全 文 ：第 7卷第 6 期
199 1年 1 2月
生 物 化 学 杂 志 Vo l. 7,
C h i n e s 6 B i o e h e m i e a l J O u r n a l D e e
N o
.
6
1 9 9 1
南鹤虱凝集素的研究
刘 毅 . 王 雾 陈惠民
( 山东大学 生物系 , 济南 2 5 0 1 0 0 )
摘要 本文对伞形科 16 种植物 (药用部令 ) 是否存在凝某素进行 了筛选 。 发现野胡
萝卜果 实与芹菜果实 中有凝集素 。 野 胡萝 卜果 实 ( 中药名称南鹤虱 ) 抽提液 的凝血
活性较芹茱孩 。
采用CM一纤维素及D E A E一纤维紊对南鹤虱凝集素进行分离纯化 。 用采丙烯耽按
凝胶 电泳鉴定其纯度 。 用 SD S一采丙烯耽胺凝胶 电泳浏定亚基分子量为32 6 0 0 。
此凝集素对热及酸较稳定 , 对碱略差 。 对人的 A 、 B 、 0 血 型 无专一性 。 能凝
集无 、 小鼠 、 牛及鸡的血 , 但不凝某蟾涂的血 。
此凝某素的凝血活性能被 D一木糖及 N 一乙统荀萄糖胺径微地抑制 。
经 hs if f 试荆检 .mJ 表明南鹤虱凝集素为一格蛋白 。 格含 量 为 3 . 4% 。 此凝集素
分子 中的谷氮破门冬氛酸 、 精氛耽及练氮酸的含童较高。
关锐词 : 凝集素 , 玲胡萝卜 , 南鹤虱
从蓖蔗籽提取液首次发现具有凝集红血球的现象至今已有一个世纪 。 已检测的近三千种
植物抽提液中 , 有凝血活性的近千种 , 其中约 70 %是豆科植物 【` ’ 2」 。
本文对伞形科植物药用部分进行了凝集素的筛选 。在筛选中发现野胡萝 卜 D a uc us 。 。 r ot 。
L
.
( W il d ca r ot )果实 (种子 , 中药名称南鹤虱 ) 抽提液凝血活性较高 。 对该凝集素进 行 了
分离纯化及其部分性质的测试 。 并定名为 W il d ca r or t eL ct in ( w C )L 南鹤虱凝集素 。
材 料 与 方 法
一 、 材料
本实验所用植物材料 , 除芹菜 、 胡萝 卜及芫姿的种子购自山东省农科院蔬菜所外 , 其余
均购自济南建联中药材店及济南市药材公司 。
二 、 方法
1
. 伞形科植物药用部分凝集素的筛选
份 8 7届硕士生
收稿 日期 : 1 9 9 0 0 9一 0 3 , 修回 日期 : 1 9 9 1一 0 1一 l a
6 7 9
DOI : 10. 13865 /j . cnki . cj bmb. 1991. 06. 008
( 1) 粗提液的制备 : 采用下列16 种植物: 小窗香 (人药部分成熟果卖) 、 川肯 (人药部
分为根状茎 ) 、 奚本 (根及根状茎 ) 、 白芷 (根 ) 、 当归 (根 ) 、 独活 (根 ) 、南鹤虱 (野 胡 萝
卜果实 ) 、 胡萝 卜 (果实 ) 、 北沙参 (根 ) 、 防风 (根 ) 、 羌活 (根状茎 ) 、芫姿 (果实 ) 、 柴胡
(根 ) 、前胡 (根 ) 、蛇床子 (果实 ) 、 芹菜 (果实 ) 、 (以上材料 , 其中芫姿为果实及全草人
药 , 本文仅做了果实 。 芹菜测试的亦为果实 , 草药中芹菜以根及茎人药 ) 。 取上述各种植物
药 用部 分 2 9 , 分别加 p B s ( 0 . 0 7 5m o l / L 磷酸盐缓冲液等量的 0 . 0 7 5m o l / L N a C I , PH 7 . 2 )
浸泡至软 , 磨成匀浆 , 挤滤后滤液离心 ( 1 2 0 0 0 rP 二 ) 3 nI in , 得清液 。 以 清液测定凝血活
性 。
(2 ) 血球处理及活性测定 21[ : 人 A B O 型红血球由济南市中心医院血库惠赠 。
2
. 南鹤虱粗提液中凝集素基本性质的初步测定
( 1) 经筛选南鹤虱凝集素具有较高的凝血活性 , 为了排除中草药中裸酸等类化合物引起
的非特异性凝集 , 采用卵清蛋 白溶液与南鹤虱浸提液混匀 (必要时再采用酪蛋白溶液与抽提
液混合 ) , 如出现沉淀 , 则说明抽提液与红细胞的凝集有可能是杖酸引起的 , 如未出现沉淀
则凝集素的分离纯化等工作继续进行 。
(2 ) w c L 粗提液糖结合专一性的初步测定 : 方法参照文献 【2] , 所用的糖 有 D一葡 萄 搪
( S E R V A产品 ) N一乙酞葡萄糖胺 (上海试剂二厂产品 ) N一乙酸半乳糖胺 ( sI G M A 产品 ) 、
D一半乳糖 (上海试剂二 厂产品 ) 、 L 一岩藻搪 ( s E R v A产品 ) 、 D一甘露搪 (B D H产品 ) 、 D -
木糖 ( E . M E R C K 产品 ) 等。
(3 ) W c L 血型专一性及供血动物专一性的测定 : 方法同上 。
(4 ) 温度敏感性的测定 : 分别取粗提液 3m L于 5 个 10 m L小三角瓶中加盖 。 分别在 4℃ 、
15 ℃ 、 38 ℃ 、 60 ℃ 、 80 ℃水浴中 , 计时 5 、 45 、 90 m in 及 1h2 , 分别取出一滴在凹玻片上测凝
血活性 , 以兔血作血球悬液 , 显微镜下观察结果 。
(5 ) 对酸碱稳定性的测定 : 在四个小三角璃中各加 l . s m L 南 鹤 虱无盐抽提液 。 分别在
此四个小三角璃中加 P H Z . 0 , 1 . 8 % N a C I溶液及 P H 6 . 0 、 8 . 0 、 1 0 . 0 的 0 . 1 5m o l / L 磷酸盐缓
冲液 (P H 10 . 0的参照文献 8[] , 磷酸氢二钠液 , 以氢氧化钠调至 P H 10) 各 1 . s m L 室温下分别
于 l 、 3 、 1 2 、 2 4 h 其测定凝血活性 。
3
. 南鹤虱凝集素的分离纯化
( 1) 离子交换层析法分离化南鹤虱凝集素 : 采用 c M 一纤维素 32 及 D E A E 纤维素 32( 上海
化学试剂站分装厂 , w ha f m an 进口分装 ) 进行交换层析 。
将南鹤虱抽提液用 0 . 80 饱 和 度的硫酸铁沉淀 , 离心 , 透析 。 然后上已处理并平衡好的
C M一纤维素柱 。 经同一平衡液洗柱 , 然后依次用 0 . 16 m ol / L 、 0 . 3 nI ol / L 、 及 0 . 50 m ol / L 抓化
钠液梯度洗脱 。 紫外分析检测仪监测 , 部分收集器收集 , 并测定各洗脱峰的凝血活性 。
活性检测结果表明有凝集活性部分直接自 CM一纤维素柱流出 , 未被交换 。 将此 部 分 再
上处理好并平衡好的 D E A E一纤维素柱 , 先用同一平衡 缓 冲 液 洗 柱 , 然 后 用 0 . 16 m ol / L 、
0
.
3 m ol / L 0
.
s m ol / L N
o a 洗脱 , 同时检侧各洗脱峰的凝血活性 。
(2 ) 南鹤虱凝集素的纯度鉴定 : 采用聚丙烯酞胺凝胶电泳 .4[ ` ]鉴定所得到的上述冻干样
品的纯度 。
3
. 性质
(1 ) 搪蛋白的检测 : 从上述 P A C E实验得到的电泳胶条用过碘酸一 sc h i f f 试 剂 进 行 染
6 80
色 『. 1 。
(2 ) 糖含量测定 : 采用苯酚硫酸法进行中性馆含量测定 t,] 。
(3 ) 氨基酸组成分析 : 样品水解后用 日立 8 35 型高速氨基酸分析仪进行分析 。
(4 ) 亚基分子量测定 : 采用 S D S一聚丙烯酞胺凝胶电泳 t’. ` ]测定 W C L亚基分子最。
(5 ) 南鹤虱凝集素对细胞凝集的切步观察 : 观察 W C L对 小白鼠 、 兔 、 鸡的骨位细胞 、
脾细胞及附皋组织精细胞的凝集情况 。
骨髓细胞悬液的制备 : 采上述动物股骨 , 用生理盐水将骨位冲出 , 细胞过滤器过滤 , 撼
液经 50 r/ m in 离心 l m in , P B S 缓冲液洗三次 , 配成 2%细胞悬液 。
脾细胞 、 精细胞悬液制备 : 取少量新鲜脾组织及附皋组织 , 用 P B S 洗 去 血 污 , 仔细剪
碎 , 用 P B s 制成匀浆 , 细胞过滤器过滤 , 滤液在 5 0 0 r / m in 离心 l m in , 用 P B s 洗 涤 三 次 ,
配成 2%细胞悬液备用 。
将 W C L 分别滴加到上述三种动物的三类细胞悬液中 , 方法同血凝测定 [” , 用肉眼并用
显微镜观察结果 。
结 果 与 讨 论
一 、 伞形科植物药用那分报集案筛选结果
见 T a b l e l 。
从 T a lb e l 可看到 , 经筛选只有南鹤虱及芹菜种子抽提液有凝血活性 , 而芹菜种子抽提
液的活性较弱 。
T a b l e 1 H e m a g g l u 七i n a七i n g A e七i v i t y o f S o m e P l a n 七5 f r o m C a r r o七 F a m i l y
( U m b e l l i f e r a e )
P l a n 七s O r g a n 日 f o r a s s a y A g g l u t i n a t i n g 七i七l e .
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D a n y u s e a r o 七a L . ( W i l d C a r r o 七) ( s e e d ) f r u i t
D a u e u s e a r o 七a v a r . 日 a七i v a D C . ( C a r r o t ) ( s e e d ) f r u i七
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C o r i a n d e u m s a七i v u m L . f r u i t
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b l o o d e e l l s
68 1
立 、 南鹅虱抽提液中梁集案签本性质的初步侧定结果
1
. 测定南鹤虱抽提液中凝集素糖结合专一性的结果 , 在所用的七种搪中并未测得其中
任何一种糖对此凝集素活性产生抑制 。
2
. 血型专一性及供血动物专一性测得结果 , 对人的 A 、 B 、 O 血 型 的凝集没有差别 ,
皆为 2 , 。 在供血动物方面 , 南鹤虱抽提液对兔红血球凝集活性最强 , 效价 为 2。 , 对小 白 鼠
血次之为 2“ , 对牛血及鸡血的凝集为 2’ , 对婚躲血不凝 。
3
. 温度对南鹤虱凝集素抽提液凝血活性影响见 T ab le Z 。
4
.
W C L 粗提液对酸碱稳定性测定结果如 aT b le 3 所示 。
T a b l e 2 I n f l u e n e e o f 七e m P e r a七u r e
o n t h e h e m a g g l u t i n a七i n g a e t i v i七y
o f e r u d e e x 七r a e七 o f W i l d C a r r o t
T a b l e 3 S t a b i l i t y o f W C L ( C
r u d e
e x t r a e t ) a七 d i f f e r e n 七 P H
4℃ 1 5℃ 3 8℃ 60℃ 8 0℃
5 m i n + + +
p H Z P H 6 P H S P H 10
6 l h +
+ + +
3h + +
+ +
4 5
9 0
7 2 0 m i n + +
12 n + + + 土
2 4 h + + + ~
. . . . . . . . . . . 口 . . . .
三 、 W C L 的分离纯化
经 CM一纤维素柱 , 活性物质直接流出 , 部分杂质交换在柱上。 通过 D E人 E一纤维 素柱 ,
洗脱曲线见 iF g . 1 。
翻卜甘T护.的习公目p,动,.留
2
招区“ . t .
F 19
.
1 I o n
一 e x e h a n g e e h r o m a七o g r a p h v o f W C L o n D E A E 一 C e l l u l o s e 3 2
1 0
.
1 6m o l / L N a C I
2 0
.
3 3m o l / L N a C I
“ … … ” h e m a g g l u t i n a七i n g a e t iv i t y
6 82
所得纯化制品经聚丙烯酞胺凝胶电泳结果见叭 9 . 2一 A。 从 F坛 . 2一 A可见经纯化 的 w CL
表现为电泳均一的制品 。
四 、 W C L性质
1
. 搪蛋白检测 : PA G E 电泳条用 S ch i“ 试剂染色结果见 iF g . 2一 B 。
2
. 经苯酚硫酸法测得样品的中性糖含量为 3 . 4 %。
3
.
W C L 的氨基酸组成见 T a b l e 4。
从 aT bl ” 4可以看到 W c L 中谷氨酸的含量最高 , 其它氨基酸含量和大多数植物凝 集 素
很近似 。 脯氨酸含量 为 5 . 4 % , 属糖蛋白中氨
基酸含量恒定的一类 8[] 。
4
.
S D S一聚丙烯酞胺凝胶电泳测 得 亚 基
表观分子量约为 3 2 0 0 0 。 如 F i g . 2一 C . D及 T a b l e s
所示 。
T a b l e 4 A m i n o a e i d e o m P o s i t i o n o f
W C L
R
e s i d u e s % R e s id u o s %
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F 19
.
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r a g o v a l u e ) 二 3 2 6 0 0
5
. 采用已纯化的 W C L再次进行糖结合专一性实验 , 结果见 aT lb e 6 。
从 aT lb e 6 可 以看到 , 南鹤虱凝集素的半抗原抑制试验并未从九种糖中找到一种抑制力
强的专一性糖 , 只有木糖及 N一乙酞葡萄搪胺具有弱抑制 。 由于尚未测试其它糖 , 再者 凝 染
素的糖结合专一性不仅是有对糖的种类专一性 , 还存在异头结构专一性及搪昔键专一性 〔2’ ,
6 8 3
以及某种寡精或某种搪蛋白 ` , , 为较强的抑制剂 。 有待进一步追究。
6
.
w C L 凝集细胞的初步观察 : 经测试 , w c L 能 凝集兔及小白鼠的精细胞 、 脾细胞及
骨位细胞 , 但对鸡的这三类细胞都不发生凝集 。 凝集情况见 iF g . 3一 4 。
T a b l e 6 I n h i b i七i o n o n h e m a g g l u 七i n a t i n g a e t i v i七v o f W C L b y d i f f e r e n t 日 u g a r s
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P r e s s
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S t u d i e s o n L e e t i n f r o m W i l d C a r
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A b s t r a c t T h e Ph y t o a g g l u t i n i n i n 1 6 s P e e i e s f r o m C a r r o t
W e r e
s e r e e n e d
.
L e e t i n s
A P i u m L
.
( C e l e r y )
w e r e f o u n d i n t h e f r u i t o f D a u e u s
F a m i l i e S
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w a s s t r o n g e r
t h a t o f A P i u m L
.
W i ld e a r r o t I e e t i n W a S i s o l a t e d a n d P u r i f i e d b y e h r o m a t o g r a P h y o n CM一 e e l l u l o s e
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T h e
D E A E一 e e l l u l o s e
.
T h e Pu r i t y W a S i d e n t i f i e d b y P o l y a e r y l a m i d e g e l e l e e t r o P h o r e s i s
.
s u b u n i t m o l e e u l a r w e i g h t w a s d e t e r m i n e d a s 3 2 6 0 0 b y S D S一P A G E
·
T h i s l e e t i n 15 s t a b l e t o h e a t a n d a e id
,
b u t n o t t o a lk a l i
.
I t h a s n o s P e e i f i e i t y t o
h u m a n b l o o d t y P e s
.
I t e a n a g g l u t i n a t e r a b b i t
, m o u s e , e a t t l e a n d e h i e k e n e r y t h r o e y t e s
,
b u t n o t t o a d e r y t h r o e y t e
.
T h e a e t i v i t y o f t h e l e e t i n e a n b e s l i g h t l y i n h i b i t e d b y D一 x y l o s e a n d N 一 a e e t y l g l -
U C O S a 刃以 I n e 。
T h i s l e e t i n w a s id e n t i f i e d t o b e a k i n d o f g l y e o P r o t e i n w h i e h e a n b e s t a i n e d b y
s h i f f
, 5 r e a g e n t o n
l e e t i n e o n t a i n s l a r g e
t h e P o l y a e r y l a m i d e g e l
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K e y w o rd s : L e c t i n , D a n c u s e a r o t a L , W i ld e a r r o t