全 文 :由表 7可知,展望组合的试验结果数据稍优于第
8组。
3 结论
试验以 FRAP法测定酶解液 A595作为总抗氧化能
力指标,考察了 5种不同商业蛋白酶的酶解效果,最终
确定定 Multifect Neutral 细菌中性蛋白酶作为试验用
酶。试验选取 pH、加酶量、底物浓度和酶解时间 4个因
素为试验参数,进行正交试验和验证试验,得到酶法
制备蚕茧层抗氧化肽最优工艺条件:温度 60 ℃,pH
6.5,加酶量 10%(以底物质量计),底物浓度 3.3 g/100mL,
酶解时间 210 min。测得该条件下的水解液的总抗氧化
能力 A595为 1.795,水解度为 4.23 %,固形物含量为
9.15 mg/mL。
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收稿日期:2012-07-16
山竹壳总黄酮抗氧化及抑制亚硝化
作用研究
王晓波,李金芳,王梅,邹志辉,刘冬英,陈海珍
(广东药学院公共卫生学院,广东广州 510310)
摘 要:对山竹壳总黄酮的抗氧化作用及对亚硝化反应的抑制作用进行研究。采用超声辅助热水浸提的方法提取山
竹壳中的黄酮类化合物,以芦丁为标准物质来测定提取物的总黄酮含量,通过水杨酸法测定山竹壳总黄酮对羟自由
基的清除作用、邻苯三酚自氧化法测定山竹壳总黄酮对超氧阴离子自由基的清除作用,以评价山竹壳总黄酮的抗氧
化能力;并通过用分光光度法测定山竹壳总黄酮对亚硝酸盐的清除率和对亚硝胺合成的阻断率,以评价山竹壳总黄
酮对亚硝化反应的抑制能力。采用超声辅助热水浸提方法提取的山竹壳提取物中总黄酮的含量为 42.36 %,该类化合
物对羟自由基和超氧阴离子自由基具有一定的清除作用,随反应浓度增加清除率增大;在模拟人体胃液的条件下
(pH 3.0、温度 37℃),山竹壳总黄酮能有效地清除亚硝酸盐和阻断亚硝胺合成,随反应浓度增加清除率和阻断率增
大。山竹壳总黄酮具有一定的抗氧化作用及抑制亚硝化反应的作用。
关键词:山竹壳;总黄酮;抗氧化;抑制亚硝化反应
The Flavonoids Antioxidant and Inhibition Effect of Nitrosation from Mangosteen Shell
WANG Xiao-bo, LI Jin-fang, WANG Mei, ZOU Zhi-hui, LIU Dong-ying, CHEN Hai-zhen
(School of Public Health, Guang Dong Pharmacy College, Guangzhou 510310, Guangdong, China)
Abstract:The flavonoids frommangosteen shell antioxidant and the inhibitory effect of Nitrosation was studied. The
ultrasound-assisted extraction of hot water extraction method in the mangosteen hull flavonoids, rutin as the
食品研究与开发
Food Research And Development
2013年 3月
第 34卷第 6期
DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2013.06.003
作者简介:王晓波(1961—),女(汉),教授,硕士,研究方向:食物营养与天然物质功效成分。
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
基础研究
9
山竹壳一直作为泰国传统医药用于腹痛、腹泻、
痢疾、感染性创伤、化脓、慢性溃疡、白带、淋病等疾病
治疗[1]。近年许多研究人员对其进行了化学成分和生
物活性的研究,从中分离出几十种黄酮类化合物,活
性研究发现山竹具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化活性,抗菌
活性[2]。近年来大量的流行病学调查、动物实验及体外
实验研究结果表明,生物类黄酮具有广泛的抑癌和防
癌作用[3],亚硝胺是一类明确的化学致癌物,由其前体
仲胺和亚硝酸盐合成,尤其是在人和动物胃中更适于
合成亚硝胺能引起人体和动物的肝脏等多种器官的
恶性肿瘤 阻断或减少亚硝胺的生成是预防肿瘤发生
的一个重要措施。实验表明,植物中黄酮具有清除亚
硝酸盐、抑制亚硝胺合成的作用[4-5]。但是对于山竹壳
中黄酮对亚硝化反应的抑制作用未见研究报道,本实
验对山竹壳黄酮类化合物进行提取并对其抗氧化作
用及对亚硝化反应的抑制作用进行研究,为山竹壳的
进一步开发利用提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
山竹市售:去果肉。芦丁标准品:上海伯奥生物科
技有限公司;三羟甲基氨基甲烷、a-萘胺、焦性没食子
酸(AR);二甲胺、N-1-奈乙二胺盐酸盐:AR天津市科
密欧化学试剂有限公司;无水对氨基苯磺酸、水杨酸
等国产分析纯。
1.2 主要仪器
U-3010紫外可见分光光度计:日本株式会日本高
新技术那珂事业所;KQ-500E 超声波清洗器:昆山市
超声仪器有限公司;101-A数显电热鼓风干燥箱:上海
浦东荣丰科学仪器有限公司;RE-2000 旋转蒸发器:
上海亚荣生化仪器厂;SH2-D 循环水式真空泵:巩义
市予华仪器责任有限公司;Spectrum lab 22pc 可见分
光光度计:上海棱光技术有限公司;WFH-203紫外分
析仪:上海精科实业有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 山竹壳总黄酮提取及含量[6-7]
山竹果,去除果肉,清洗干净,电热恒温干燥箱
70 ℃干燥至恒重,粉碎机粉碎。称取 20 g山竹壳干粉
于 250 mL碘量瓶中,加入 80 %乙醇 200 mL,密塞摇
匀,在 70 ℃恒温中超声浸提 25 min,置于 70 ℃水浴
提取 1 h,过滤,滤渣重复提取 1次,收集滤液,用旋转
蒸发器蒸发浓缩,石油醚脱脂后在电热恒温鼓风干燥
箱 80 ℃干燥,得到山竹壳提取物。
1.3.2 芦丁标准曲线制定
采用亚硝酸铝比色法测定,精密称取芦丁对照品
40 mg,用 80 %乙醇溶液溶解并定容于 100 mL容量瓶
中。精确吸取 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于 10 mL
比色管中,加 5 %NaNO2溶液 0.3 mL,放置 6 min,加
10 % Al(NO3)3溶液 0.3 mL,放置 6 min,加 4 %NaOH
溶液 4.0 mL,加水至刻度,摇匀,放置 15 min,在确定的
测定波长处测吸光值,建立回归方程。
1.3.3 山竹壳提取物中总黄酮含量的计算
提取物中黄酮含量=(C×V×稀释倍数)/m × 100 %
式中:C 为处理后求得的山竹壳总黄酮的浓
度,(mg/mL);V为提取液体积,mL;m 为所称取山竹
壳提取物的质量,g。
1.3.4 山竹壳总黄酮抗氧化作用的测定
1.3.4.1 对羟自由基的清除作用[8-9]
按照 Fenton反应的方法建立反应体系模型,利用
H2O2与 Fe2+混合产生·OH,水杨酸捕捉·OH,并产生有
standard material to determine the total flavonoid content of extract, through the salicylic acid method of total
flavonoids ofmangosteen shell on hydroxyl radical scavenging,pyrogallol autoxidationmethod for the determination
of total flavonoids of mangosteen shell scavenging superoxide anion radical to evaluate the mangosteen shell
flavonoids antioxidant and determined by spectrophotometry of total flavonoids nitrate removal rate and blocking
rate of nitrosamine to evaluate the mangosteen shell flavonoids on the ability to inhibit nitrosation reactions. The hot
water extraction method of ultrasonic assisted extraction of the mangosteen shell extract the content of total
flavonoids 42.36 %, of such compounds on hydroxyl radicals and superoxide anion radical scavenging effect has a
certain, with the clearance rate of increase in the concentration response increased; in simulated conditions of
human gastric juice (pH3.0, temperature 37 ℃), flavonoids of mangosteen shell can effectively block the removal
of nitrite and nitrosamine synthesis, with the reaction concentration increased scavenging and blocking rate
increasing. The total flavonoids ofmangosteen shell has a certain antioxidant and role ofNitrosationmechanism.
Key words:Mangosteen shell; total flavonoids; antioxidant; inhibition of Nitrosation
王晓波,等:山竹壳总黄酮抗氧化及抑制亚硝化作用研究 基础研究
10
色产物,该产物在 510 nm处有强吸收。在 10 mL具
塞试管中加入 1 mL 9 mmol/L FeSO4,1 mL 9 mmol/L水
杨酸-乙醇溶液,1 mL样品溶液(浓度 1 mg/mL),混匀
后,加入 1 mL 8 .8 mmol/L H2O2启动反应,用蒸馏水定
容至 10 mL,摇匀静置 10 min后在 510 nm处测定其吸
光度 A值,以同浓度的样品溶液为对照品,计算清除
率。
清除率:S =(A0 - AX)/A0 × 100 %
式中:A0为空白对照吸光度;Ax 为加入被测物
后吸光度。
1.3.4.2 对超氧阴离子自由基的清除作用[10-11]
采用邻苯三酚自氧化法。在 10 mL比色管中加入
pH= 8.2 Tris-HCl 缓冲溶液 2.0 mL 和二次蒸馏水
7.0 mL,于 25℃恒温 20 min后加入 1.0 mL 25℃预热
过的 5 mmol/L邻苯三酚(对照管用 10 mmol/L盐酸代
替),迅速摇匀,立即倾入光径 1 cm比色杯中,在波长
420 nm处每 0.5 min测定 1次吸光度 A0,共测 4 min。
计算邻苯三酚自氧化管吸光度值随时间的变化率△A0。
样品测定:加入 1 mL样品溶液(浓度 1 mg/mL),
相应减少同体积水,其余同邻苯三酚自氧化,测定加
样后自氧化速率 △A1。
清除超氧阴离子能力计算公式:
清除率 =(△A0 - △A1)/ A0 × 100 %
式中:△A0为邻苯三酚自氧化速率;△A1为加样后
邻苯三酚自氧化速率。
1.3.5 模拟人体胃液条件下亚硝酸盐清除率的测定
1.3.5.1 亚硝酸钠标准曲线的建立[12]
分别吸取 0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.0、1.5、2.0、
2.5 mL亚硝酸钠标准使用液 (相当于 0、1、2、3、4、5、
7.5、10、12.5 μg亚硝酸钠),置于 25 mL比色管中,各
加入 pH 3.0 的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液 2 mL,在
37 ℃ 水浴 1 h,取出,立即加入 0.4 %对氨基苯磺酸
2.0 mL混匀,静置 3 min~5 min,后各加 1.0 mL 0.2 %盐
酸萘乙二胺溶液,加水至刻度混匀,静置 15 min,在
538 nm下测定吸光度,建立回归方程。
1.3.5.2 不同反应浓度的亚硝酸盐清除率测定
pH 3.0的柠檬酸 -磷酸氢二钠缓冲液 2.0 mL,分
别加入不同浓度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL)的样
液 1.0 mL,5 μg/mL 的亚硝酸钠标液 2.0 mL 于 25 mL
比色管中,在 37℃水浴 1 h,取出,立即加入 0.4 %对氨
基苯磺酸 2.0 mL,混匀,静置 3 min~5 min,后各加
1.0 mL 0.2 %盐酸萘乙二胺溶液。加水至刻度混匀,静
置 15 min,以同浓度的样品溶液做对照,在 538 nm下
测定吸光度,同时用 VC做对照实验。在标准曲线上查
出亚硝酸钠的残留量(μg/mL)。
亚硝酸盐清除率 =(N 空 - N 残)/ N 空 × 100 %
式中:N 空为空白管的亚硝酸钠残留量,(μg/mL);
N 残为样品管的亚硝酸钠残留量,(μg/mL)。
1.3.5.3 不同反应时间的亚硝酸盐清除率测定
pH3.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液 2.0 mL,分别
加入 0.2 mg/mL的样式液 1.0 mL,5 μg/mL的亚硝酸钠
标液 1.0 mL于 25 mL比色管中,分别放置 37 %水溶
20、40、60、80、100 min,取出后按照 1.3.5.2方法计算清
除率。
1.3.6 模拟人体胃液条件下不同反应浓度对亚硝胺合
成阻断率的测定[13-14]
1.3.6.1 不同反应浓度的亚硝胺合成阻断率测定
分别吸取不同浓度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL)
的样液 1.0 mL于 25 mL比色管中。加入 pH 3.0的柠
檬酸 -磷酸氢二钠缓冲液 10.0 mL,1 mmol/L 的
NaNO2溶液 1.0 mL,1 mmol/L 的二甲胺溶液 1.0 mL,
用蒸馏水稀释至刻度,在 37 ℃下恒温 1 h。用移液管
吸取 1.0 mL上述溶液加到 50 mL小烧杯中,加入质
量分数 0.5 %Na2CO3溶液 0.5 mL,于紫外分析仪上照
15 min。取出后加入质量分数 1 %对氨基苯磺酸
1.5 mL,再加入质量分数 0.1 %α-萘胺 1.5 mL,蒸馏
水 0.5 mL,摇匀静置 15 min。用分光光度计在确定的
最大吸收波长 525 nm处测吸光度。同时用 VC做对照
实验。计算阻断率。
阻断率 =(A0 - Ai)/A0 × 100 %
式中:A0为未加样液时的吸光度值(以试剂空白
溶液为参比溶液);Ai为加入样液后的吸光度值(以同
浓度样液为参比溶液)。
1.3.6.2 不同反应时间的亚硝胺合成阻断率测定
吸取 0.5 mg/mL 的样液 1.0 mL 于 25 mL 比色管
中。加入 pH3.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液 10.0 mL,
1 mmol/L的 NaNO2溶液 1.0 mL,1 mmol/L的二甲胺溶
液 1.0 mL,用蒸馏水稀释至刻度,在 37 ℃下分别恒温
20、40、60、80、100 min。用移液管吸取 1.0 mL上述溶液
按照 1.3.6.1方法计算阻断率。
2 结果与分析
2.1 山竹壳提取物中总黄酮的含量
芦丁标准曲线的制备:以芦丁标液浓度为横坐
标,吸光度值为纵坐标作 x关于 y的函数图像,所得图
像为一次函数图像(如图 1所示)。将所得数据做回归
处理,得其相关的回归方程,y=11.557x + 0.000 2,R2=
0.999 7,在 0~0.04 mg/mL范围内呈良好的线性关系。
王晓波,等:山竹壳总黄酮抗氧化及抑制亚硝化作用研究基础研究
11
按照 1.3.1 方法测得提取物中总黄酮的吸光度
0.245,于标准曲线查得其浓度 0.021 18 mg/mL,通过
1.3.3中的公式计算得出山竹壳提取物中总黄酮的含
量为 42.36 %。
2.2 山竹壳总黄酮的抗氧化作用
山竹壳总黄酮对羟自由基、超氧阴离子的清除作
用结果见表 1。
表 1结果表明,山竹壳总黄酮对羟自由基、超氧阴
离子自由基具有一定的清除作用,其清除能力弱于
VC,稍弱于芦丁。山竹壳总黄酮对自由基的清除羟自由
基的清除大于超氧阴离子,且与浓度呈现正相关,这
可能与黄酮类化合物上存在酚羟基活性基团,通过酚
羟基与自由基反应形成稳定半醌式自由基发挥清除
自由基抗氧化作用,而且不同的黄酮类化合物对不同
自由基的作用存在一定的选择性有关[15]。
2.3 山竹壳总黄酮对亚硝化反应的抑制作用
2.3.1 模拟人体胃液条件下亚硝酸盐清除率
2.3.1.1 亚硝酸钠标准曲线
以亚硝酸钠含量为横坐标 x,吸光度值为纵坐标
y,做一次函数图像(见图 2),将所得数据做回归处理,
得其相关的回归方程,y=0.0289x+ 0.002 4,R2= 0.999 6,在
0~12.5 μg范围内呈良好的线性关系。
2.3.1.2 不同反应浓度的亚硝酸盐清除率
按照 1.3.5.1公式计算处理数据,不同浓度的 VC
和山竹壳总黄酮对亚硝酸盐的清除作用结果见图 3。
由图 3可知,山竹壳总黄酮对亚硝酸盐具有清除
作用,且清除率在实验浓度的范围内随浓度增加而增
加,起始增幅较大,后来增幅缓慢。当山竹壳总黄酮的
浓度为 0.3 mg/mL时,对亚硝酸盐的清除率为 64.65 %,
与同等条件下浓度为 0.5 mg/mL VC的清除率相当,当
山竹壳总黄酮的浓度为 0.5 mg/mL时,对亚硝酸盐的
清除率可达 69.92 %,大于同等条件下 VC对亚硝酸盐
的清除率。说明在模拟人体胃液条件下,山竹壳总黄
酮能有效地清除亚硝酸盐,其清除亚硝酸盐的能力略
优于 VC。
2.3.2 模拟人体胃液条件下亚硝胺合成阻断率
根据 1.3.6计算处理数据,不同浓度的 VC和山竹
壳总黄酮对亚硝胺合成的的阻断作用结果见图4。
由图 4可知,山竹壳总黄酮对亚硝胺合成具有阻
断作用,阻断率在实验浓度的范围内随浓度增加而增
加。当山竹壳总黄酮的浓度为 0.6 mg/mL时,对亚硝
胺合成的阻断率为 53.72 %,与同等条件下浓度为
1.0 mg/mL VC的阻断率相当,当山竹壳总黄酮的浓度
为 1.0 mg/mL时,对亚硝胺合成的阻断率可达 66.12 %,
大于同等条件下 VC对亚硝酸盐的清除率。说明在模拟
人体胃液条件下,山竹壳总黄酮能有效地阻断亚硝胺
图 2 亚硝酸钠标准曲线
Fig.2 Standard curve of the sodium nitrite
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0
0 5 10 15
亚硝酸钠含量/μg
吸
光
度
A
y = 0.028 9x + 0.002 4
R2 = 0.999 6
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0 0.1 0.2 0.60.3
浓度/(mg/mL)
清
除
率
/%
0.4 0.5
VC
山竹总黄酮
图 3 不同浓度 VC和山竹壳总黄酮对亚硝酸盐清除率的影响
Fig.3 Effects of different concentration Mangosteen shell total
flavonoids and VC on the scavenging rates of nitrate
表 1 山竹壳总黄酮对自由基清除能力
Table 1 Radical scavenging rate of total flavonoids in
Mangosteen shell
VC 0.259 7 0.151 6
芦丁 0.585 9 1.430 3
山竹壳黄酮 0.857 6 3.337 6
羟自由基 超氧阴离子
项目
IC50浓度/(mg/mL)
王晓波,等:山竹壳总黄酮抗氧化及抑制亚硝化作用研究 基础研究
图 1 芦丁标准曲线
Fig.1 Standard curve of the rutin
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0
0 0.01 0.02 0.050.03
芦丁标液浓度/(mg/mL)
吸
光
度
A
0.04
y = 11.577x + 0.000 2
R2 = 0.999 7
12
图 4 不同反应浓度 VC和山竹壳总黄酮对亚硝胺合成阻断率的影响
Fig.4 Effects of different concentration Mangosteen shell total
flavonoids and VC on the blocking rate of nitrosamines synthesis
70
60
50
40
30
20
10
0
0 0.2 0.4 1.20.6
浓度/(mg/mL)
阻
断
率
/%
0.8 1.0
VC
山竹总黄酮
合成,且与浓度呈现正相关,其阻断亚硝胺合成的能
力略优于 VC。其作用机理可能与清除亚硝酸盐有关,
由于亚硝酸盐是合成亚硝胺的前体物质,因此清除亚
硝酸盐可以间接减少亚硝胺的合成。
3 结论
3.1 山竹壳总黄酮的含量
本实验使用超声辅助乙醇浸提法对山竹壳总黄
酮进行提取。以 80%乙醇为提取液,料液比为 1 ∶10(g/mL),
提取 2次,并经石油醚脱脂,该条件下提取出的山竹壳
提取物中黄酮类化合物的含量为 42.36 %。
3.2 山竹壳总黄酮的抗氧化作用
山竹壳总黄酮对羟自由基和超氧阴离子自由基
具有一定的清除作用,且在实验的浓度范围呈现出良
好的量效关系,随着浓度增加清除率增大。其清除羟
自由基和清除超氧阴离子自由基的能力弱于 VC,稍弱
于芦丁。结果表明,山竹壳总黄酮具有一定的抗氧化
作用,且属天然产物,因此在抗氧化剂的方面具有潜
在的开发利用价值。
3.3 山竹壳总黄酮对亚硝化反应的抑制作用
在模拟人体胃液的条件下(pH 3.0、温度 37 ℃),
山竹壳总黄酮能有效地清除亚硝酸盐和阻断亚硝胺
合成,具有剂量-反应关系,且能力略优于 VC。
本实验研究结果表明山竹壳提取的总黄酮对羟
自由基、超氧阴离子自由基具有清除作用,其清除能
力弱于 VC,并能有效地清除亚硝酸盐和阻断亚硝胺的
合成,清除体内亚硝酸盐和阻断亚硝胺的合成是防治
癌症的有效途径,因此,进一步研究山竹壳的有效成
分及其功能,将对有效防治癌症具有一定的价值,同
时将山竹壳变废为宝,为资源循环利用和山竹进一步
开发利用起促进作用。
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收稿日期:2012-08-20
王晓波,等:山竹壳总黄酮抗氧化及抑制亚硝化作用研究基础研究
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