全 文 ：297※生物工程 食品科学 2007, Vol. 28, No. 12
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收稿日期：2007-09-25 *通讯作者
基金项目：河北省科技攻关项目(042401116D-2)
作者简介：李桂琴(1964-)，女，教授，研究方向为食品生物技术。
雪梨果肉多酚氧化酶的活性研究与纯化
李桂琴1,2，刘 坤1，张玉星2,*
(1.河北经贸大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050061；2.河北农业大学园艺学院，河北 保定 071001)
摘 要：以雪梨果实为试材，通过以邻苯二酚为底物测定氧化产物的方法，测定温度、pH值、抑制剂、不同
成熟期及不同部位对PPO活性的影响。结果表明：最适pH值为6.4；最适温度为25℃；不同成熟期PPO的活性
不同；1mol/L的亚硫酸钠为较好的抑制剂；果肉内部PPO活性最高，果肉中部的PPO活性最低。粗提液又经30%
硫酸铵沉淀去杂和80% 饱和度硫酸铵析出、Sephadex-G200柱层析及HiPrepTM16/10 QXL离子柱层析，得到电泳均
一的PPO，分子量43kD。
关键词：雪梨；多酚氧化酶(PPO)；层析
Characteristic and Purification of Polyphenol Oxidase from Snow Pear Flesh
LI Gui-qin1,2，LIU Kun1，ZHANG Yu-xing2,*
(1.Biological Science and Engineering Institute, Hebei University of Economics and Business, Shijiazhuang 050061, China；
2.College of Horticulture, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China)
Abstract ：The polyphenol oxidase (PPO) in snow pear flesh was extracted and purified. The results showed that the optimum
pH for PPO is 6.4; the optimum temperature for PPO is 25 ℃; the PPO activity changed at different stages; the 1 mol/L sodium
sulfite is a better inhibitor and the PPO activity is largest in the interior of pear fleash.Oxidase was purified from snow pear flesh
by four steps: Ammonium sulfate fractionation with saturation 30%, ammonium sulfate fractionation with saturation 80%,
Sephadex-G200 filtration and HiPrepTM16/10 QXL column chromatography in turn. Through these steps, PPO was purified to
electrophoretic homogeneity. SDS-PAGE showed the protein as a single polypeptide with a molecular weight of about 43.0 kD.
Key words：pear；phenol oxidize (PPO)；chromatography
中图分类号：S661.2 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2007)12-0297-04
1973年，Kubowitz在Warburg实验室中第一次分
离出多酚氧化酶。多酚氧化酶(PPO) 能催化各种酚类物
质氧化成为醌，再聚合成黑色素，并随时间的延长而
逐渐变黑，是引起水果、蔬菜及其制品酶促褐变的主
要酶类，因此倍受关注。
关于PPO性质的研究已有较多报道，研究结果揭示
PPO的性质因植物种类及品种而异。梨果肉中含有大量
的PPO，在加工程中，极易发生酶促褐变，不仅影响产
品的风味、色泽，还大大降低了梨制品的营养价值[1-2]。
本实验研究了温度、p H值、抑制剂、不同成熟期及
不同部位对雪梨PPO活性的影响，以及雪梨PPO的纯
化。雪梨是河北省梨的主要加工品种，研究其PPO在
不同成熟期、不同部位等的活性情况及变化规律，对
果实加工选择适宜的采收期、贮藏条件及抗褐变措施等
2007, Vol. 28, No. 12 食品科学 ※生物工程298
具有重要意义，同时有助于深入了解该酶的性质，并
为果实褐变机制的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1材料、试剂与设备
雪梨(采自石家庄学府路果园)，透析袋(截留分子量
10000～20000D)，微量注射器；磷酸盐缓冲液(PB溶
液)，过硫酸铵，邻苯二酚，HiprepTM16/10 QXL型层
析柱，SephedexG200，30%丙烯酰胺，AgNO3银染液
等；18-1138-03 AD，Protein purification，Spectrum 754
型紫外可见分光光度计，TGL-16C型台式高速离心机，
DYY-5稳压稳流凝胶电泳仪，国华HY-5回旋振荡器。
1.2方法
1.2.1PPO的提取与活性测定
将无损伤的梨用不锈钢刀迅速去皮，取5g果肉，
切碎，加入pH6.5预冷的0.1mol/L柠檬酸—磷酸氢二钠
缓冲液(pH6.6)10ml制成匀浆，在4℃下离心10min(RCF
为16000N)取上清液，即为PPO粗提液。
PPO活性测定采用速率法[3]。配制酶促反应液2.5ml
(0.1mol/L柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液，0.02mol/L邻苯二
酚，2%PPO提取液)，立即在420nm波长下测定OD值，
每隔10s读数一次，重复三次，取平均值。一个活性
单为每毫升酶液在1min内使OD值升高0.001(1U=0.001OD
值/(min·ml)。
1.2.2PPO特性
1.2.2.1PPO最适温度、最适pH值的测定
采用常规方法(最大活性管的相对活性定为100%)。
1.2.2.2不同抑制剂对PPO活性的影响
参照文献[4](将1mol/L亚硫酸钠抑制程度定为
100%)。
1.2.2.3雪梨在不同成熟期的酶活
2005年4月底开始采集，每隔9d采集一次，共采
集六次(为以后叙述方便六次采集的梨分别计为第1、
2、3、4、5、6时期)，采集完后即刻测定PPO活性。
1.2.2.4雪梨果实不同部位的酶活测定
取成熟的雪梨果实，在其中部、内部、外部分别
取样，测定P P O活性。
1.2.3PPO的纯化
1.2.3.1硫酸铵逐级沉淀
取PPO粗提液10ml，边缓慢搅拌边加入固体硫酸
铵，使饱和度达到10%，静置30min，16000r/min离心
30min，收集上清液，测酶活。重复上述步骤，分别
进行20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、
90%的硫酸铵沉淀，并分别收集上清测酶活。
1.2.3.2透析
用10ml磷酸钠缓冲液(0.05mol/L，pH6.6)溶解有酶
活的蛋白沉淀，以蒸馏水为透析液进行透析，直到在
透析液中加入BaCl2没有沉淀即可。
1.2.3.3SephadexG-200柱层析
在18-1138-03 AD液相层析系统中将SephadexG-200
柱(1.0cm×20cm)用0.05mol/L pH7.4磷酸钠缓冲溶液充分
平衡后，加入粗酶液5ml。用0.05mol/L，pH7.4的磷
酸钠缓冲溶液进行洗脱，流速为0.5ml/min，每10min收
集一管。检测各管酶活性及280 nm的吸收值，收集PPO
活性峰。对水透析，蔗糖低温包埋浓缩。
1.2.3.4HiprepTM16/10 QXL型层析
HiprepTM16/10 QXL凝胶柱(1.6cm×20cm)用0.1mol/L，
pH7.4的磷酸缓冲液充分平衡后，将SephadexG-200层析
后的活性组分0.3ml加到凝胶柱上，用100ml磷酸钠缓冲
溶液(0.05mol/L，pH7.4，含0.1mol/L NaCl)洗脱。再分
别用含0.3、0.5、0.7、0.9、1.0mol/L NaCl的磷酸钠
缓冲液(0.05mol/L，pH7.4)洗脱，流速为0.5ml/min，每
10min收集一管。检测各管酶活性及280nm的吸收值，
收集PPO活性峰。
1.2.3.5SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳[5]
按4%浓缩胶、12%分离胶进行电泳，完成后用
AgN3染色。
2 结果与分析
2.1PPO特性
2.1.1最适pH值
选择不同pH(范围5.4～7.0，间隔为0.2)的酶促反应
液，分别加入相同数量的PPO粗酶液，测PPO活性，
结果表明该酶的最适pH值为6.4，见图1。
150
100
50
0
5.45.65.86.06.26.46.6.87.0
酶
活
力
(
%
)
pH
图1 　pH值对 PPO的影响
Fig.1 Effects of pH values on PPO activity
2.1.2最适温度
选择不同温度(范围15～45℃，间隔为5℃)的酶促
299※生物工程 食品科学 2007, Vol. 28, No. 12
2.1.3抑制剂对雪梨PPO活性的影响
将几种抑制剂分别配置两种浓度，测定各种抑制剂
对PPO活性的影响(见表1)。结果表明，亚硫酸钠、抗
坏血酸和蔗糖对雪梨PPO的抑制作用最强，EDTA、巯
基乙醇、苯甲酸次之，而不同浓度的NaCl作用不同，浓
度为0.2时抑制作用很强，而浓度为2时却有激活作用。
肉内部的PPO活性最高，相对活性为100%，果肉中部
的PPO活性最低。说明了PPO活性和酚类物质含量分布
的一致性[6]，即易引起果肉褐变的果肉内部酚类物质含
量高，P P O活性也高。
反应液，分别加入相同数量的PPO粗酶液，测PPO活
性，结果表明该酶最适为温度为25℃，见图2。
150
100
50
0
15 20 25 30 35 40 45
酶
活
力
(
%
)
温度(℃)
图2 温度对 PPO的影响
Fig.2 Effects of temperature on PPO activities
表1 不同抑制剂对 PPO活性的影响
Table 1 Effects of different inhibitors on PPO activity
抑制剂(100%) 浓度(mol/L) 抑制效果(%)
EDTA
0.02 38.4
0.2 25.0
NaCl
0.2 49.8
2 -5.9
蔗糖
0.05 53.6
0.5 78.9
巯基乙醇
0.5 44.1
5 52.3
亚硫酸钠
0.1 79.9
1 100.0
抗坏血酸
0.5 81.8
5 97.3
苯甲酸
0.1 40.2
1 49.0
2.1.4雪梨不同成熟期的PPO酶活力
不同成熟期雪梨PPO的活性有明显差别，从图3看
出：第1期PPO的活性最高，相对活性为100%，到
第3期(9d间隔)PPO的活性由原来的100%降低到61.2%，
随后酶活有所上升，第4期酶活达到66.1%，随后酶活
又不断降低。可见第3期以后，PPO的活性较低，这
利于加工过程抗褐变作用。
2.1.5不同部位的酶活变化
果实不同部位PPO活性不同，结果(表2)表明：果
120
100
80
60
40
20
0
1 2 3 4 5 6
酶
活
力
(
%
)
时间(期)
图3 不同成熟期对 PPO的影响
Fig.3 Effects of different maturity stages on PPO activity
2.2PPO纯化
2.2.1硫酸铵逐级沉淀结果
120
100
80
60
40
20
0
中部 外部 内部
酶
活
力
(
%
)
果实部位
图4 果肉不同部位对 PPO的影响
Fig.4 Effects of deferent flesh part on PPO activity
10ml粗提液经30%硫酸铵沉淀以前的上清液PPO酶
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
102030405060708090
U
硫酸铵饱和度(%)
图5 硫酸铵分级沉淀后的 PPO酶活力
Fig.5 PPO activity through ammonium sulfate fractionation with
deferent saturation
2007, Vol. 28, No. 12 食品科学 ※生物工程300
活力较高且无多大变化，经80%硫酸铵沉淀以后上清液
PPO酶活力较低。初步说明经30%硫酸铵沉淀去杂和
80%饱和度硫酸铵析出，可有效地去除部分杂蛋白。
2.2.2SephedexG200柱层析
将透析后的粗酶液加到SephedexG200凝胶层析，得
到一有酶活的蛋白峰(见图5)。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶
电泳检测为混合蛋白质组分，因此将此峰的洗脱液对水
透析后用蔗糖包埋浓缩，用于进一步纯化。
到的II为单一组分的酶蛋白，表观分子量为43kDa。
3 结 论
3.1对雪梨果肉PPO活性研究结果表明：最适pH值为
6.4；最适温度为25℃；不同成熟期PPO的活性不同，
第3期以后PPO的活性较低，这利于加工过程抗褐变作
用；亚硫酸钠、抗坏血酸和蔗糖为较好的抑制剂；果
肉内部PPO活性最高，果肉中部的PPO活性最低，说
明了PPO活性和酚类物质含量分布的一致性。
3.2P P O与梨果肉褐变的关系极为密切。雪梨果肉
PPO纯化为进一步研究PPO酶学特征、氨基酸序列测定
和PPO基因的克隆，最终控制梨果酶促褐变奠定了基
础。笔者研究纯化出的PPO的分子量约为43kD，与报
道(天然植物PPO有活性的形式主要为40～45、59、65～
68以及70～72kD)相近。
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800
600
400
200
0
180200220240260
m
A
U
洗脱时间(min)
图6 PPO的 Sephedex G200层析
Fig.6 Sephedex G200 chromatography of enzyme
2.2.3HiprepTM16/10 QXL型离子交换层析
将处理过的酶液加到HiprepTM16/10 QXL型离子
交换层析柱上，进行洗脱，出现了四个吸收峰，见
图6。经测定，峰1酶活较高，收集并浓缩用于电
泳鉴定。
10
8
6
4
2
0
200 400 600
m
A
U
洗脱体积(ml)
图7 PPO的HiprepTM16/10 QXL离子层析
Fig.7 HiprepTM16/10 QX chromatography of enzyme
2.2.4纯化结果检测
将marker、SephedexG-200凝胶层析和HiprepTM16/
10 QXL型离子层析后富含多酚氧化酶的样品进行SDS-聚
丙烯酰胺凝胶电泳，从图7中可以看出，经纯化后收集
I II M
97.6kD
20.1kD
43.0kD
66.2kD
I.SephedexG-200凝胶层析后PPO；II. HiprepTM16/10 QXL型离子层析后
PPO；M.标准蛋白分子量。
图8 PPO蛋白的纯化效果
Fig.8 SDS-PAGE of antifungal protein