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超声辅助双水相体系提取苦荞籽黄酮
沈美荣1，李云龙2，俞月丽1，王 敏1，* ，寇莉萍1，*
(1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌 712100;
2.山西省农业科学院，山西太原 030031)
收稿日期:2016 －01 －29
作者简介:沈美荣(1989 －) ，女，硕士，研究方向:食品营养与化学，E －mail:shenmrong0202@ 163.com。
* 通讯作者:王敏(1967 －) ，女，博士，教授，研究方向:食品营养与化学，E －mail:wangmin20050606@ 163.com。
寇莉萍(1972 －) ，女，博士，副教授，研究方向:果品蔬菜的储藏与加工，E －mail:kouliping@ nwsuaf.edu.cn。
基金项目:荞麦保健机理及其食品加工利用关键技术研究;国家现代农业产业技术体系(CAＲS －08 －D －2 －2)。
摘 要:为提高苦荞黄酮分离纯化效率，本文采用双水相体系超声辅助提取苦荞籽黄酮。本文探讨了 15 种有机试剂 /
无机盐双水相体系萃取苦荞黄酮的能力，并考察了液料比、超声时间、超声温度、硫酸铵和丙酮质量浓度在丙酮 /硫酸
铵双水相体系对黄酮分配行为的影响，同时采用响应面优化萃取条件。结果表明:15 种有机试剂 /无机盐双水相体系
中，丙酮 /硫酸铵双水相体系具有最佳的苦荞黄酮提取能力;苦荞黄酮最佳提取条件为:液料比 46.65 g /g，超声温度
44.75 ℃，硫酸铵质量浓度 22.86%，在此条件下，黄酮得率可达 20.01 ± 0.26 mg /g;与 80%乙醇提取法相比，本法所得黄
酮提取物总黄酮含量和芦丁含量没有显著性差异，但黄酮纯度高达 62.35%，纯度提高了 38.86%;提取物 DPPH·和
ABTS +·清除率分别提高了22.52%、43.82%。因此，本法是一种更经济快速的苦荞黄酮初步提取纯化方法，有效提高
了黄酮功能性整体研究进度。
关键词:苦荞籽，黄酮，双水相
Ultrasonic －assisted aqueous two －phase extraction of
flavonoids from tartary buckwheat seed
SHEN Mei －rong1，LI Yun －Long2，YU Yue － li1，WANG Min1，* ，KOU Li －ping1，*
(1.College of Food Science and Engineering，Northwest A ＆ F University，Yangling 712100，China;
2.Shanxi Academy of Agricultural Science，Taiyuan 030031，China)
Abstract:The flavonoids of tartary buckwheat seed were extracted in the aqueous two －phase system by ultrasonic
cooperation to improve the efficiency of separation and purification.Fifteen different organic solvent / inorganic salt
systerms were adapted to extract the flavonoids from tartary buckwheat，and the effects of solid － liquid ratio，
ultrasonic time，ultrasonic temperature，mass concentration of ammonium sulfate and acetone on the partitioning
behavior of flavonoids were discussed in detail，while the extraction conditions were optimized by response surface
methodology(ＲSM).The results indicated that the acetone /(NH4)2SO4 aqueous two －phase system had the best
extraction effect. The optimum extraction conditions were as follows:liquid － solid ratio 46.65 g /g，ultrasonic
temperature 44.75 ℃，mass concentration of ammonium sulfate 22.86%，the yield of the flavonoid was 20.01 ±
0.26 mg /g at the optimum conditions.Compared with 80% ethanol extraction，there was no significant difference
between flavonoid yield and rutin content，but the purity of flavonoids reached 62.35% with an increase of 38.86%，
while the DPPH·and ABTS +·scavenging capacity was increased 22.52% and 43.82%，respectively.Therefore，the
technique provide a more economical and quick method to extract flavonoids of tartary buckwheat seed，improve
the research progress effectively.
Key words:tartary buckwheat seed;flavonoids;aqueous two －phase extraction
中图分类号:TS255.1 文献标识码:B 文 章 编 号:1002 －0306(2016)15 －0243 －07
doi:10． 13386 / j． issn1002 － 0306． 2016． 15． 039
苦荞(Fagopyrum tataricum(L.)Gaertn) ，又名鞑
靼荞麦，起源于中国西南部和喜马拉雅山，在东北、
华北和西北等地区广有分布［1］，是一种独特的药食两
用粮食作物。大量研究资料表明:苦荞具有降血糖、
降血脂、抗肿瘤、抗炎、抗氧化等多种药理活性［2－3］。
而文献报道，苦荞的保健功能主要归功于其富含的
黄酮类物质［4］，且黄酮类化合物更是以其广谱的药理
作用引人瞩目。因此，越来越多的科学家集中以黄
酮为目标物质研究苦荞潜在的健康益处，而苦荞黄
酮的提取纯化则成为研究者首要解决的问题。
244
目前，苦荞黄酮的提取方法主要有浸渍提取、微波提
取、超声波提取、酶解法和超临界流体萃取法，但这
些方法存在溶剂消耗大，提取时间长，或提取温度
高，热敏成分易失活，能耗大等不足［5］，且提取后的黄
酮类化合物成分复杂，需进一步分离纯化。近年来，
双水相萃取技术作为一种新型的分离技术日益受到
重视，与常规提取方法相比较，具有操作条件温和、
提取时间短、能耗低、被分离物质纯度高等优点［6］，已
被广泛应用于黄酮类化合物的分离和提纯。Liu 等
人［7］采用乙醇 /K2HPO4 双水相体系提取金银花总黄
酮，提取物中总黄酮纯度为 49.73%，显著高于 70%
乙醇提取物 (8.86%) ;Zhang 等人［8］ 采用乙醇 /
K2HPO4 双水相体系从木豆中提取染料木黄酮和芹
黄素，纯度比 80% 乙醇提取分别提高了 110% 和
85%。双水相萃取技术在苦荞黄酮中的应用也有报
道，徐春明等人［9－10］采用微波辅助乙醇 /硫酸铵双水
相体系分别提取苦荞麦麸皮和粉中的黄酮类化合
物，黄酮得率依次为 16.17、13.82 mg /g。但对于富含
淀粉的天然植物有效成分，微波提取很容易使它们
变性和糊化，堵塞通道，不利于胞内物质的释放［11］。
因此，本研究将实验室常用集成方式－超声波提
取，与双水相技术耦合集成，比较了不同有机试剂 /
无机盐双水相体系对苦荞籽黄酮的萃取能力，并考
察了黄酮在丙酮 /硫酸铵双水相体系萃取的分配规
律，以期得到较高收率和纯度的黄酮提取物，为苦荞
进一步研究提供更加经济快速的实验方法。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
苦荞种子(川荞 1 号) :2013 年购于四川凉山彝
族自治州，处理后粉碎，全粉过 40 目筛，置于 4 ℃冰
箱中备用;DPPH(1，1－Diphenyl－2－ picrylhydrazyl)、
ABTS(3－ ethylbenzthiazoline－6－ sulfonic acid)、Trolox
(6 － hydroxyl － 2，5，7，8 － tetramethylcroman － 2 －
carboxylic acid) Sigma 公司;芦丁、槲皮素(色谱
级) 上海试剂二厂;甲醇(色谱级) 安徽天地高纯
溶剂有限公司;其他均为市售分析纯试剂。
高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公
司;JD400 －3 电子分析天平 沈阳龙腾电子有限公
司;KQ －700DE 型数控超声波清洗器 昆山市超声
仪器有限公司;HC －2516 高速离心机 科大创新股
份有限公司中佳分公司;UV －1800 紫外分光光度
计 上海美谱达仪器有限公司;ＲE －52AA旋转蒸发
器 上海亚荣生化仪器厂;LC20A 高效液相色谱
仪 日本岛津公司。
1.2 实验方法
1.2.1 双水相体系的选择 双水相体系按质量配
制，系统总量为 20 g。分别称取 15%(w /w)不同无
机盐(K2HPO4，(NH4)2SO4，Na2CO3) ，33%(w /w)不同
有机溶剂(乙醇、丙酮、正丁醇、异丙醇、乙酸乙酯)与
一定质量的蒸馏水，于漩涡混合器上混匀，静置，待溶
液分相完全后加入 0.5 g 苦荞粉，25 ℃，420 W超声提
取 10 min，10000 r /min离心 5 min后，分别取样分析上
下相中苦荞黄酮的含量。有关的计算公式如下［8］:
K = Ct /Cb 式(1)
Ｒ = Vt /Vb 式(2)
Y1(%)= Ｒ × K /(1 + Ｒ × K)× 100 式(3)
Y2 = mt /ms 式(4)
注:Ct、Cb 为双水相系统上、下相苦荞黄酮的浓
度(mg /mL) ;Vt、Vb 为双水相体系上、下相体积
(mL) ;mt 为双水相体系上相黄酮的质量(mg) ;ms 为
苦荞粉干物质的质量(g) ;K 为黄酮在双水相体系分
配系数;Ｒ为双水相体系上下相的体积比;Y1 为黄酮
在上相中的收率(%) ;Y2 为黄酮在上相中的得率
(mg /g)。
1.2.2 苦荞黄酮含量的测定 黄酮含量采用经典的
Al(NO3)3 显色法
［3］测定。取一定量的样品提取液与
200 μL 5% NaNO2 溶液混匀，避光反应 6 min，然后
加入 200 μL 10% Al(NO3)3 溶液再反应 6 min，加入
2 mL 4% NaOH溶液后再用蒸馏水定容至 5 mL，混
匀后置于室温下避光反应 15 min，510 nm 波长处测
定吸光度。以芦丁标准溶液浓度(μg /mL)为横坐
标、吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线。
1.2.3 丙酮 /硫酸铵双水相体系相图的绘制 丙酮 /
硫酸铵双水相体系相图采用浊点滴定法［8］测定。精
确称取定量(NH4)2 SO4(ms)于锥形瓶中，加入定量
去离子水(mw)配制成一定浓度的盐溶液，然后缓慢
滴入丙酮，并不断振荡使其充分混合，观察溶液的澄
清程度，直至试管内液体出现浑浊为止，记录加入丙
酮的质量(mi) ;再次加入一定量去离子水(mw2) ，溶
液澄清;继续向试管中加丙酮并不断混匀，直至再次
达到浑浊，如此反复操作。计算每次达到浑浊时，丙
酮和(NH4)2 SO4 在系统总量中的质量分数，并以丙
酮质量分数为纵坐标，(NH4)2 SO4 的质量分数为横
坐标绘制相图。
1.2.4 单因素实验 以 1.2.1 的提取条件为固定反应
条件，在其他条件相同的情况下，采用不同液料比
(20、30、40、50、60 g /g)、超声时间(15、20、25、30、
35 min)、超声温度(25、30、35、40、45 ℃)、硫酸铵质
量浓度(17%、19%、21%、23%、25%)、丙酮质量浓
度(19%、23%、27%、31%、35%)进行超声波辅助丙
酮 /硫酸铵双水相体系提取实验，以苦荞黄酮得率和
分配系数为响应值，逐个考察各提取条件对提取效
果的影响。
1.2.5 Box －Behnken 响应面实验 根据单因素实验
结果，以影响苦荞黄酮得率的主要因素为变量，以黄
酮得率为响应值，采用 Box －Behnken实验设计方法，
对超声波辅助提取苦荞黄酮工艺参数进行优化。响
应面实验因素及水平如表 1。
表 1 响应面实验因素水平表
Table 1 Factors and levels used in response surface analysis
因素
水平
－ 1 0 1
X1 液料比(g /g) 20 40 60
X2 超声温度(℃) 25 35 45
X3 硫酸铵质量浓度(%) 17 21 25
1.2.6 HPLC 分析芦丁、槲皮素含量 HPLC 分析样
245
品的制备:称取适量样品，按照响应面所得最优工艺
提取苦荞黄酮后，取上相溶液于 40 ℃旋转蒸发，最
后用甲醇溶解并定容至 10 mL，－20 ℃冰箱中保存备
用。测试前用 0.45 μm针头式过滤器过滤，液相条件
参照 Gao［12］等人的方法。
色谱条件:Waters Symmetry C18 柱(4.6 mm ×
150 mm，5 μm) ，紫外检测波长:280 nm;柱温:30 ℃，
进样量:10 μL，流速:0.8 mL /min，流动相 A:甲醇，流
动相 B:超纯水(用磷酸调节 pH为 2.6)。梯度洗脱程
序:0 min，15% A;15～25 min，25% A;65 min，75% A;
70 min，15% A。
1.2.7 苦荞黄酮对 DPPH·清除能力的测定 参照
Guo等人［3］的方法。准确称取 0.0013 g DPPH，用甲
醇定容至 25 mL，配制成 DPPH 溶液。取 1 mL 稀释
样品液与 1 mL DPPH 溶液混合摇匀，室温避光反应
30 min后，于 517 nm下测定吸光值。以 Trolox为标准
品，得标准曲线 y = 1.6308x －1.9265，Ｒ2 = 0.9993。样品
清除 DPPH·的能力以100 g 样品干基中所含 Trolox 的
当量毫摩尔数表示(mmol Trolox eq. /g 100 DW)。
1.2.8 苦荞黄酮对 ABTS +·清除能力的测定 参照
Sogi等人［13］的方法并加以改动。7 mmol /L ABTS 溶
液与 2.45 mmol /L K2S2O8 等体积混匀后在室温下避
光放置 12 h得 ABTS +·溶液，在 734 nm 下用甲醇将
ABTS +·溶液的吸光值调至0.700(± 0.002)得 ABTS +·
工作液。取 200 μL 稀释提取液与 3.0 mL ABTS +·工
作液迅速混匀后于734 nm 处测定吸光度值。以
Trolox为标准品，得标准曲线:y = 0.32887x －0.9362，
Ｒ2 = 0.9998。样品的 ABTS +·清除能力以100 g 样品
干基中所含 Trolox的当量毫摩尔数表示(mmol Trolox
eq. /100 g DW)。
1.2.9 数据分析 采用 Design －Expert 7.0 进行响应
面实验设计和分析。其他数据均采用 Excel 2007 和
Spass 18.0 分析软件进行比较分析。所有实验均重
复 3 次。
2 结果与分析
2.1 双水相体系的选择
小分子有机物、无机盐形成双水相是盐溶液与
有机溶剂争夺水分子形成缔合水合物的结果。苦荞
黄酮在小分子有机试剂 /无机盐双水相体系中的分
配情况如表 2 所示。如表可知，苦荞黄酮被富集于
双水相体系的上相，其在 15 种双水相体系均有较大
的收率，而不同体系上相黄酮的得率则有较大差别，
其中以丙酮 /硫酸铵体系提取效果最佳，得率高达
19.58 mg /g。在 15 种不同的体系中，固定无机盐种
类，对于有机试剂在双水相体系中萃取黄酮的能力
由表可知，丙酮具有最强的萃取效果，其次为异丙
醇，乙酸乙酯最弱;而无机盐在体系中的黄酮萃取能
力依次为(NH4)2 SO4 ＞ K2HPO4 ＞ Na2CO3。综合考
虑，选择丙酮 /硫酸铵双水相体系，以苦荞黄酮在体
系上相的得率作为主要指标进一步研究。
2.2 丙酮 /硫酸铵双水相相图分析
双水相形成的条件和定量关系可用相图来表
示，它是研究双水相萃取的基础。丙酮 /硫酸铵双水
表 2 双水相体系的选择
Table 2 The selection of aqueous two －phase system
乙醇 丙酮 正丁醇 异丙醇 乙酸乙酯
(NH4)2 SO4
Ｒ 2.03 1.54 0.79 1.19 0.55
K 23.48 84.43 68.50 111.77 11.32
Y1(%) 97.92 99.20 98.18 99.22 85.34
Y2(mg /g) 16.27 19.58 17.39 19.08 4.09
K2HPO4
Ｒ 3.97 3.32 0.81 2.2 0.62
K 41.46 64.96 17.36 32.93 3.28
Y1(%) 99.38 99.53 93.33 98.62 66.93
Y2(mg /g) 16.65 18.22 13.65 17.90 3.06
Na2CO3
Ｒ 8.85 5.06 0.76 3.38 0.60
K 7.14 38.29 6.57 4.43 0.45
Y1(%) 98.29 99.48 82.86 93.15 21.04
Y2(mg /g) 9.61 15.87 7.71 9.15 1.66
相体系测得的相图如图 1 所示，结果与 Bensch 等
人［14］的研究结果一致。如图所示，双节线将相图划
分为上下两相，下方为单相区，不分相;上方为两相
区，在 两 相 区 内，上 相 富 含 丙 酮，下 相 富 含
(NH4)2 SO4。由图 1 可知，加入丙酮的量越大，恰好
分相时，所需盐的量就越小;反之，体系中(NH4)2 SO4
的质量分数越高，恰好分相时所需的丙酮体积分数
就越低。同时从该图也可看出，当(NH4)2 SO4 的质
量分数为一定值时，丙酮质量分数必须高于上图所
对应的最低值才能保证分相。如，当(NH4)2 SO4 的
质量分数为 16%时，丙酮在整个体系中的质量分数
必须达到 15%以上才能形成稳定的双水相体系。因
此，双水相萃取的实验点应从曲线上方的区域选取，
但丙酮质量分数和(NH4)2 SO4 质量分数需相互
协调。
图 1 丙酮 /硫酸铵双水相体系相图
Fig.1 The binodal curve of the acetone /(NH4)2 SO4 ATPS
2.3 苦荞黄酮提取单因素实验
2.3.1 料液比对黄酮提取的影响 由图 2 可知，苦荞
黄酮得率随液料比的增大而呈现先上升后下降的趋
势，在液料比为 40 g /g处有明显的峰值，而分配系数
则随液料比的增大而增大。这是因为双水相体系存
在黄酮提取和双水相萃取两个过程，当上相尚未饱
和，增加苦荞粉的量，得率相应增加;当苦荞黄酮浓
246
度超过该双水相萃取能力时，上相所能容纳苦荞黄
酮达到饱和，多余的苦荞黄酮转移至下相，导致得率
降低;而下相黄酮含量持续增加，则分配系数持续下
降。因此，确定液料比以 40 g /g为宜。
图 2 液料比对黄酮得率和分配系数的影响
Fig.2 Effect of solid －liquid ratio
on the yield and partition coefficients of flavonoids
2.3.2 超声时间对黄酮提取的影响 由图 3 可知，苦
荞黄酮得率随超声时间的延长呈先升高而后降低的
趋势，分配系数呈先略有降低后升高再降低的趋势。
在超声时间为 25 min时，黄酮得率达到最大值，而分
配系数则在 30 min时达到最大值。这说明延长提取
时间可使目标产物提取更彻底，但超声时间过长却
可能对样品中的黄酮结构产生破坏作用，不利于黄
酮的提取。因此，确定超声提取时间以 25 min为宜。
图 3 超声时间对黄酮得率和分配系数的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic time on the yield
and partition coefficients of flavonoids
2.3.3 超声温度对黄酮提取的影响 由图 4 可知，在
超声提取温度 25～35 ℃的范围内，随着提取温度的
升高，苦荞黄酮得率和分配系数也逐渐提高，但超过
35 ℃后，继续升高温度黄酮得率和分配系数不再提
高反而降低。分析其原因可能为，超声温度低，黄酮
不能完全溶出，而温度升高，提取液黏度减小，扩散
系数增加，促使传质速度加快，萃取更完全，但是随
着温度继续升高，硫酸铵在水中的溶解度增大，上相
盐向下相富集，上相溶液极性改变，不利于黄酮溶
出，进而导致黄酮得率和分配系数降低［15］。因此，确
定超声波提取温度以 35 ℃为宜。
2.3.4 硫酸铵质量浓度对黄酮提取的影响 由图 5
可知，在硫酸铵质量浓度在 17% ～21%的范围内，随
着硫酸铵质量浓度的增大，苦荞黄酮得率和分配系
数也随之逐渐提高，但是超过 21%后，继续增加硫酸
铵质量黄酮得率和分配系数不再提高反而降低。这
图 4 超声提取温度对黄酮得率和分配系数的影响
Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the yield
and partition coefficients of flavonoids
可能是因为随着硫酸铵质量浓度的增大，下相缔合
水的能力增强，上相中的水减小，上相中的丙酮浓度
间接增加，苦荞黄酮更易增溶到上相中，但由于上相
体积变小，增溶苦荞黄酮的量有限，黄酮向下相迁
移，故黄酮得率和分配系数均呈现先增大后减小的
趋势［6］。因此，确定硫酸铵质量分数以 21%为宜。
图 5 硫酸铵质量浓度对黄酮得率和分配系数的影响
Fig.5 Effect of mass concentration of(NH4)2 SO4
on the yield and partition coefficients of flavonoids
图 6 丙酮质量浓度对黄酮提取量的影响
Fig.6 Effect of acetone mass concentration
on the yield and partition coefficients of flavonoids
2.3.5 丙酮质量浓度对黄酮提取的影响 由图 6 可
知，苦荞黄酮得率随丙酮质量浓度增大而提高，而分
配系数则呈现先增大后略微降低的趋势。这可能是
由于随着丙酮质量浓度的增加，黄酮更易增溶至上
相，且丙酮争夺水分子能力增强，下相中更多的水分
被竞争吸附至上相，使上相体积显著增加，黄酮得率
和分配系数上升，但随着丙酮质量浓度继续增加，体
系变的不稳定，下相有少量晶体析出，黄酮得率不再
显著上升，分配系数略微下降［6］。因此，考虑成本问
247
题，选择丙酮质量分数以 31%为宜。
2.4 响应面分析法对苦荞黄酮提取工艺的优化
2.4.1 响应面实验设计及结果 在单因素实验基础
上，以对超声波辅助双水相提取黄酮得率影响显著
的 3 个因素—液料比、超声温度和硫酸铵质量浓度
为自变量，黄酮得率 Y 为响应值，按 Box － Behnken
模型进行三因素三水平响应面实验，实验设计及结
果如表 3 所示。
表 3 Box －Behnken实验设计及结果
Table 3 Experimental design and result
for response surface analysis
实验号 X1 X2 X3 得率(mg /g)
1 1 0 － 1 16.12
2 0 0 0 18.35
3 0 － 1 1 18.02
4 0 0 0 18.09
5 0 0 0 18.59
6 1 － 1 0 17.54
7 1 0 1 17.78
8 － 1 0 1 15.86
9 1 1 0 19.15
10 － 1 － 1 0 16.45
11 0 － 1 － 1 16.87
12 0 1 1 19.83
13 0 0 0 18.49
14 0 1 － 1 17.79
15 0 0 0 18.37
16 － 1 0 － 1 15.00
17 － 1 1 0 17.03
2.4.2 响应面实验结果分析及回归方程 根据表 3
实验结果，利用 Design Expert 8.0.6 软件进行分析，得
回归方程为:Y = 18.38 + 0.78X1 + 0.62X2 + 0.71X3 +
0.26X1X2 + 0.20X1X3 + 0.22X2X3 －1.39X1
2 + 0.55X2
2 －
0.80X3
2。
从表 4 可以看出，模型在 α = 0.01 水平上回归显
著，且失拟项的 p = 0.5122 ＞ 0.1，失拟不显著，因此模
型选择正确。Box －Behnken 实验设计方差分析中的
p值和构建模型中变量的系数可以反映变量对响应
指标的影响程度，p值越小，系数越大，相应变量对响
应指标的影响越大。由表 4 可知，各因素对苦荞黄
酮提取率的影响都达到极显著水平(p ＜ 0.01) ，且对
黄酮提取率的影响从大到小依次为:料液比 ＞硫酸
铵质量浓度 ＞超声温度。
由表 5 可知，相关系数的平方 Ｒ2 = 0.9905，表明
方程拟合较好。综上说明回归方程给超声波辅助双
水相提取苦荞黄酮提供了一个合适的模型。
2.4.3 各因素交互作用对黄酮得率的响应面分
析 三维响应面图可直观地反映自变量的交互作用
对响应值的影响。用 Design －Expert 8.0.6 软件对实
验结果进行响应曲面的分析，得出两个因素的交互
作用对苦荞黄酮得率的响应曲面图，结果如图 7
所示。
表 4 回归方程方差分析表
Table 4 Variance analysis of regression equation
变异来源 自由度 平方和 均方 F值 p值
模型 9 24.71 2.75 80.94 ＜ 0.0001＊＊
X1 1 4.88 4.88 143.94 ＜ 0.0001＊＊
X2 1 3.03 3.03 89.20 ＜ 0.0001＊＊
X3 1 4.08 4.08 120.14 ＜ 0.0001＊＊
X1X2 1 0.27 0.27 7.82 0.0267*
X1X3 1 0.16 0.16 4.72 0.0664
X2X3 1 0.20 0.20 5.84 0.0464*
X1
2 1 8.09 8.09 238.61 ＜ 0.0001＊＊
X2
2 1 1.28 1.28 37.68 0.0005＊＊
X3
2 1 2.70 2.70 79.74 ＜ 0.0001＊＊
误差项 7 0.24 0.034
失拟项 3 0.096 0.032 0.91 0.5122
纯误差 4 0.14 0.035
所有项 16 24.95
注:＊＊为差异极显著(p ＜ 0.01) ，* 为差异显著(p ＜ 0.05)。
表 5 模型的可信度分析
Table 5 Confidence analysis of the regression equation model
参数
Y的平均值
(%)
相关系数
Ｒ2
校正后的
Ｒ2
Y的变异系数
(Cv)/%
数值 17.61 0.9905 0.9782 1.05
由图 7a、7c 可以看到，超声波提取温度分别与
液料比和硫酸铵质量浓度有着显著的交互作用，但
液料比与硫酸铵质量分数的交互作用不显著(图
7b)。这一结果与表 3 的结果相一致。因此，得出预
测分析，确定响应面的最优条件为:液料比 46.65 g /g，
超声温度 44.75 ℃，硫酸铵质量浓度22.86%，预测苦荞
黄酮得率为 19.98 mg /g。在此优化条件下进行三次平
行验证实验，实验结果表明，黄酮得率稳定在(20.01 ±
0.26)mg /g，与预测值接近，表明响应面分析方法的模
型择合适，可以用来确定最佳萃取实验条件。
2.5 两种不同提取方法的比较
实验室对苦荞黄酮类化合物的提取常采用乙醇
为提取剂。因此，将本法与常规乙醇超声辅助提取
法进行比较研究，本法与超声辅助乙醇提取法的提
取分离条件均为其工艺最优条件，其中超声辅助乙
醇提取分离条件［16］为:液料比 30 mL /g，乙醇浓度
80%，提取温度 60 ℃，超声时间 30 min。比较结果如
表 6 所示。
由表 6 可知，本法所提苦荞黄酮得率为 20.01 ±
0.26 mg /g，高于徐春明等人采用微波辅助乙醇 /硫酸
铵双水相提取苦荞麸皮黄酮的得率(16.17 mg /g)［8］，
与 80%乙醇所提黄酮的得率(19.93 ± 0.30 mg /g)没
有显著差异，但与 80%乙醇提取法相比，双水相提取
所得黄酮粗提物的纯度(62.35%)显著高于 80%乙
醇所提粗提物(38.12%) ，纯度提高近 38.86%。分析
其黄酮组成由表可知，双水相体系提取芦丁含量为
1423.44 ± 6.77 mg /100 g DW，与 80%乙醇提取法所
得芦丁含量(1544.71 ± 2.65 mg /100 g DW)没有显著
248
表 6 两种提取方法的比较
Table 6 Comparison of two different extraction methods
项目 超声辅助双水相提取 超声辅助乙醇提取
总黄酮得率(mg /g) 20.01 ± 0.26 19.93 ± 0.30
总黄酮纯度(%) 62.35 38.12
芦丁含量(mg /100 g DW) 1423.44 ± 6.77 1544.71 ± 2.65
槲皮素含量(mg /100 g DW) 146.18 ± 4.19 11.99 ± 1.24
DPPH·清除率(mmol Trolox eq. /100 g DW) 10.17 ± 0.23 7.88 ± 0.47
ABTS +·清除率(mmol Trolox eq. /100 g DW) 84.81 ± 0.34 47.65 ± 0.36
图 7 各因素对苦荞黄酮得率影响的响应面图
Fig.7 Ｒesponse surface for the effects of
cross －interactions among factors
on extraction rate of polysaccharides
差异，但其槲皮素含量(146.18 ± 4.19 mg /100 g DW)
与 80%乙醇提取所得槲皮素含量(11.99 ± 1.24 mg /
100 g DW)差异显著，分析其原因可能为双水相体系
中含有较多的水，从而在提取过程中导致部分芦丁
降解，槲皮素含量增加［17］，这也可能是双水相黄酮提
取物较 80%乙醇黄酮提取物抗氧化活性强的原因。
两种方法所得黄酮提取物的抗氧化活性如表 6
所示，由表可知，超声辅助双水相提取所得黄酮提取
物 DPPH·清除能力(10.17 ± 0.23 mmol Trolox eq. /100
g DW)和 ABTS +·清除能力(84.81 ± 0.34 mmol
Trolox eq. /100 g DW)均显著高于 80%乙醇所得黄酮
提取物。因此，与常规超声辅助乙醇提取法相比，超
声辅助双水相提取法所得黄酮粗提物有较高的纯度
和抗氧化活性。
3 结论
采用超声波辅助丙酮 /硫酸铵双水相体系提取苦
荞籽黄酮，确定最佳工艺参数为:液料比 46.65 g /g，硫
酸铵质量浓度 22.86%，超声温度 44.75 ℃，超声时间
25 min，在此提取条件下黄酮提取率可达 20.01 mg /g，
与 80%乙醇所提黄酮得率(19.93 mg /g)没有显著性
差异。但双水相体系所得黄酮提取物纯度高达
62.35%，远高于 80% 乙醇所得黄酮提取物纯度
(38.12%) ，这是由于在双水相萃取过程中，黄酮类物
质往上相富集，而糖、蛋白质等杂质往下相富集，进
而显著提高了黄酮粗提物的纯度。
因此，超声辅助双水相提取法可有效缩短提取
时间、减小有机试剂使用量、提高提取物纯度，与其
他常用固液分离方法相比，双水相提取法可省去 1～2
个纯化步骤，使整个分离过程更经济快速，在抗氧化
等活性物质的提取纯化领域具有良好的应用前景。
参考文献
［1］Ｒen Q，Wu C S，Ｒen Y.Characterization and identification of
the chemical constituents from tartary buckwheat (Fagopyrum
tataricum Gaertn)by high performance liquid chromatography /
photodiode array detector / linear ion trap FTICＲ hybrid mass
spectrometry［J］.Food Chemistry，2013，136(3) :1377 －1389.
［2］Wang M，Liu J Ｒ，Gao J M，et al.Antioxidant activity of tartary
buckwheat bran extract and its effect on the lipid profile of
hyperlipidemic rats［J］ . Journal of Agricultural and Food
Chemistry，2009，57(11) :5106 －5112.
［3］Guo X D，Wang M，Gao J M.Bioguided fraction of antioxidant
activity of ethanol extract from tartary buckwheat bran［J］.Cereal
Chemistry，2012，89(6) :311 －315.
［4］Inglett G E，Ｒose D J，Chen D，et al. Phenolic content and
antioxidant activity of extracts from whole buckwheat(Fagopyrum
esculentum Mench)with or without microwave irradiation［J］.
Food Chemistry，2010，119(3) :1216 －1219.
［5］李二冬，黄丽珍，李波，等 .苦荞黄酮的提取分离及生理活
性研究进展［J］.农产品加工，2014，(7) :61 －64.
［6］刘小琴 .双水相 /反胶束萃取分离苦参生物碱的研究［D］.
广东:广东药学院，2012.
［7］Liu Y，Han J，Wang Y，et al.Selective separation of flavones
(下转第 275 页)
275
［5］K.M.Oulé，M.Dickman，J.Arul.Properties of Orange Juice with
Supercritical Carbon Dioxide Treatment［J］. International Journal
of Food Properties，2013，16(8) :1693 －1710.
［6］胡璇，夏延斌 .基于模糊数学的剁椒感官综合评价方法
［J］.食品科学，2011，32(1) :95 －97.
［7］Laura Vázquez － Araújo，Edgar Chambers IV，Koushik
Adhikari，et al. Sensory and physicochemical characterization of
juices made with pomegranate and blueberries，blackberries，or
raspberries［J］.Journal of Food Science，2010，75(7) :398 －404.
［8］徐树来，王永华 .食品感官分析与实验第二版［M］.北京:
化学工业出版社，2015:102 －105.
［9］Pangbom Ｒ M.Ｒelative taste of selected sugars and organic
acid［J］.Journal Food Science，1963，28(6) :726 －733.
［10］Doty TE. Fructose sweetness:A new dimension［J］. Cereal
Foods World，1976，21:62 －63.
［11］Zhang LT. The sweetness of sugars［J］. Journal of South
China University of Technology，2002，30(1) :89 －91.
［12］张群，付复华，吴跃辉，等 .湖南杂柑品种外观品质与营
养品质及感官评价之间的相关性研究［J］.食品工业科技，
2014，35(23) :100 －106.
［13］Takao K，Bunta W，Shiro S，et al. Characterization of
raspberry ketone /zingerone synthase，catalyzing the alpha，beta－
hydrogenation of phenylbutenones in raspberry fruits［J］ .
Biochemical and Biophysical Ｒesearch Communications，2011，
412(1) :104 －108.
［14］Nicole Ｒoberta Giuggioli，Ｒossella Briano，Claudio Baudino，
et al. Effects of packaging and storage conditions on quality and
volatile compounds of raspberry fruits［J］. CyTA － Journal of
Food，2015，13(4) :512 －521.
［15］任婧楠，荣茂，彭勋，等 .树莓汁中键合态香气物质的酸
解［J］.食品科学，2013，34(13) :101 －104.
［16］任婧楠，潘思轶，王可兴，等 .树莓及其加工制品中香气
化合物的研究进展［J］.食品科学，2013，34(11) :363 －368.
［17］Hamid Hassanpour. Effect of Aloe vera gel coating on
antioxidant capacity，antioxidant enzyme activities and decay in
raspberry fruit［J］.LWT －Food Science and Technology，2015，60
(1) :495 －501.
［18］ Eva M. González，Begoa de Ancos，Pilar M. Cano.
Preservation of raspberry fruits by freezing:physical，physico －
chemical and sensory aspects［J］. European Food Ｒesearch and
Technology，2002，215(6) :497 －503.
［19］Ｒichard E Harrison，D.Donald Muir，E.Anthony Hunter.
Genotypic effects on sensory profiles of drinks made from juice of
red raspberries (Ｒubus idaeus L.) ［J］ . Food Ｒesearch
International，1999，31(4) :303 －309.
［20］ Eva González，Salud Vegara，Nuria Martí，et al.
Physicochemical Characterization of Pure Persimmon Juice:
Nutritional Quality and Food Acceptability［J］. Journal of Food
Science，2015，80(3) :532 －539.
［21］张强，辛秀兰，杨富民，等 .主成分分析法评价红树莓果
醋的相对气味活度值［J］.现代食品科技，2015，31(11) :
檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾
332 －338.
(上接第 248 页)
and sugars from honeysuckle by alcohol / salt aqueous two －phase
system and optimization of extraction process［J］. Separation and
Purification Technology，2013，118:776 －783.
［8］Zhang D Y，Zu Y G，Fu Y G，et al. Aqueous two － phase
extraction and enrichment of two main flavonoids from pigeon pea
roots and the antioxidant activity［J］. Separation and Purification
Technology，2013，102:26 －23.
［9］徐春明，李婷，王英英，等 .响应曲面法优化微波辅助双水
相提取苦荞麦麸皮中黄酮类化合物的工艺研究［J］.中国食品
添加剂，2014，(2) :80 －86.
［10］徐春明，李婷，王英英，等 .微波辅助双水相提取苦荞麦
粉中黄酮类化合物［J］.食品科学技术学报，2014，(2) :80－86.
［11］陈瑞战 .超高压提取人参皂苷工艺及机理研究［D］.长
春:吉林大学，2005.
［12］Gao Q H，Wu C S，Yu J G，et al. Textural characteristic，
antioxidant activity，sugar，organic acid，and phenolic profiles of
10 promising jujube(Ziziphus jujuba Mill.)selections［J］.Journal
of Food Science，2012，77(11) :C1218 －C1225.
［13］Sogi D S，Siddiq M，Greiby I，et al. Total phenolics，
antioxidant activity，and functional properties of‘Tommy Atkins’
mango peel and kernel as affected by drying methods［J］. Food
Chemistry，2013，141(3) :2649 －2655.
［14］Bensch M，Selbach B，Hubbuch J.High throughput screening
techniques in downstream processing:preparation，characterization
and optimization of aqueous two － phase systems［J］. Chemical
engineering science，2011，62(7) :2011 －2021.
［15］Wu X Y，Liang L G，Zou Y，et al. Aqueous two － phase
extraction，identification and antioxidant activity of anthocyanins
from mulberry(Morus atropurpurea Ｒoxb.) ［J］. Food Chemistry，
2011，129(2) :443 －453.
［16］张杰 .苦荞黄酮超声提取工艺研究［J］.应用化工，2009，
38(7) :1020 －1021.
［17］Vogrincic M，Timoracka M，Melichacova S，et al.Degradation
of Ｒutinand Polyphenols during the Preparation of Tartary
Buckwheat Bread［J］. J Agric Food Chem，2010，58 (8) :
4883 －4887.