全 文 ：[ 6]赵春燕 , 谢永贵 ,沈有信 , 等.不同贮藏与萌发方式下的亮叶
桦种子萌发差异 [ J] .种子 , 2010, 29(6):17-20.
[ 7]刘占文 , 赵小亮 , 李艳宾.新疆阿魏种子休眠特性及发芽条
件研究 [ J] .种子 , 2010, 29(6):69-71.
[ 8]马英姿 , 杨波华 , 王平.药用植物蚬壳花椒种子休眠及萌发
特性 [ J] .湖南师范大学自然科学学报 , 2009, 32(2):
98-102.
[ 9]沈国舫.森林培育 [ M] .北京:中国林业出版社 , 2001.
[ 10]王成霖.江南恺木种子休眠和萌发的初步研究 [ J] .植物生
理学通讯 , 1986(5):31-34.
[ 11]王小平 , 王九龄.白皮松种子内含物的提取 、分离及生物测
定 [ J] .种子 , 1998, 17(5):19-22.
[ 12]李合生.植物生理生化实验原理和技术 [ M] .北京:高等教
育出版社 , 2000.
[ 13]卢纹岱.SPSS统计分析 [ M] .北京:中国农业科技出版社 ,
2003.
收稿日期:2010-11-13
基金项目:湖南省博士后科研资助专项计划项目(2008RS4028);农业部公益性行业(农业)科研专项经费项目(200903017-10)。
作者简介:魏　林(1970-),女 ,湖南双峰县人;副研究员 ,博士 ,主要从事植物病害生物防治的研究。
哈茨木霉 T2-16发酵产物对豇豆种子细胞膜及
细胞保护酶系统的影响
魏　林 1, 2 , 　梁志怀 2 , 　曹福祥1 , 　陈玉荣 2
(1.中南林业科技大学 , 　湖南 长沙 410004;　2.湖南省植物保护研究所 , 　长沙 410125)
摘要:应用哈茨木霉 T2-16菌株在改良后的 GPF培养基中发酵培养获得的发酵产物 ,对豇豆种子进行浸种处理 ,分析了发
酵产物在种子萌发过程中主要生理生化过程的影响。结果表明 , 该发酵产物可增强豇豆体内超氧化歧化酶(SOD)、过氧
化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)等保护酶活性 , 有效保护种子细胞膜结构的完整性 , 减少了氨基酸 、蛋白质 、可溶性糖
等胞内营养物质的外渗 ,从而起到提高豇豆种子活力的效果。
关键词:　哈茨木霉;发酵产物;豇豆;种子活力
中图分类号:　S643.4　　　文献标志码:　A　　　文章编号:　1001-4705(2011)03-0047-03
EfectsoftheFermentedProductsofTrichodermaharzianumT2-16 onthe
CelMembraneandCelProtectiveEnzymeSystemofCowpeaSeeds
WEILin1, 2 , LIANGZhi-huai2 , CAOFu-xiang1 , CHENYu-rong2
(1.CentralSouthUniversityofForestryandTechnology, ChangshaHu nan410004, China;
2.HunanProvincialPlantProtectionInstitute, ChangshaHu nan410125, China)
Abstract:ThefermentedproductofT.harzianumT2-16 strainwasappliedoncowpeabyseedsoaking.The
efectsontheseedsvigorwerestudied.Theresultsshowedthatthespecificactivitiesofprotectiveenzymes, su-
peroxidedismutase(SOD), catalase(CAT)andperoxidase(POD)alincreased.Thefermentedsubstance
couldalsomakethecelmembranepermeability, decreasetheconductivityrate.Thecontentsofprotein, dissol-
ublesugarandaminoacidsincelexudatesofcowpeaseedlingswerelessthanthatoftreatedbywater.The
seedsvigorofcowpeatreatedbythefermentedproductweresignificantlyimproved.
Keywords:　Trichodermaharzianum;fermentedproduct;cowpea;seedsvigor
　　前期研究发现 , 生防木霉菌株 T2-16在改良后的
GPF培养基中培养获得的发酵产物 ,可明显提高豇豆
等多种作物种子活力 ,进而促进苗期生长 [ 1, 2] 。
为探明木霉菌的作用机制 ,应用该发酵产物对豇
豆种子进行浸种处理后 ,研究了其对与种子活力密切
相关的一些生理指标 ———细胞膜透性和细胞保护酶系
统的影响 ,现将研究结果报道如下。
1　材料与方法
1.1　材　料
十月红冬豇:江西省丰城市袁渡蔬菜种子站生产 ,
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研究报告　　魏　林 等:哈茨木霉 T2-16发酵产物对豇豆种子细胞膜及细胞保护酶系统的影响
DOI :10.16590/j.cnki.1001-4705.2011.03.067
表 1　T2-16发酵液浸种对豇豆种子的生理性状影响
处理 相对电导率[ μS/(cm·g)]
SOD活性
(U/mg)
CAT活性
[ mg/(min·g)]
POD活性
[ mg/(min·g)]
T2-16活性物稀释 10倍液 45.19aAB 42.97a 3.34a 8.14a
T2-16活性物稀释 50倍液 41.80aA 45.15a 3.42a 8.57a
T2-16活性物稀释 100倍液 51.57bB 38.85a 3.21ab 7.68ab
GPF培养液 63.05cB 31.32b 3.09b 7.28b
ck(灭菌水) 64.18cB 33.41b 3.02b 7.36b
　　注:表中数据采用邓肯氏多重方差分析 ,不同小写字母表示处理间达到 0.05水平显
著差异 ,不同大写字母表示处理间达到 0.01水平显著差异。
挑选其中大小基本一致 、颗粒饱满 、各部分结构完整且
健康无病的种子用于试验 。
哈茨木霉 T2-16菌株由湖南省植物保护研究所生防
研究室从土壤中分离得到 、具有良好的拮抗活性的优
良生防菌株 。将其在 PDA平板固体培养基上于 26℃
条件下培养 7d待用。
1.2　方　法
1.2.1　哈茨木霉 T2-16发酵产物的制备
将培养 7d的 T2-16菌株接种于改良的 GPF培养基
中进行培养 。发酵产物的制备参照魏林等方法 [ 3] 。
1.2.2　供试种子预处理
将供试豇豆种子表面消毒 、漂洗后 ,分别浸入盛有
50ml以下 5个处理溶液的培养皿中:哈茨木霉 T2-16发
酵液稀释 10倍液 、稀释 50倍液 、稀释 100倍液 , GPF
培养基参比对照液和作空白对照的灭菌水 ,浸泡 6 h
后待用 。
1.2.3　木霉菌 T2-16发酵液对豇豆种子细胞膜透性
的影响
　　本实验中以浸种时种子细胞内含物渗出液的相对
电导率和大分子物质含量来衡量细胞膜透性的大小 。
(1)萌发种子外渗液相对电导率的测定:将 1.2.2
浸泡后的种子置于培养皿中避光萌发 ,选取不同处理
的萌发种子 20粒 ,将其浸没于装有去离子水的锥形瓶
中 ,定容至 20ml,放在室温下 12h,用 DDS-11A电导
仪测定电导值 S1,然后将锥形瓶放置于沸水浴中 10
min,取出后定容至 20ml,冷却后用电导仪测定其电导
值 S2。
相对电导率(%)=S1/S2×100%,重复 3次 ,取
平均值 [ 4] 。
(2)大分子物质外渗率的测定:以浸种液中渗出
的物质量占种子中该物质总含量的百分率表示 。种子
中物质总含量用未浸种的种子测定。其中游离氨基酸
总量用茚三酮法测定 ,可溶性糖用蒽酮法测定 ,蛋白质
含量用考马斯亮蓝法测定 [ 5] 。
1.2.4　木霉菌 T2-16发酵液对豇豆种子细
胞体内保护酶系统的影响
　　(1)超氧化物歧化酶(SOD)活性的测
定:取萌发后 24h的不同浸种处理的豇豆
种子 ,于冰浴中用磷酸缓冲液(pH7.8)研
磨成匀浆 , 10 000r/min下冷冻离心 20min
后 ,上清液即为 SOD粗提液 。然后参照胡
伟民等[ 6]方法进行酶活的测定 。以抑制
NBT光化还原 50%为一个活力单位 。
(2)过氧化氢酶 (CAT)活性的测定:
取不同处理豇豆的子叶和近子叶端 1cm长的下胚轴
按 1∶4(W/V)比例加预冷的 pH7.8, 50mmol/L的 PBS
(内含 1%的 PVP, 2mmol的巯基乙醇 , 20mmol/L的乙
二胺四乙酸)。在冰浴中研磨成匀浆 , 4 ℃下 , 15 000
r/min,离心 20min,上清液即为酶粗提液 。参照刘厚
成等 [ 7]的方法进行酶活测定 。以 0.01OD为 1个活力
单位 ,以每克鲜重每分钟的 OD减少量计为总活力 。
(3)过氧化物酶(POD)活性的测定:取不同处理
豇豆的子叶 0.3g加入 0.1g石英砂 ,再分次加入 5ml
水冰浴研磨 ,于 4℃低温离心(8 000r/min)20min,上
清液用作酶活性测定 ,参照李玉泉等 [ 8]的方法进行测
定 。酶活性大小以每克鲜重叶片 1min内吸光度的变
化来表示 [ ΔOD470 /min·(FW)] 。
以上测定均重复 3次 ,取平均值 。
2　结果与分析
2.1　哈茨木霉 T2-16发酵液对豇豆种子细胞膜透性的
影响
2.1.1　对种子细胞膜完整性的影响
种子在水中浸泡后 ,通过测定其外渗物的相对电
导率 ,可判断种子细胞的完整程度 。通常细胞膜完整
性好 ,则外渗物含量少 ,所测得电导率数值就低 。老
化 、受损伤的细胞膜 ,具有不完整性 ,导致外渗物含量
增多。在本实验中 , 5个不同浸种处理间的豇豆种子
外渗液相对电导率差异较大 ,见表 1。实验结果表明 ,
参比对照和空白对照的电导率明显高于木霉发酵液处
理的 ,说明木霉发酵液处理后 ,可降低细胞膜在种子萌
发过程中所受到的破坏程度 ,维护细胞膜的完整。而
在木霉发酵液浸种处理中 ,又以稀释 50倍液浸种处理
的电导率值最低 。
2.1.2　浸种过程中种子物质外渗率的变化
　　5个不同浸种处理下 ,豇豆种子中游离氨基酸等 3
种大分子物质外渗率见图 1。图 1表明 ,所测 3种物
质中 ,均以哈茨木霉发酵液浸种处理的外渗率较低 ,其
中又以木霉发酵液 50倍稀释液的效果最好。这一试
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第 30卷　第 3期　2011年 3月　　　　　　 　　　　　种　子　(Seed)　　　　　 　　　　　　Vol.30　No.3　Mar.　2011
验结果与外渗液相对电导率的变化相一致 。实验结果
可看出 ,不同处理游离氨基酸外渗率较为接近 ,蛋白质
外渗率差异则较大 ,其中木霉发酵液稀释 50倍后处理
的豇豆种子蛋白质外渗率极显著低于培养液参比对照
和清水对照 。
图 1　不同处理豇豆种子物质的外渗率(%)
A:游离氨基酸;B:蛋白质;C:可溶性糖。
2.2　哈茨木霉 T2-16发酵液对豇豆种子细胞保护体系
的影响
　　SOD作为氧自由基的酶性清除剂 ,其活性相对增
加 ,增强了对氧自由基的清除能力;CAT和 POD主要
是起酶促降解 H2O2的作用 ,避免因其过量积累导致
毒性更大的 OH-.含量增加而对细胞膜产生伤害[ 10] 。
由表 1可看出 ,哈茨木霉 T2-16发酵液不同浓度浸种处
理豇豆种子后 ,细胞保护酶 SOD、CAT、POD的活性都
有所提高 ,其中 ,木霉发酵液稀释 10倍 、50倍后处理
豇豆种子 ,萌发种子中 3种酶活均显著高于参比对照
与清水对照 ,从而有效地保护了膜结构的完整性 ,减少
营养物质的外渗(渗漏),这与不同浸种处理后 ,所测
的豇豆种子外渗液相对电导率结果相符。
3　讨　论
细胞膜完整性是体现种子活力的一个重要生理特
性指标 ,它调节溶质的进出 ,维持细胞内外的浓度梯
度 ,以保证正常物质运转等生理功能[ 10] ,外渗液相对
电导率的大小 、细胞保护酶活性可以反映细胞膜受伤
害的程度。本试验研究结果表明 ,哈茨木霉 T2-16不同
浓度发酵液对豇豆浸种处理后 ,在一定程度上保护了
细胞膜的完整性 。具体表现为:细胞保护系统中清除
自由基的保护酶 (SOD、CAT、POD)活性增强 ,减轻了
细胞膜在种子萌发过程中由于生理代谢产生的自由基
所造成的伤害;此外 ,种子在吸胀过程也可能对细胞膜
造成损害 ,种子经发酵液中促生活性物浸种后 ,可能减
少或修复膜的这种损伤 ,改变了干燥种子膜磷脂的物
理状态 ,限制水分进入种子的速率 ,这样就可能减小种
子因快速吸涨造成膜系统的损伤 ,有利于细胞膜的修
复 ,减少营养物质的外渗(渗漏)。相关分析表明 ,浸
种时种子内电解质 、氨基酸 、蛋白质及可溶性糖的外渗
对豇豆幼苗的叶面积 、苗鲜重及茎粗的增加有极为不
利的影响 [ 11] 。所以 , 经哈茨木霉发酵产物浸种处理
后 ,减少了物质外渗 ,对培养壮苗无疑具有积极的作
用 。对豇豆苗期各种生长指标的测定结果 ,也很好地
说明了这一点。盆栽试验中 ,木霉发酵产物浸种处理
后 ,豇豆出苗提前 ,成苗率提高 ,植株中各种生理生化
指标(植株生物量 、蛋白质含量 、叶绿素含量)均优于
对照[ 1] 。总之 ,在供试的浓度范围内 ,哈茨木霉 T2-16发
酵液浸种处理 ,可以提高豇豆种子的活力 ,但该发酵产
物是否作为种子萌发的必需元素而参与酶的辅助作用
或激活植物生长激素 ,有待于进一步证实 。
参考文献:
[ 1]魏林 , 梁志怀 ,罗赫荣.哈茨木霉发酵产物对豇豆萌发及苗
期生长的影响 [ J] .湖南农业科学 , 2004, 190(1):18-20.
[ 2]魏林 , 梁志怀 ,罗赫荣.哈茨木霉 T2-16发酵产物对水稻种子
活力的影响 [ J] .种子 , 2005, 24(11):4-6, 50.
[ 3]魏林 , 梁志怀 ,罗赫荣.哈茨木霉 T2-16代谢产物诱导豇豆幼
苗抗枯萎病研究 [ J] .湖南农业大学学报 , 2004, 30(5):
443-445.
[ 4]黄学韩.陈润政.电导法测定种子话力.种子生理实验手册
[ M] .北京:农业出版社 , 1990:93-95.
[ 5]孟焕文 , 程智慧 , 王龙.浸种时间和温度对豇豆种子物质外
渗及幼苗生长的影响 [ J] .西北农业大学学报 , 1997, 25
(1):49-53.
[ 6]胡伟民 , 胡晋 ,宋文坚 , 等.超干长期贮藏对不同类型水稻种
子生活力和活力的影响 [ J] .中国水稻科学 , 2003, 17(4):
379-382.
[ 7]刘厚成 , 邝炎华 , 陈日远.缺磷胁迫下长豇豆幼苗膜脂过氧
化及保护酶活性的变化 [ J] .园艺学报 , 2003, 30(3):215 -
217.
[ 8]李玉泉 , 宋占午 , 金祖荫.朱砂叶螨危害初期豇豆幼苗叶片
PPO、PAL及 POD的研究 [ J] .西北:师范大学学报 , 2003, 39
(3):61-67.
[ 9]陈禅友 , 汪汇东 , 丁毅.低温胁迫下长豇豆幼苗可溶性蛋白
质和细胞保护酶活性的变化 [ J] .园艺学报 , 2005, 32(5):
911-913.
[ 10]谢皓 ,陈学珍 , 钱宝玉 , 等.储藏年份对大豆种子活力及农
艺性状的影响 [ J] .北京农学院学报 , 2003, 18(4):281 -
284.
[ 11]王春台 ,刘学群 , 涂文忠.不同光质间断暗期对农垦 58s叶
片细胞膜透性及外渗液主要成分含量的影响 [ J] .华中农
业大学学报 , 1998, 17(2):105-110.
·49·
研究报告　　魏　林 等:哈茨木霉 T2-16发酵产物对豇豆种子细胞膜及细胞保护酶系统的影响