全 文 ：DOI:10． 3724 /SP． J． 1096． 2010． 01492
基质辅助激光解吸附飞行时间质谱方法分析
山竹果皮缩合单宁
周海超 魏淑东 李 敏 林益明*
(厦门大学生命科学学院滨海湿地生态系统教育部重点实验室，厦门 361005)
摘 要 在反射模式(Reflectron modes)下，去离子处理后，引入 Cs +(CsCl，1． 52 g /L)作为阳离子化试剂，得
到清晰的山竹果皮缩合单宁的 MALDI-TOF质谱图。解析该质谱图能得到完整的山竹果皮缩合单宁的结构信
息:山竹果皮缩合单宁是从三聚体(m/z 999)到十一聚体(m/z 3303)分布的多聚物，离子峰最强的为五聚体
(m/z 1575) ;同时存在 3 种结构单元:(表)儿茶素(C /EC)、(表)棓儿茶素(GC /EGC)和(表)阿福豆素(AC /
EAC) ，且 C /EC、AC /EAC和 GC /EGC的离子峰强度依次降低，同时在四聚体(m/z 1440)到七聚体(m/z 2303)
均存在棓酰基;从四聚体(m/z 1285)到八聚体(m/z 2436) ，不同的聚合物中普遍存在 A型连接。本研究优化
了获取植物缩合单宁结构信息的基质辅助激光解吸附飞行时间质谱方法。
关键词 山竹果皮;缩合单宁;基质辅助激光解吸附飞行时间质谱;阳离子化试剂;多聚物
2010-02-26 收稿;2010-06-12 接受
本文系教育部新世纪优秀人才支持计划(No． NCET-07-0725)和留学回国人员基金资助项目
* E-mail:linym@ xmu． edu． cn
1 引 言
缩合单宁(Condensed tannins) ，也称原花色素(Proanthocyanidins) ，广泛存在于植物界，主要由黄烷-
3-醇结构单元缩合而成。按结构单元 B 环上羟基数目及取代位置的不同，缩合单宁主要可以分为以
(表)儿茶素(C /EC)为基本结构单元的原花青定(Procyanidin)、以(表)棓儿茶素(GC /EGC)为基本结
构单元的原翠雀定(Prodelphinidin)和以(表)阿福豆素(AC /EAC)为基本结构单元的原天竺葵定(Pro-
pelargonidin)［1］，有些结构单元上还可能存在糖基化和酰化形式。各个结构单元之间通常通过 C4-C8
或 C4-C6 连接，形成 B型连接的缩合单宁聚合物;有些结构单元间还可通过醚键相连，形成 A型连接方
式(图解 1)。结构特征影响缩合单宁的生物活性和化学性质，包括结构单元类型、聚合度和结构单元的
空间构型［2］。
近年来，基质辅助激光解吸附飞行时间质谱(MALDI-TOF)作为软离子化质谱技术被广泛用于植物
缩合单宁的分析［3，4］。MALDI-TOF质谱能直接给出缩合单宁中分子质量不同的聚合物的分子离子峰，
适用于缩合单宁基本结构单元、聚合度和连接方式的分析及其抗氧化活性与结构关系的研究［5 ～ 7］。然
而，一些影响 MALDI-TOF质谱得到完整可靠的缩合单宁信息的因素(如样品去离子化处理及阳离子试
剂的选择)已引起关注［3，8，9］。但不少研究工作并未重视这些影响［4，10，11］，从而可能导致得到缩合单宁
信息或不完整或不准确。本研究在反射模式下，对样品和基质去离子处理，引入 Cs +作为阳离子化试
剂，以期获得完整可靠的山竹果皮缩合单宁的 MALDI-TOF质谱信息。本研究为准确获取植物缩合单宁
结构信息提供了一种优化的基质辅助激光解吸附飞行时间质谱方法。
2 实验部分
2． 1 仪器、试剂和样品
Bruker Reflex III基质辅助激光解吸附飞行时间质谱仪(德国 Bruker公司) ;SHZ-IIIB循环水真空泵
(上海仪表供销公司) ;SENCO旋转蒸发仪(上海申科科技有限公司) ;FD-1 冷冻干燥机(北京德天佑科
技发展有限公司)。Amberlite IRP-64 离子交换树脂(美国 Sigma 公司) ;2，5-二羟基苯甲酸(DHB，美国
Sigma公司) ;CsCl (纯度≥99． 5%，国药集团化学试剂有限公司) ;Sephadex LH-20 色谱填料(美国
第 38 卷
2010 年 10 月
分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究简报
Chinese Journal of Analytical Chemistry
第 10 期
1492 ～ 1496
图解 1 缩合单宁的结构单元及其连接方式
Scheme 1 Structural units and types of linkages of condensed tannins
Amersham公司) ;丙酮、甲醇和正己烷等均为分析纯;实验用水为二次去离子水。山竹(Garcinia
mangostana L．)果皮。
2． 2 样品处理
山竹果实，2008 年 6 月份购于当地超市，取果皮用蒸馏水清洗后迅速用 70%丙酮溶液提取 3 次。
收集并合并提取液，在 40 ℃旋转减压蒸发除去丙酮。含有缩合单宁的水相用正己烷和二氯甲烷分别萃
取 3 次，将水相冷冻干燥获得山竹果皮缩合单宁粗提物。粗提物用少量 50%甲醇溶解，以 Sephadex
LH-20 纯化，得到缩合单宁纯化物［10］。纯化样品冻干后进行 MALDI-TOF分析。
2． 3 样品分析
参考文献［9］，本研究采用如下条件:氮激光波长 337 nm，激光脉冲宽度 3 ns;反射模式，加速电压
20． 0 kV，反射电压 23． 0 kV;以 AngiotensinⅡ(MW 1046． 5) ，Bombesin (MW 1619． 8) ，ACTHclip18 ～ 39
(MW 2465． 2)和 Somatostatin 28 (MW 3147． 47)为外标。DHB 为基质;10 g /L 基质和样品溶液(均溶于
30%丙酮，用 Amberlite IRP-64 离子交换树脂进行去离子处理) ;去离子后的样品溶液与 1． 52 g /L 氯化
铯溶液以 1∶1(V /V)混合，混合液立即与去离子后的基质溶液以 1∶ 3(V /V)混合，并取 1． 5 μL 在靶上点
样。室温条件下挥发干溶剂，进行 MALDI-TOF分析。
3 结果与讨论
3． 1 优化的MALDI-TOF方法对山竹果皮缩合单宁结构的解析
本研究采用反射模式，经去离子处理后，引入 Cs +作为阳离子化试剂，得到了清晰的山竹果皮缩合
单宁的 MALDI-TOF质谱图(图 1)。解析此质谱图，并参考文献［3，12］，建立方程式:［M + Cs］+ = 2 +
288a + 304b + 272c + 152d － 2e + 133，其中，m/z 2 是两个末端 H，a ～ e 分别代表 C /EC (m/z 288)、GC /
EGC (m/z 304)、AC /EAC (m/z 272)、棓酰基-G (m/z 152)和 A型连接在聚合物分子中的个数，m/z 133
是 Cs +的相对原子质量。
将本实验测得数据与由公式推导的理论数据比较发现，两者基本吻合(表 1)。因此，可以推断山
竹果皮缩合单宁是从三聚体(m/z 999)到十一聚体(m/z 3303)分布的多聚物，离子峰最强的为五聚体
(m/z 1575) ，每个聚体内的聚合物都存在由于结构单元的不同或结构单元间连接方式不同产生的差
异，其中序列 m/z 999-1287-1575-1863-2151-2439-2727-3016-3303 的离子峰最强，固定相差 288 Da，说明
山竹果皮缩合单宁的主要结构单元为 C /EC。另外序列 m/z 1015-1303-1591-1879-2167-2455 在各聚合
3941第 10 期 周海超等:基质辅助激光解吸附飞行时间质谱方法分析山竹果皮缩合单宁
体内比最高峰多 16 Da，序列 m/z 983-1271-1559-1847-2135-2423-2711-2999-3287 在各聚合体内比最高峰
少 16 Da，这说明组成山竹果皮缩合单宁的结构单元还有 GC/EGC和 AC/EAC，其中，AC/EAC为次强离子
峰序列，存在于所有的聚合体中，而 GC/EGC在三聚体(m/z 1015)到八聚体(m/z 2455)间均检测到。由
图 1 和表 1 可知，MALDI-TOF还检测出在四聚体(m/z 1440)到七聚体(m/z 2303)均存在棓酰基。
植物缩合单宁除了通过 C4-C8 或 C4-C6 连接之外(B 型) ，还能够以一个 C C 键及一个
 C O C 键的双连接键(A型)形成多分散聚合物［1］(图解 1) ，由于形成 A型连接比 B 型连接多消耗
了 2 个 H，当聚合度不变时，A型连接多的聚合物的相对原子质量小于其它聚合物，这表现在所观测到
的一系列差值为 2 Da 的对应离子峰序列，由图 1 和表 1 可见，从四聚体(m/z 1285)到八聚体
(m/z 2436)均有 A型连接的存在。
由图 1 的放大的五聚体也可见，两个相邻聚合物之间 m/z 1543-1559-1575-1591 固定相差 16 Da，说
明五聚体中同时存在 C /EC，GC /EGC 和 AC /EAC。从离子峰强度可以看出，主要结构单元为 C /EC，
AC /EAC次之，GC /EGC最少，同时存在与 m/z 1575 相差 152 Da 的峰 m/z 1727，这证明了棓酰基的存
在;在不同的结构单元中可以观测到一系列差值为 2 Da 的对应离子峰序列 m/z 1555-1557-1559，
m/z 1571-1573-1575，m/z 1589-1591 和 m/z 1709-1711，说明不同的聚合物中普遍存在 A型连接。
图 1 山竹果皮缩合单宁质谱图( ［M + Cs］+)和五聚体放大图
Fig． 1 Matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight (MALDI-TOF)mass spectrum
［M + Cs］+ of condensed tannins from mangosteen pericarps and enlarged spectrum of pentamer
3． 2 优化的MALDI-TOF方法的优势及原理
以上实验结果与 Fu等［10］报道的13C NMR分析山竹果皮的原花色素的结果基本符合，但与 MALDI-
TOF质谱分析的结果存在较大的差异。本研究采用优化后的 MALDI-TOF 质谱方法检测到的山竹果皮
缩合单宁的信息(图 1 和表 1)显示，AC /EAC，GC /EGC结构单元及 A型连接存在的范围更广，其中 AC /
EAC在各聚合体中均有分布;GC /EGC 和 A 型连接在八聚体(m/z 2436)以下均能检测到。优化的
MALDI-TOF方法能够更加全面、准确地获取山竹果皮缩合单宁结构信息。
导致优化前后山竹果皮缩合单宁结构信息差异的主要原因是:样品去离子化处理和不同的离子化
试剂的引入对 MALDI-TOF质谱的影响。Na +作为阳离子化试剂在分析缩合单宁结构单元存在的缺陷
已有报道［3，4，8，9，13］。植物样品中存在着大量的 K +，与 Na +相对原子质量相差 16 Da，这相当于一个羟基
的相对原子质量［3］。因此，在未经过去离子化处理的条件下，引入 Na +作为阳离子化试剂，可能发生误
判结构单元 B环上的羟基数目，导致高估 GC /EGC(3 个羟基)在缩合单宁中的含量［3，8，9］。由于山竹缩
合单宁中含有 AC /EAC(1 个羟基)结构单元［10］，同理推断存在低估 AC /EAC的潜在风险。为了避免引
入Na +后受到K +的干扰，文献［4，13］以Ag +和Cs +作为阳离子化试剂，但Ag +的引入带来了新的干
4941 分 析 化 学 第 38 卷
表 1 基质辅助激光解吸附飞行时间(MALDI-TOF)质谱检测山竹果皮缩合单宁
Table 1 Matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF)of condensed tannins from
mangosteen pericarps
多聚物
Polymers
(表)儿茶素
C /EC
(a)
(表)棓儿茶素
GC /EGC
(b)
(表)阿福豆素
AC /EAC
(c)
棓酰基
-G
(d)
A型连接
A-type
(e)
理论值
［M + Cs］+
Calculated (m/z)
观测值
［M + Cs］+
Observed (m/z)
三聚体
Trimer
2 0 1 0 0 983 983
3 0 0 0 0 999 999
2 1 0 0 0 1015 1015
四聚体
Tetramer
3 0 1 0 1 1269 1269
3 0 1 0 0 1271 1271
4 0 0 0 2 1283 1283
4 0 0 0 1 1285 1285
4 0 0 0 0 1287 1287
3 1 0 0 1 1301 1301
3 1 0 0 0 1303 1303
4 0 0 1 0 1439 1440
五聚体
Pentamer
3 0 2 0 0 1543 1543
4 0 1 0 2 1555 1555
4 0 1 0 1 1557 1557
4 0 1 0 0 1559 1559
5 0 0 0 2 1571 1571
5 0 0 0 1 1573 1573
5 0 0 0 0 1575 1575
4 1 0 0 1 1589 1589
4 1 0 0 0 1591 1591
4 0 1 1 1 1709 1709
4 0 1 1 0 1711 1711
5 0 0 1 0 1727 1727
六聚体
Hexamer
5 0 1 0 1 1845 1845
5 0 1 0 0 1847 1847
6 0 0 0 2 1859 1859
6 0 0 0 1 1861 1861
6 0 0 0 0 1863 1863
5 1 0 0 1 1877 1877
5 1 0 0 0 1879 1879
5 0 1 1 0 1999 1999
6 0 0 1 0 2015 2016
七聚体
Heptamer
6 0 1 0 1 2133 2133
6 0 1 0 1 2135 2135
7 0 0 0 1 2149 2149
7 0 0 0 0 2151 2151
6 1 0 0 1 2165 2165
6 1 0 0 0 2167 2167
7 0 0 1 0 2303 2303
八聚体
Octamer
7 0 1 0 1 2421 2421
7 0 1 0 0 2423 2423
8 0 0 0 1 2437 2436
8 0 0 0 0 2439 2439
7 1 0 0 0 2455 2455
九聚体
Nonamer
8 0 1 0 0 2711 2711
9 0 0 0 0 2727 2727
十聚体
Decamer
9 0 1 0 0 2999 2999
10 0 0 0 0 3015 3016
十一聚体
Undecamer
10 0 0 1 0 3287 3287
11 0 0 0 0 3303 3303
C /CE: (epi)Catachin;GC /EGC: (epi)Gallocatachin;AC /EAC: (epi)Afzelechin．
5941第 10 期 周海超等:基质辅助激光解吸附飞行时间质谱方法分析山竹果皮缩合单宁
扰［3］。自然界的 Cs +仅有m/z 133 的同位素，且形成的分子峰［M + Cs］+能够弥补 Na +作为阳离子化
试剂存在的不足(去离子处理后，以 Cs +作离子化试剂的 MALDI-TOF 质谱图中基本检测不到加合物
［M + Na］+ 和［M + K］+的存在)。因此，Cs +是理想的阳离子化试剂。在判断其它结构信息(如双键
连接和棓酰基数目及分布)方面，向平等［9］推荐去离子处理能得到更可靠的信息，这与本研究结果一
致。本研究在去离子处理后引入 Cs +得到的 MALDI-TOF 质谱图能够清晰完整地反映山竹果皮缩合单
宁的结构信息。
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Analysis of Condensed Tannins from Mangosteen Pericarps by
Matrix-assisted Laser Desorption Ionization
Time-of-Flight Mass Spectrometry
ZHOU Hai-Chao，WEI Shu-Dong，LI Min，LIN Yi-Ming*
(Key Laboratory of the Ministry of Education for Coastal and Wetland Ecosystems，School of Life Sciences，
Xiamen University，Xiamen 361005)
Abstract In the process of deionization and selection Cs +(CsCl，1． 52 g /L)as cationization reagent，the
reflectron modes MALDI-TOF spectrum of condensed tannins from mangosteen (Garcinia mangostana L．)
pericarps showed an intact structure characteristics． The polymers of mangosteen condensed tannins extend
from the trimer (m/z 999) to the undecamer (m/z 3303) ，with the highest intensity in pentamer
(m/z 1575)． (epi)Catechin (C /EC) ，(epi)gallocatechin (GC /EGC)and (epi)afzelechin (AC /EAC)
were all detected in polymers with an intensity of C /EC ＞ AC /EAC ＞ GC /EGC． Meanwhile，galloyl units
occurred from tetramer (m/z 1440) to heptamer (m/z 2303)． The presence of A-type interflavan ether
linkage ranged from tetramer (m/z 1285)to octamer (m/z 2436)．
Keywords Mangosteen pericarps;Condensed tannins;Matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-
flight mass spectrometry;Cationization reagents;Polymers
(Received 26 February 2010;accepted 12 June 2010)
6941 分 析 化 学 第 38 卷