全 文 ：安徽农业大学学报 , 2009, 36(2):326-329
JournalofAnhuiAgriculturalUniversity
黄毛耳草总黄酮提取与纯化工艺的研究①
刘宏浩 ,杨世高 ,汪维云＊
(安徽农业大学生命科学学院 ,合肥 230036)
摘 要:用 L9(34)正交试验设计研究黄毛耳草总黄酮的提取工艺。结果表明 , 最佳工艺为用体积 12倍 70%的
乙醇提取 2次 , 每次 1.5h。选用 NKA-9极性大孔树脂纯化总黄酮 , 并且用 pH为 5的水淋洗除去多糖 ,最后所得总
黄酮含量为 43.1%。
关键词:黄毛耳草;总黄酮;NKA-9;大孔树脂
中图分类号:Q946.8 文献标识码:A 文章编号:1672-352X(2009)02-0326-04
Extractionandpurifictiontechnologyoftotalflavonecompounds
fromHerbahedyotidschrysotrichae
LIUHong-hao, YANGShi-gao, WANGWei-yun
(SchoolofLifeScience, AnhuiAgriculturalUniversity, Hefei230036)
Abstract:TheextractiontechnologyoftotalflavonecompoundsinHerbahedyotidschrysotrichaewasstudied
byusingL9(34)orthogonalexperimentdesigninthispaper.Theoptimumextractiontechnologywastoextractfla-
vonescompoundsfor1.5hwith70%ethanol, whichwastwelvetimesofvolumeaslargeastheweightoftheHerba
hedyotidschrysotrichae, andextracting2 times.NKA-9 typeresinwaschosentopurifytotalflavonecompounds,
andpolysaccharidwasremovedbywashingwithwater(pH5).Finaly, totalflavonecompoundscontentreachedat
43.1%.
Keywords:Herbahedyotidschrysotrichae;flavones;NKA-9;macroporousresin
黄毛耳草 (Herbahedyotidschrysotrichae), 又
名敷地两耳草 、石打穿 ,为茜草科耳草属植物。黄毛
耳草的干燥或新鲜全草 ,夏 、秋季收 ,晒干或鲜用 。
主要产于安徽 、江苏 、浙江 、江西 、福建 、湖南 、广东 、
广西 、云南等长江以南的广大地区 [ 1] 。它具有清热
解毒 、活血散瘀 、利尿消肿 、平肝明目的功能 ,民间广
泛应用于临床治疗黄疸型病毒性肝炎 、急慢性肾炎
及肿瘤等疾病[ 2] 。据文献报道 ,黄毛耳草含有生物
碱类 、环烯醚萜类 、黄酮类等化学成分 ,如异鼠李素-
3-芸香糖苷 、芦丁等 [ 3] 。李萍建立了黄毛耳草中槲
皮素的高效液相色谱测定方法[ 4] ,但却没有人深入
研究其总黄酮提取与纯化工艺 。本试验用正交设计
优化黄毛耳草总黄酮的提取工艺 ,并选择用 NKA-9
大孔树脂进行初步纯化 。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
黄毛耳草全草 , 芦丁对照品 , 各类树脂;UV-
2000型紫外分光度计 ,上海尤尼柯仪器有限公司;
R-501型旋转蒸发仪 ,上海申胜生物仪器公司;BSZ-
160F电脑自动部分收集器 , 上海精科实业有限
公司 。
1.2 提取方法
1.2.1 芦丁标准曲线的绘制 精密称取 10.3 mg
①收稿日期:2008-11-18
作者简介:刘宏浩(1983-), 男 ,硕士研究生;汪维云(1962-),男 , 博士 ,教授。
＊通讯作者(Corespondingauhhor) E-mail:weiyunw@126.com
芦丁对照品 ,用 75%的乙醇溶解并转移到 100 mL
的容量瓶中定容 ,制得 0.103 mg·mL-1的标准溶液 。
精密吸取 0、1.0、2.0、3.0、4.0和 5.0 mL标准溶液
置于 6只 10 mL容量瓶中 ,用 75%的乙醇分别补至
5 mL,加入质量分数为 5%的亚硝酸钠 0.6 mL,摇
匀 ,静置 6 min后加入质量分数为 10%的硝酸铝
0.6mL,摇匀 ,静置 6 min后加入质量分数 4%的氢
氧化钠 3 mL,最后用 75%的乙醇定容至刻度 ,摇匀
静置 15 min后 ,以试剂空白为对照在 510 nm下测
吸光度 。以芦丁质量浓度为横坐标 ,吸光度为纵坐
标绘制标准曲线 。用最小二乘法进行线性回归 ,得
到芦丁质量浓度和吸光度之间的回归方程:A=
0.012 3c-0.004, r2 =0.999 6。表明芦丁在 0 ～ 50
μg。范围内质量浓度和吸光度有较好的线性关系 。
精密吸取 2.0 mL标准溶液 ,实验步骤同上 ,做 6次
重复得到 RSD% =0.73%, 说明重现性比较好。同
时做精密度试验 , 同 1样液反复测 6次 , 得到
RSD% =0.12%, 说明仪器精密度良好。最后对同
一样液每 10 min测1次吸光度 ,测 6次 ,得到RSD% =
3.1%,表明此测定体系在 50 min内基本是稳定的。
1.2.2 提取工艺的优化设计 采用正交试验设计
考察浸提次数 ,乙醇浓度 ,提取时间和液料比对提取
过程的影响 ,每个因素设 3个水平 ,用 L9(34)正交
表优选浸提条件(表 1)。
将黄毛耳草全草烘干至恒重 ,粉碎过 20目筛 ,
精密称取 9份 ,每份 10 g,按正交表所设的组合在
80℃的水浴中浸提。分别将各组浸提液过滤浓缩后
移入 100mL容量瓶中定容 ,取 1mL稀释 10倍按照
1.2.1中的方法测定吸光度 (A)。提取液总黄酮浓
度 /mg·mL-1 =(A+0.004)/0.0123。
表 1 正交试验因素水平
Table1 Factorsandlevelsoforthogonaltest
水平
Level
浸提次数(A)
Timesforextraction
浸提时间(B)/h
Timeofextraction
乙醇浓度(C)/%
Concentrationofenthanol
液料比(D)
Liquid∶solid
1 1 1.5 60 12
2 2 2.0 70 15
3 3 2.5 80 18
1.3 纯化方法
1.3.1 大孔树脂预处理 大孔树脂往往含有未聚
合的单体 、致孔剂 、分散剂等 ,因此使用前必须预处
理 。方法如下[ 5] :用 2倍体积的 95%乙醇浸泡 ,在
摇床上 120 r·min-1振荡 24 h,充分溶胀倾去漂浮
物 ,用 95%乙醇洗至与水 1∶5混合不显浑浊为止 ,再
用大量的水洗至无乙醇味 。然后用 4倍体积 5%的
HCl溶液 ,清洗并浸泡 4 h,用水洗至中性 。最后用
4倍体积 2%的 NaOH溶液清洗浸泡 4 h,用水洗至
中性 ,备用。
1.3.2 大孔树脂的静态吸附试验 (1)树脂饱和
吸附量的测定。分别准确称取 2.00 g树脂 ,置于
100mL具塞磨口三角瓶中 ,精确加入 40 mL总黄酮
提取液 ,室温(25℃)100 r·min-1振荡 , 4 h后抽滤 ,
测定滤液中的黄酮含量 ,按下面的公式计算树脂的
单位饱和吸附量和吸附率:
Q=(C0 -CR)V/W
E=(C0 -CR)/C0)×100%
其中 Q为树脂单位饱和吸附量 , E为吸附率 , C0为提
取液的初始浓度 , CR为滤液浓度 , V为提取液的体
积 , W为树脂质量 。
(2)树脂解吸率的测定 。将以上抽滤得到的树
脂放入三角瓶中 ,加入 80 mL75%乙醇 , 室温 100
r·min-1 ,振荡 4 h后抽滤 ,测定滤液中的总黄酮含
量 ,按以下公式计算树脂的解吸率 。
D=cV/QW×100%
其中 D为解吸率 , V为所加乙醇的体积 , Q为单位饱
和吸附量 , w为树脂质量 。
根据吸附率和解吸率确定最好的树脂(表 2)。
大孔树脂应用在天然产物分离方面是利用其吸
附的可逆性即解吸附。因为结构和极性不同 ,树脂
的吸附能力和解吸能力都有一定的差别 ,所以考察
树脂的吸附率和解吸率是树脂筛选的重要环节。本
实验用 Y为参数作为树脂筛选的指标 ,选用 NKA-9
作为初步纯化的树脂。
1.3.3 大孔树脂的动态吸附试验 将层析柱(25
mm×320mm)与恒流泵和电脑自动收集器相连 ,按
需要设置恒流泵流速 ,收集器设置为每 5 min收集
一流份 ,准确称取10gNKA-9树脂(湿重)湿法装柱。
在此体系中进行吸附条件 ,水淋洗和洗脱条件试验。
32736卷 2期 刘宏浩等 黄毛耳草总黄酮提取与纯化工艺的研究
表 2 5种树脂吸附能力和解吸附能力
Table2 Adsorptionanddesorptionoffiveresins
树脂型号
Typeofresin
吸附量 /mg·g-1
Adsorption
吸附率 /%
Adsorptionratio
解吸量 /mg·g-1
Desorption
解吸率 /%
Desorptionratio Y
AB-8 20.52 38.26 18.62 88.41 0.33
D201 43.44 79.90 9.76 22.18 0.18
HPD100 43.70 79.39 7.48 17.11 0.14
NKA-9 42.62 78.42 35.82 82.99 0.65
X-5 25.06 46.51 21.76 39.53 0.18
Y=吸附率 Adsorptionratio×解吸率 Desorptionratio
2 结果与分析
2.1 提取工艺优化
表 3的分析结果表明 ,在设置的影响因素中 ,
RC>RA >RD >RB,最主要的因素是所用的乙醇的
浓度 ,其次是提取次数 ,提取时间的影响最小。方差
分析结果表明 ,提取时间的方差来源最小 ,乙醇的浓
度 (FC =19.661＊＊)和提取次数(FA =10.844＊)对
提取结果的影响极显著或显著。考虑实际生产中的
能耗和效率 ,最佳提取工艺条件为 A2B1C2D1 ,即用
12倍于黄毛耳草体积的 70%乙醇提取 2次 ,每次
1.5 h。
表 3 正交试验及结果
Table3 Designandresultsoforthogonaltest
试验号
Sample A B C D
黄酮提取量 /mg·g-1
Flavoneextraction
1 1 1 1 1 0.976
2 1 2 2 2 1.064
3 1 3 3 3 1.145
4 2 1 2 3 1.237
5 2 2 3 1 1.192
6 2 3 1 2 1.057
7 3 1 3 2 1.171
8 3 2 1 3 1.082
9 3 3 2 1 1.243
Average1 11.617 11.280 10.383 11.370
Average2 11.620 11.127 11.813 10.973
Average3 11.653 11.483 11.693 11.547
R 1.036 0.356 1.430 0.574
2.2 纯化工艺
2.2.1 吸附条件的确定 (1)上柱浓度对吸附率
的影响 。取 10gNKA-9湿法装柱 ,以 1.5 mL·min-1
速率分别把总黄酮浓度为 1.5、2.5和 3.5 mg·mL-1
的提取液上柱 ,测定每隔 20 min流出液的黄酮含
量。以流出时间为横坐标 ,流出液浓度为纵坐标绘
328 安 徽 农 业 大 学 学 报 2009年
制吸附曲线 。结果如图 1,当速率为 1.5 mg·mL-1
时达到吸附平衡的时间太长 , 2 h树脂没有达到饱
和状态 。速率为 3.5 mg·mL-1达到平衡的时间较
短 ,但黄酮流失严重 , 损失太多 。因此选择 2.5
mg·mL-1为上柱浓度。
图 3 不同洗脱速率的洗脱曲线
Figure3 Desorptioncurvesofdiferentvelocitiesofflow
(2)上柱速率对吸附率的影响。取 10 gNKA-9
湿法装柱 , 分别以 1.0、1.5和 2.0 mL·min-1的速
率 、以 2.5 mg·mL-1初始浓度上柱 ,测定每隔 20min
流出液的黄酮含量 。以流出时间为横坐标 ,流出液
浓度为纵坐标绘制吸附曲线。如图 2,当流速为 2.0
mL·min-1时 ,流速太快黄酮没有被充分吸附 ,随流
出液流出而造成部分黄酮的损失;而当上样速率为
1.0mL·min-1时 ,耗时太长 。所以本试验选用 1.5
mL·min-1的速率 。
2.2.2 水淋洗酸度的确定 取 10 gNKA-9湿法装
柱 ,用 2.2.1确定的吸附条件进行吸附 ,分别用 pH
为 3.0、4.0、5.0和 6.0的水淋洗 ,淋洗速率为 1.5
mL·min-1 ,直到用浓硫酸检测无糖反应 ,记下淋洗
体积。然后用 95%乙醇洗脱 ,收集洗脱液 ,干燥 ,称
重 ,测定干燥物中黄酮含量并计算回收率 。干燥物
中的黄酮含量分别为:26.78%、26.89%、27.32%和
27.02%;回收率分别为 59.44%、60.12%、59.89%
和 59.32%。淋洗时水的酸度对回收率没有显著的
影响 ,而当 pH为 5时 ,所得黄酮的含量最高 ,因此
决定以 pH为 5的水淋洗 ,并且当淋洗速率为 1.5
mL·min-1 ,水的体积约为 10倍的树脂体积时 ,已经
能基本将多糖洗净。
2.2.3 洗脱条件的确定 (1)乙醇浓度对洗脱的
影响。取 10gNKA-9湿法装柱 ,以 1.5mL·min-1的
速率将浓度为 2.5mg·mL-1的提取液上柱 , pH为 5
的水淋洗后 ,分别用体积分数为 30%、50%、70%和
90%的乙醇洗脱 ,洗脱速率为 1.5 mL·min-1 ,以盐
酸镁粉反应 [ 6]指示 ,直到反应为阴性 ,收集洗脱液 ,
干燥 ,称重 ,测定干燥物中黄酮含量并计算回收率。
结果表明 , 其回归率分别为 39.34%、 45.63%、
61.08%和 72.33%,纯度分别为 53.76%、46.77%、
34.73%和 28.49%。乙醇浓度对洗脱有很大影响 ,
低浓度的乙醇洗脱产物纯度高但回收率较低 ,高浓
度的乙醇回收率高而纯度低 ,综合考虑选择 70%的
乙醇为洗脱剂 。
(2)洗脱速率对洗脱的影响。取处理过的 10 g
NKA-9湿法装柱 ,以 1.5 mL·min-1的速率将浓度为
2.5 mg·mL-1的提取液上柱 , pH为 5的水淋洗后 ,
用浓度为 70%的乙醇分别以 1.5、 2.0 和 2.5
mL·min-1的速率洗脱 。每隔 10 min测定洗脱液黄
酮含量 , 以洗脱时间为横坐标 , 洗脱液的吸光度
(OD)为纵坐标绘制洗脱曲线。如图 3,从洗脱曲线
上可以看出以 1.5mL·min-1的速率洗脱效果较好 ,
但流速慢 ,耗费时间较长并且拖尾现象明显;以 2.5
mL·min-1洗脱时太快 ,洗脱不彻底也造成了明显的
拖尾现象;而以 2.0 mL·min-1的速率洗脱 ,洗脱曲
线相对集中 、对称也没有明显的拖尾现象。因此选
择 2.0 mL·min-1的洗脱速率。
3 小结
本试验用正交试验法优化了黄毛耳草总黄酮的
提取工艺 , 即在 80℃的水浴中用 12倍体积分数
70%的乙醇浸提 2次 ,每次 1.5 h。
利用 NKA-9极性树脂初步纯化黄毛耳草总黄
酮是可行的 ,所得总黄酮的纯度为了 43.1%。具体
步骤如下:以 1.5 mL·min-1的速率将浓度约为 2.5
mg·mL-1提取液上柱 ,再用 10倍于柱体积 pH=5的
水淋洗 ,淋洗速率为 1.5 mL·min-1 ,最后用 70%乙
醇 2.0 ml·min-1洗脱 ,收集 0 ～ 100min的流出液 。
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