全 文 ：文章编号:1001 － 4829(2014)04 － 1539 － 04
收稿日期:2014 － 02 － 12
基金项目:南宁市科学研究与技术开发计划项目(201002051C)
作者简介:刘 威 (1982 －)，女，广西北流人，助理研究员，主
要从事药用植物病虫害研究工作，* 为通讯作者，E-mail:
1029807779@ qq． com。
砂仁叶斑病病原分离与鉴定
刘 威，叶云峰，蒋 妮，胡凤云，刘丽辉，林 伟*
(广西壮族自治区药用植物园，广西药用资源保护与遗传改良重点实验室，广西 南宁 530023)
摘 要:叶斑病是砂仁生长过程中的重要病害之一，主要为害叶片，给砂仁生产上造成重大的经济损失。为明确砂仁叶斑病病原
菌的分类地位，对该病原菌进行分离培养，并通过致病性测定、病原菌形态特征观察及 ITS rDNA 序列分析对病原菌进行鉴定，将
该病原菌鉴定为茄腐镰孢菌(Fusarium solani)。
关键词:砂仁;叶斑病;病原鉴定;茄腐镰孢菌
中图分类号:S435． 67 文献标识码:A
Isolation and Identification of Leaf Spot Pathogen on Amomum villosum
LIU Wei，YE Yun-feng，JIANG Ni，HU Feng-yun，LIU Li-hui，LIN Wei*
(Guangxi Key Laboratory of Medicinal Ｒesources Conservation and Genetic Improvement，Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plant，
Guangxi Nanning 530023，China)
Abstract:Leaf spot is one of the common disease on Amomum villosum． It usually damages the leaves and reduces the quality and yield of
Amomum villosum． In this study，the leaf spot pathogen was isolated and cultivated． Its pathogenicity was also tested． Base on its morpholog-
ical characteristics and ITS DNA sequences analysis，this pathogen was identified as Fusarium solani．
Key words:Amomum villosum;Leaf spot;Identification of pathogen;Fusarium solani
砂仁来源于姜科植物阳春砂(Amomum villosum
Lour．)、绿壳砂(A． Lour． var． xanthioides T． L． Wu
et Senjen)或海南砂(A． longiligulare T． L． Wu)的
干燥成熟果实。具有化湿开胃、温脾止泻、理气安胎
功效。用于湿浊中阻、脘痞不饥、脾胃虚寒、呕吐泄
泻、妊娠恶阻、胎动不安等病症［1］。现代药理学研
究也表明，砂仁具有多种生物活性，有抗氧化、保肝、
镇痛、抗菌等作用，同时对胃肠道粘膜保护、降血糖、
提高免疫系统、骨生长均起重要作用［2］。目前云
南、广东、广西等地栽培的砂仁品种均以阳春砂为
主［3］。砂仁是传统的中药材，不仅是香砂六君丸、
香砂养胃丸、舒肝丸等中成药的主药，还可配制成砂
仁蜜饯、砂仁糖和砂仁酒等系列保健品［4］。
砂仁由于具备独特的药用和保健作用，且富含
精油等成分，现云南、贵州、广东、广西等地已广为种
植。近几年，砂仁已逐渐成为广西南宁市隆安县屏
山乡脱贫致富的主要经济作物，但随着人工种植面
积的扩大和种植年限的延长，导致砂仁病害日趋严
重，严重影响了砂仁的产量和品质，给砂仁生产带来
了严重威胁。经调查发现，2010 年至今，在隆安县
砂仁种植区发生一种较为严重的病害，主要为害叶
片，造成叶片大量枯死，制约了砂仁产业的发展。本
研究通过对砂仁发病区的病组织材料进行病原菌的
分离，结合形态学特征和 rDNA ITS序列分析对该病
害的病原菌进行了鉴定，为有效防治该病害提供参
考依据。
1 材料与方法
1． 1 试验材料与症状描述
供试砂仁染病及健康的植株叶片均采集于广西
南宁市隆安县屏山乡上孟村砂仁规范化种植基地。
观察病害在田间的发病情况，对田间自然感病植株
进行症状描述。
1． 2 病原菌的分离纯化
病原菌分离采用常规的组织分离法［5］。选取
9351
2014 年 27 卷 4 期
Vol. 27 No. 4
西 南 农 业 学 报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
DOI:10.16213/j.cnki.scjas.2014.04.025
染病砂仁叶片的病健交界处的病组织，切成 0． 5 cm
×0． 5 cm 大小组织块，用 75 %乙醇浸泡 30 s，0． 1
%升汞消毒 2 min，再用灭菌水漂洗 3 次后置于 PDA
培养基上，于 26 ℃条件培养，待长出菌丝后，挑取菌
落边缘进行纯化，将纯化后的菌落通过单孢分离而
获得纯培养分离物。将经单孢纯化后的菌株保存于
PDA培养基上，置 4 ℃冰箱中贮存备用。
1． 3 病原菌的致病性测定
选取健康的砂仁植株叶片，用灭过菌的蒸馏水
冲洗干净，75 %乙醇表面消毒后，晾干，采用针刺接
种法［5］接种到砂仁的健康叶片上，以不接病原菌的
组织为对照，放置于具有湿润滤纸的培养皿中，每处
理设 3 次重复，将其置于 25 ～ 30 ℃自然条件下培
养，每隔 2 d 观察发病情况。培养期间保持一定的
湿度，观察、记录发病情况。适时对接种发病的叶片
组织进行病原菌再分离，观察分离得到的病原菌是
否与接种菌株相同。
1． 4 病原菌的形态学鉴定
将分离纯化得到的病原菌接种于 PDA 培养基
平板上，28 ℃培养 6 ～ 7 d，观察病原菌在 PDA 平板
上的菌落特征，显微观察病原菌菌丝体和分生孢子
的形态特征，随机测量 100 个病原菌分生孢子的大
小，并拍照，对病原菌进行形态学鉴定。
1． 5 分子生物学鉴定
将分离纯化得到的病原菌接种于 PDA 培养基
上培养 4 d 后，接入 PDB 液体培养基中，振荡培养
(28 ℃，80 r /min)5 d后收集菌丝用无菌水冲洗，抽
滤，冷冻干燥，－ 20 ℃低温保存备用。
病原菌 DNA提取采用 CTAB法［6］。病原菌 rD-
NA的 ITS 区域 PCＲ 扩增选用通用引物 ITS1(5-
TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3)和 ITS4(5-TCC
TCC GCT TAT TGA TAT GC-3)。反应在 50 μl 体
系中进行，体系含有 10 × PCＲ Buffer 5 μl，dNTP (10
mM)2 μl，Primer ITS1 (10 μM)2 μl，Primer ITS4
(10 μM)2 μl，Genomic DNA 100 ng，rTaq (5 U /μl)
1 μl;ddH2O 补足至 50 μl。反应程序为:95 ℃预变
性 5 min，进入循环，95 ℃变性 30 s，58 ℃退火 30 s，
72 ℃复性 80 s，33 个循环，最后 72 ℃延伸 7 min。
PCＲ产物经琼脂糖凝胶电泳回收目标 DNA片段，由
北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序，测序
结果用 Blast软件在 GenBank 数据库中已知序列进
行同源性比对。根据同源性比对结果，结合病原菌
的形态特征进行鉴定。
2 结果与分析
2． 1 病害症状
砂仁叶斑病主要为害叶片，下部老叶先发病，逐
渐向上部扩展。发病初期为水渍状病斑，后逐渐扩
大成近圆形或不规则形病斑，病斑中央呈灰白色，边
缘棕褐色，病健交界处明显，病斑受叶脉限制(图 1-
a)。湿度大时，后期病斑上可见小黑点，病斑相互
融合，使大量叶片干枯死亡，严重影响其光合作用及
生长。
2． 2 病原菌的分离和致病性测定
从病组织上分离得到形态相同的真菌 1 种，经
纯化培养后回接种到健康的砂仁叶片上，在 28 ℃温
度下保湿培养。刺伤叶片接种后的第 2 天开始发
病，出现水渍状病斑，菌斑扩展快，可见白色菌丝紧
a:自然症状;b:接种症状
a:natural symptoms;b:inoculation symptoms
图 1 砂仁叶斑病的症状
Fig． 1 Symptoms of leaf spot of A． villosum
0451 西 南 农 业 学 报 27 卷
a:菌落;b:大、小型分生孢子
a:colony;b:conidia
图 2 砂仁叶斑病原形态
Fig． 2 Pathogen morphology of leaf spot of A． villosum
贴于组织表面，侵染严重时可导致叶片全部染病枯
死，其症状特点(图 1-b)与田间自然发病症状相似
(图 1-a)，对照叶片上无发病症状。从接种的病组
织中分离的病原菌与田间发病组织分离的病原菌形
态一致，证明该致病菌为叶斑病的病原菌。
2． 3 病原菌的形态学鉴定
病原菌在 PDA 培养基上，菌落呈绒毛状，气生
菌丝旺盛，白色或浅灰色，稀疏至厚密，平坦，边缘整
齐，中央微隆起(图 2-a)。28 ℃培养 2 ～ 3 d 后产生
小型分生孢子，小型分生孢子数量多，椭圆形或卵
形，无色，多数单胞，少数具 1 个隔膜，大小为 (4． 8
～ 12． 7)μm ×(1． 6 ～ 4． 8)μm。培养 3 ～ 4 d 后产
生大型分生孢子，大型分生孢子无色，镰刀形，稍弯
曲，两端较钝圆，具 3 ～ 5 个隔膜，大小为(21． 6 ～ 39．
5)μm ×(4． 5 ～ 6)μm(图 2-b)。根据病原菌的培
养性状和形态特征，参照陆家云［7］、魏景超［8］和布
斯［9］等真菌分类相关资料，初步将该病原菌鉴定为
茄腐镰孢菌(Fusarium solani)，属半知菌亚门，丛梗
孢目，镰刀菌属真菌。
2． 4 分子生物学鉴定
以提取的砂仁叶斑病病原菌的 DNA为模板，用
rDNA的 ITS区段通用引物 ITS1 与 ITS4 进行扩增，
并对此片段进行序列测定，获得长度为 613 bp 的特
异性片段(GenBank 登录号为:KJ599628)。将产物
测得的序列在 GenBank中进行 BLAST比对，结果显
示，该序列与 GenBank中已报道的多个 Fusarium so-
lani菌株 ITS序列的同源性最高，相似度为 98 %。
根据砂仁叶斑病病原菌的形态特征，结合 rDNA
的 ITS序列分析结果，将引起砂仁叶斑病的病原鉴
定为茄腐镰孢菌(Fusarium solani)。
3 结论与讨论
近年来，砂仁种植已逐渐成为广西的中草药特
色产业，砂仁种植已成为许多农民致富的主要途径，
当地政府也十分重视砂仁种植产业的发展，相继出
台了一系列扶持政策，积极鼓励砂仁种植，然而砂仁
种植过程中发生的叶斑病害，往往造成砂仁种植业
的较大损失。目前，我国关于砂仁病害方面的研究
报道仍较少，已报道的有大豆叶点霉(Phyllosticta
glycines)［10］、节梨孢菌 (Gonmatopyricularia amo-
mi)［11］引起的叶斑病害，以及胶孢炭疽菌(Colletotri-
chum gloeosporioides)［12］引起的炭疽病害。本研究对
广西砂仁的叶斑病病原菌进行分离培养，并通过致
病性测定、形态特征观察及 rDNA-ITS 序列分析结
果，将引起砂仁叶斑病的主要致病菌鉴定为茄腐镰
孢菌(Fusarium solani)。该菌是一种广谱性致病菌，
寄主植物种类繁多，主要引起各种植物根腐病和枯
萎病［13 ～ 15］，但作为主要病原菌引起严重的砂仁叶斑
病，在国内外尚未见有报道。
砂仁叶斑病的发生主要受种植环境条件、温度、
降雨量等因素影响。栽培管理粗放、土质贫瘠、长势
弱的地块发病重，地势低洼、荫蔽过大的地块发病尤
为严重，6 － 9 月份高温多雨季节，病害蔓延迅速，短
期内即可造成大面积发生。
此外，该病病原的生物学特性、病害循环、发病
条件、防治方法等有待进一步研究。笔者建议田间
防治采用农业防治和化学防治方法对病害进行综合
防控，如选用无病种子或进行种子消毒、选择排水良
14514 期 刘 威等:砂仁叶斑病病原分离与鉴定
好地块、苗床消毒、及时清除田间病残体、创造良好
的通风条件、多施磷钾肥、轮作等，或在发病初期喷
施高效低毒杀菌剂。
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( 责任编辑 温国泉)
2451 西 南 农 业 学 报 27 卷