I2 和 FBnPAP2I2 + ROCST5N 进行 PCR，再次验证反
义片段和正义片段插入的位置和大小，结果分别扩增得到与
预期 878bp和 907bp一致的片段(图 2G)。综合 PCR 鉴定表
明，BF3′HIIA片段在 35S启动子与间隔区之间反义插入，BF3′
HIS片段在间隔区与终止子之间正义插入，两个片段的插入大
小和方向均正确，表明 RNA 干扰载体 pFGC5941M － BF3′HI
(简称为 pBF3′HI)构建成功(图 3)。
图 2 RNAi载体 pFGC5941M － BF3′HI构建中的酶切和 PCR鉴定
A，NcoⅠ + AatⅡ双酶切 pMD19 － T － BF3′HI;B，NcoⅠ + AatⅡ双酶切 pFGC5941M;C，pFGC5941M － BF3′HIA 的克隆子菌液 PCR 检测;D，BamHⅠ
+ XbaⅠ双酶切 pMD19 － T － BF3′HI;E，BamHⅠ + XbaⅠ双酶切 pFGC5941M － BF3′HIA;F和 G，pFGC5941M － BF3′HI的克隆子菌液 PCR检测。
Figure 2 Restriction digestions and PCR checking involved in construction of RNAi vector pFGC5941M － BANRI
A，NcoⅠ + AatⅡdouble digestion of pMD19 － T － BF3′HI;B，NcoⅠ + AatⅡ double digestion of pFGC5941M;C，PCR checking of pFGC5941M － BF3′
HIA colony culture;D，BamHⅠ + XbaⅠ double digestion of pMD19 － T － BF3′HI;E，BamHⅠ + XbaⅠdouble digestion of pFGC5941M － BF3′HIA;F
and G，PCR checking of pFGC5941M － BF3′HI colony culture.
2. 3 重组载体转化根癌农杆菌及鉴定
提取 2. 2 中鉴定正确的 DH5α单克隆的质粒，采用冻融法
导入根癌农杆菌菌株 LBA4404，获得抗 Kan、Rif和 Str的菌落，
抗性单克隆的菌液采用与 2. 2 一样的复合 PCR 鉴定，取得完
全一样的结果，表明干扰载体 pBF3′ HI 已成功转入到
LBA4404 中，载体结构保持完整，形成了工程菌株，可直接用
于植物转化。
3 讨论
pMD19 － T的 TA克隆位点的 M13F一侧的 500bp上游存
在一个 AatⅡ切点，所以本研究在用 NcoⅠ + AatⅡ从重组
pMD19 － T载体上切下反义片段时，伴随产生了一个 500bp 左
右的杂带，干扰了对目标片段(595bp)的判断和切胶。如果用
pGEM － T系列载体代替 pMD19 － T系列，则不存在该现象。
植物中普遍存在基因家族现象，RNAi 既可用于对不同成
员进行分别沉默，也可用于对整个家族进行有效沉默［6，7］。作
者课题组经过克隆和 Southern杂交表明，甘蓝型油菜只有 2 条
F3′H基因(BnF3′H1 ～ BnF3′H2) ，亲本物种白菜各有 2 条 F3′
H基因(BrF3′H1 和 BrF3′H2) ，甘蓝有 2 条 F3′H 基因(BoF3′
H1 和 BoF3′H2) ，BnF3′H1 和 BnF3′H2 分别起源于 BrF3′H1 和
BoF3′H2。RNA干扰片段 BF3′HI与 BnF3′H1、BnF3′H2、BrF3′
H1、BrF3′H2、BoF3′H1、BoF3′H2 在 mRNA 水平的一致性分别
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2010 年 20(3) 生 物 技 术
达到 100. 0%、99. 0%、99. 7%、99. 5%、98. 8%、99. 0%，均是高
度同源，因此理论上推测干扰载体 pFGC5941M － BF3′HI 可用
于甘蓝型油菜、白菜、甘蓝等多个芸薹属物种的转基因，介导
F3′H基因家族的高效沉默。F3′H属于 P450 超家族［14］，其基
因序列的中后部近 3′处与其它 P450 基因存在一些同源性区
段，本研究在设计时干扰片段 BF3′HI 避开了这些极保守区，
因此该载体不会引起非靶向沉默。
图 3 RNAi载体 pFGC5941M － BF3′HI质粒图
Figure 3 Plasmid map of RNAi vector pFGC5941M － BANRI
拟南芥 F3′H基因突变后种皮由深褐色变为苍白色，称为
透明种皮 7(transparent testa 7，tt7)［8］，大豆 F3′H突变影响种
皮和表皮毛中的色素成分［9］。牵牛花属植物中 F3′H 的多种
自发突变均使花色转化为带有红色调的颜色［10］。夏堇转入组
成性表达的 F3′H 后花色变得更红［11］。转基因下调 F3′H 和
表达玫瑰 DFR基因后，矮牵牛的花色则由红色变成橙色［12］。
这充分说明，采用 F3′H基因进行分子育种，完全可以对花色、
种皮色泽等性状进行修饰，创造新型性状。本研究构建了芸
薹属 F3′H基因家族的 RNAi载体，将有助于揭示 F3′H基因参
与芸薹属异花授粉、观赏花色、种皮色泽、植株色彩、食用器官
中类黄酮保健成分含量等性状形成的分子机理，为这些性状
的分子育种奠定基础。但是最近的研究表明，大豆叶表茸毛
中 F3′H基因的 mRNA水平只要达到温室生长材料中的 3%以
上，就足以产生茶色色素积累，只有 mRNA水平被抑制到该临
界值以下时才会使着色消失［13］。本 RNAi载体究竟能够将芸
薹属的内源 F3′H基因抑制到什么程度，植株着色性状究竟怎
么变化，是否也象大豆一样存在临界点，都有待于利用该载体
未完成转基因研究后才能回答。
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小鼠 Myf5 真核表达载体的构建及其在细胞中的定位
刘向东1，郭芬1，2，黄晓峰1，刘兆宇1，张欣1，李月琴1，周天鸿1
(1.暨南大学生命科学技术学院，广东 广州 510632;2.广东药学院生命科学与生物制药学院，广东 广州 510006)
摘要:目的:获得小鼠生肌调节因子 Myf5 基因并构建 pEYFP － C1 真核表达载体，观察 Myf5 在小鼠 C3H10T1 /2 细胞中的定
位。方法:利用 PCR获得 Myf5 基因克隆到 pEYFP － C1 载体中，利用脂质体将构建的表达载体转染 C3H10T1 /2 细胞，荧光观察
融合蛋白的表达。结果:从小鼠 cDNA文库中得到 760bp 的 myf5 的 CDS 序列后，重组到 pEYFP － C1 载体中并转染 C3H10T1 /2
细胞，荧光显示 Myf5 蛋白定位在细胞核中。结论:Myf5 载体成功构建并在小鼠 C3H10T1 /2 细胞表达，证明了 Myf5 蛋白定位于
细胞核，为进一步研究 Myf5 与其他蛋白的相互作用奠定了基础。
关键词:Myf5;C3H10T1 /2;细胞定位
中图分类号:Q786 文献标识码:A doi:10. 3969 / j. issn. 1004 － 311X. 2010. 03. 011
Construction of the Eukaryotic Expression Vector Carrying Encoding
Gene of Mouse Myf 5 and Its Location in 10T1 /2 Cells
LIU Xiang － dong1，GUO Fen1，2，HUANG Xiao － feng1，LIU Zhao － yu1，
ZHANG Xin1，LI Yue － qin1，ZHOU Tian － hong1
(1. College of Life Science and Technology，Jinan University，Guangzhou 510632，China;
2. College of Life Science and Bio － pharmaceutics，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China)
Abstract:Objective:To construct the recombinant eukaryotic expression vector pEYFP － C1 /Myf5 carrying encoding gene of mouse
Myf5 and test its location in 10T1 /2 cells. Method:The full length of Myf5 cDNA sequence was amplified from mouse cDNA library by
PCR. Then Myf5 CDS fragment was ligated into plasmid pEYFP － C1. C3H10T1 /2 cells were transfected with pEYFP － C1 /Myf5 vector.
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