全 文 ：分子植物育种，2009年，第 7卷，第 5期，第 948-953页
Molecular Plant Breeding, 2009, Vol.7, No.5, 948-953
研究报告
Research Report
三种百合种球病毒 RT-PCR检测
郑丽娜 刁义维 吴沙沙 吕英民 * 张启翔
北京林业大学园林学院,国家花卉工程技术研究中心,北京, 100083
*通讯作者, luyingmin@bjfu.edu.cn
摘 要 本研究以 4个百合品种为试材进行种球病毒分子生物学检测。研究结果表明，通过设计兼容性
好、性状稳定的三对特异性引物，提高了 PCR扩增的效率，改良了 RNA的提取方法；改进 Trizol法使其适
合于内层鳞片及脱毒苗叶片总 RNA的提取，而中外层鳞片则采用改进的 CTAB法，得到高纯度、高质量
以及完整度好的 RNA；各反应成分的扩增条件得到了优化，建立了灵敏、快速、低成本的种球病毒 RT-PCR
检测反应体系及程序。
关键词 百合种球病毒, RT-PCR检测,无病毒鳞茎繁殖
Detection of Three Kinds of Lily Mother Bulb Virus by Using RT-PCR
Techniques
Zheng Lina Diao Yiwei Wu Shasha Lv Yingmin * Zhang Qixiang
College of Landscape Architecture, Beijing Forestry University, China National Floriculture Engineering Research Center, Beijing, 100083
* Corresponding author, luyingmin@bjfu.edu.cn
DOI: 10.3969/mpb.007.000948
Abstract In this research, four lily cultivars were used as experimental materials to be studied for molecular bio-
logical detection of virus in Lily mother bulbs. The results showed that efficiency of PCR by designing three spe-
cific primers with good compatibility and stability was improved, as well as the method of RNA extraction was al-
so modified. The improved Trizol method was much more suitable for extracing RNA from lily inner scales and
virus-elimination leaves, and the improved CTAB method was better for extracing RNA from middle scales and
outer scales with high-purity, good-quality and complete RNA. Therefore, we established a set of virus detection
procedures of lily mother bulb by optimizing the PCR amplification conditions, which would be the sensitive, fast
and low cost for lily mother bulbs virus detection.
Keyword Lily mother bulb virus, RT-PCR detection, Virus free bulb propagation
www.molplantbreed.org/doi/10.3969/mpb.007.000948
基金项目：本研究由国家林业局 948引进项目(2006-4-85)、国家林业局行业标准(2009-LY-004)和国家十一五科技支撑计划项
目(2006BAD01A1803)共同资助
百合(Lilium spp.)为百合科(Liliaceae)百合属(Lil－
ium)，是一种重要的切花植物，栽培品种多，种植面积
日益扩大。目前，我国百合商品化栽培用种球主要依
靠进口，进口种球往往携带病毒，加之缺乏严格的检
疫控制及病毒脱除技术，致使病毒积累和蔓延，由此
造成百合切花品质变劣、产量下降、种性退化等问题，
亟待研究解决。因此，建立稳定的百合病毒检测体系
及行之有效的病毒脱除体系，培育和推广无毒种球，
具有重要意义。有关百合病毒检测与脱毒的报道较
多，但主要集中在食用的兰州百合(Lilium davidii var.
unicoior Cotton)以及百合的花、叶等器官，未见针对
种球的专门研究。种球是百合的主要繁殖器官，可从
根本上控制带病毒种球的流入，降低病毒病造成的
损失。目前百合种球的主要病毒包括黄瓜花叶病毒
(cucumber mosaic virus, CMV)、百合斑驳病毒 (lily
mottle virus, LMoV)以及百合无症病毒(lily symptom－
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
less virus, LSV) (沈淑琳, 1996) (表 1)。本研究选取当前
4个百合主栽品种的种球为材料，建立高效、快速、稳
定病毒检测分子生物学检测技术体系，为百合种球病
毒检测、脱毒复壮、百合国产化提供技术支撑。
1材料与方法
1.1试验材料
4个百合品种：东方百合杂种系(lily Oriental hy-
brid)品种‘西伯利亚’(‘Siberia’)和‘索邦’(‘Sorbonne’)，
OT百合杂种系(lily OT hybrid)品种‘耶罗林’(‘Yel-
loweed’)和‘木门’(‘Conca Dor’)，系云南进口的荷
兰种球，分别以它们的种球为试验材料。
1.2引物设计
根据 NCBI GenBank里数据库中收录的 CMV、
LMoV和 LSV各株系的基因序列，应用 Primer Primer
5.0设计软件设计特异引物(表 2)，引物的评价分析
采用“Oligo 6.0”软件。
1.3百合总 RNA的提取及测定
内层鳞片总 RNA的提取采用改良的 Trizol 试
剂法(Invitrogen公司)提取总 RNA。改良抽提次数，
重复步骤 3~5三次。
中层和外层鳞片总 RNA 的提取采用改良的
CTAB法提取总 RNA，改良步骤 3，65℃温浴时间由
常规的 5~10 min延长至 25~30 min，改良步骤 4氯
仿:异戊醇(24:1)抽提次数常规操作增至 3次。
提取的总 RNA，最终稀释成 10 ng/μL，取 2 mL
用分光光度计和 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其质量并
计算总 RNA含量，保存于-70℃超低温冰箱中备用。
表 1侵染百合的三种主要病毒
Table 1 Three main virus to infect lily
特征
Feature
属
Genus
结构特性
Structural characteristic
致死温度(℃)
Lethal temperature (℃)
传播方式
Transmission mode
发病症状
Morbidity symptom
百合无症病毒
Lily symptomless virus
麝香石竹潜隐病毒属
Carlavirus
粒体线条状,
640×17~18 nm
Granular line like,
640×17~18 nm
65~70℃
桃蚜
Peach aphid
无症或者皱曲条纹
Symptomless or wrinkling stripes
黄瓜花叶病毒
Cucumber mosaic virus
黄瓜花叶病毒属
Cucumovirus
粒体球状,直径 30 nm
Granular, diameter 30 nm
60~75℃
汁液,棉蚜,桃蚜
Juice, cotton aphid, peach aphid
重者植株矮化,鳞片短,无花;轻者花
畸形,花瓣开裂,具纵条纹
Serious symptom: plant dwarfing, short
scales; mild symptom: flower malfor-
mation, petals cracking, with vertical
stripes
百合斑驳病毒
Lily mottle virus
马铃薯 Y病毒属
Potyvirus
粒体线条状, 750~775×14~
16 nm
Granularlinelike,750~775×
14~16 nm
70℃
汁液,蚜虫传播
Juice, aphid spread
条斑褪绿, 有时表现出叶
畸形,褪色,坏死斑
Leaf chlorosis, sometimes
abnormal leaf, color fading,
necrotic spot
表 2病毒 LSV、CMV、LMoV的引物序列
Table 2 Primers sequences of the LSV, CMV and LMoV viruses
病毒
Viruses
CMV
LSV
LMoV
GenBank登录号
GenBank accession No.
AJ131615
AJ 516059
NC 005288
引物序列
Primers sequences
5-GAAACCAGATGGACAATCT-3
3-ATC ATA CAA C CAT AAG CGC CGA-5
5-CAAGACATGCAATCAGCACA-3
3-CCCTATCTCATCCATTATTT-3
5-CACCTCACCAAAAAATGGTGT-3
3-TAGTTCCAAGTAAGGAGAAATGC-5
预期片段大小(bp)
Expected fragment size (bp)
609
857
423
www.molplantbreed.org
DOI: 10.3969/mpb.007.000948949
1.4三重复合 RT-PCR有效体系的建立
RT有效体系的建立：以提取的 RNA产物为模
板，在Oligo d(T)18引导下，合成 cDNA第一链，取 2μL
逆转录产物为模板，用相应 LSV、CMV和 LMoV引
物在 PTC-200 PCR扩增仪上进行 PCR扩增，1.0%琼
脂糖凝胶电泳，利用 Gel-Doc1000凝胶成像分析系
统观测电泳结果，并照相记录。
PCR有效体系的建立：以合成的 cDNA第一链
为模板，合成的 5引物和 3引物为两端引物进行
PCR扩增。反应在 PCR扩增仪上进行，94℃变性 60 s，
60℃退火 60 s，72℃延伸 60 s，30个循环；再 72℃延
伸 10 min；最后于 4℃结束反应。进行 1%琼脂糖凝
胶电泳，检查扩增结果。
克隆及序列测定：扩增产物经 PCR回收试剂盒
纯化后，纯化 PCR产物连接到 pMD18-T simple vec-
tor,将连接产物转化到 Top 10 (TianGen)感受态细胞。
在 LB培养基上 37℃培养 16 h，挑取白色菌落，经
PCR鉴定，筛选出含有目标外源片段的重组克隆，送
中国农业科学院重大工程实验室进行序列测定。
序列分析：采用 DNAMAN软件对获得的 LSV、
CMV和 LMoV病毒分离物基因组相应序列及其同
源性进行分析，同源性比较在 GenBank中通过 Blast
程序进行。
1.5三重复合 RT-PCR有效体系的优化
为了优化 LSV的 RT-PCR体系，以上述建立的
RT-PCR体系为基础，对其 RT体系中的成份及浓
度、PCR体系中的成份及浓度进行了研究。优化 PCR
体系的基本原则是：获得清晰、稳定的目标特异产
物；成本较低；反应时间较短等(黄留玉, 2004)。对 RT
主要成分 dNTPs、三对引物、RNasin、M-MLV以及病
毒 RNA浓度各设 6组梯度处理。对 PCR主要反应
成分 dNTPs、Mg2+、三对引物 CPI、CP2、Taq DNA聚
合酶，模板 cDNA浓度以及扩增时间也各设 6组梯
度处理。阴性对照采用建立起来的有效体系中的相
应浓度优化试验数据。
1.5.1 M-MLV反转录酶浓度对 RT-PCR的影响
M-MLV反转录酶是 RT反应体系中的关键因子
之一，本试验在 RT有效体系的基础上设定 10 U/μL、
15 U/μL、20 U/μL、25 U/μL、30 U/μL和 35 U/μL等 6
个梯度分别进行 RT反应。
1.5.2 Taq DNA聚合酶浓度对 PCR扩增的影响
酶量与 PCR产物量密切相关，而且价格昂贵。本
试验在有效 PCR反应体系的基础上对 TaqDNA聚合
酶浓度设了如下处理：0.1 U/μL、0.2 U/μL、0.3 U/μL、
0.4 U/μL、0.5U/μL和 0.6U/μL，以期筛选其最佳低端
用量。
1.5.3引物浓度对 RT的影响
PCR体系中引物浓度通常为 0.1~1.0 μmol/L，更
高浓度可能导致异位引导，出现非靶序列扩增。本试验
对引物浓度设了如下处理：0.2 pmol/μL、0.3 pmol/μL、
0.4 pmol/μL、0.5 pmol/μL、0.6 pmol/μL、0.7 pmol/μL
等 6个梯度。
1.5.4 dNTPs浓度对 RT-PCR的影响
对 RT中 d NTPs的最佳浓度进行了研究，设定
了 0.5 mmol/L、0.6 mmol/L、0.7 mmol/L、0.8mmol/L、
0.9 mmol/L和 1.0 mmol/L等 6个梯度，对 PCR体系
设定 0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L，0.4 mmol/L、
0.5 mmol/L和 0.6 mmol/L等 6个梯度。
1.5.5 RNasin浓度对 RT的影响
本试验对 RNasin浓度设定了 0.5U/μL，1.0U/μL、
1.5 U/μL、2.0 U/μL、2.5 U/μL和 3.0 U/μL等 6个梯度。
1.5.6病毒 RNA模板的浓度对 RT-PCR的影响
为验证三重复合 RT-PCR的灵敏度，本试验模
板浓度设了 6 个梯度处理：0.05 μg/μL、0.1 μg/μL、
0.15 μg/μL、0.2 μg/μL、0.25 μg/μL、0.3μg/μL。
1.5.7退火温度对 RT-PCR的影响
根据所设计的 3对引物的特性，对退火温度设计
了 6个梯度处理：50℃、52℃、54℃、56℃、58℃和 60℃。
1.5.8 Mg2+浓度对 RT-PCR的影响
说明书指出其有效范围 1~4 mmol/L。本研究中参
考上述浓度，设定了对Mg2+的最佳浓度 1.25 mmol/L、
1.50 mmol/L、1.75 mmol/L、2.0 mmol/L、2.5 mmol/L和
3.0 mmol/L等 6个梯度。
1.6 三重复合 RT-PCR优化体系的建立
1.6.1 RT优化体系及反应程序
在冰浴的试管中加入反应混合物：模板总 RNA
(1 μg/μL) 5 μg、Random primer(3) (20 pmol/μL) 1 μL、
RNase-free ddH2O 7 μL。轻轻混匀后，置于 70℃水浴
5 min，接着冰浴 5 min。将试管冰浴，再加入组分：5×
Reaction Buffer 4 μL、RNase Inhibitor (40 U/μL) 1 μL、
dNTPMix (10 mmol/L) 1 μL。轻轻混匀后离心 3~5 s。
加入 2 μL M-MLV RT (200 U/μL)，终体积为 20 μL。
反应混合物首先在 25℃温育 10 min，然后 37℃水浴
三种百合种球病毒 RT-PCR检测
Detection of Three Kinds of Lily Mother Bulb Virus by Using RT-PCR Techniques 950
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
60 min。在 70℃加热 10 min结束反应，合成 cDNA
第一链，置冰上进行后续实验或冷冻保存。
1.6.2 PCR体系及反应程序
将反应体系中的成分加入到反应管中，反应体
系包括 cDNA 5 μL、10×PCR Buffer 5 μL、dNTP Mix
(10 mmol/L) 1.5 μL、Primer CMV1/CMV2 (5 pmol/μL)
5 μL、Primer LSV1/LSV2 (5 pmol/μL) 5 μL、Primer
LMoV1/LMoV2(5pmol/μL)5μL、TaqDNAPolymerase
(50 U/μL) 0.2 μL、MgCl2 (25 mmol/L) 4 μL和 ddH2O
19.8 μL，共 50 μL。
PCR反应程序：95℃预变性 4 min，然后 94℃变
性 20 s，52℃退火 30 s，72℃延伸 3 min，35 个循环；
72℃延伸 5 min，最后于 4℃结束。扩增产物取出后置
于冰上，尽快电泳，计算 RNA的含量和纯度。
1.7 RT-PCR产物的回收与测序
取扩增产物 50μL，进行 1%琼脂糖凝胶电泳，当
各条带充分分离时，转移至紫外灯下切胶纯化。PCR产
物纯化步骤按照 TaKaRa Agarose Gle DNA purifica-
tion Kit试剂盒的操作说明进行，然后进行琼脂糖凝
胶电泳检测，最后交中国农业科学院重大工程实验
室进行测序鉴定。
2结果与分析
2.1鳞片层次与病毒含量相关性分析
百合病毒具有系统侵染的特点，在植物体中除
生长点外的各个部位均可带毒，但不同器官、组织、
部位带毒量差别较大，即病毒在寄主体内呈不均匀分
布。据研究结果表明，感染病毒的百合其体内的病毒
含量在不同品系间、同品系不同单株间、同一单株不
同鳞芽间均有较大差异(Hsu, 1995)。徐秉良等(2004)
研究认为，随着种球种龄的增加，百合病毒的发病率
和病情指数均升高。
本研究结果显示，LSV、LMoV的内、中和外层鳞
片的特异扩增条带的强度比较一致，而 CMV在外层
鳞片扩增较强，在内侧鳞茎最弱，验证了感病植株不
同部位病毒含量不同的理论，总体来看，中外层鳞片
病毒含量较内层鳞片要高。究其原因与病毒的增殖、
运输、积累及传播途径机制有很大关系(图 1)。
2.2病毒检测结果及复合 RT-PCR体系的优化
对 3种病毒的完全复合 RT-PCR进行检测(图 2)，
其结果与单重 PCR扩增产物条带大小一致，分别为
857 bp、609 bp和 423 bp，表明这一材料感染了 LSV、
CMV和 LMoV三种病毒，而且有完全的复合侵染，
健康叶片无扩增产物条带。结果显示，本试验所设计
的三对引物能同时在一个反应体系中得到较强的扩
增，且片断长度相差适当，能够在保证正常扩增的同
时，达到谱带清晰、容易区分的目的。本试验所建立
的三重复合 RT-PCR 体系，可以从稀释 109 倍的
RNA粗提液中得到特异的扩增产物，体系稳定，灵敏
快速，整个过程 7~8 h即可完成。
RT-PCR优化梯度试验结果表明，进行此 4个品种
中三种病毒 LSV、CMV和 LMoV三重复合 RT-PCR
检测，RT反应中，M-MLV、dNTPs、引物浓度、RNasin
和 RNA模板浓度分别要达到 20 U/μL、0.5 mmol/L、
0.5 μmol/L、2.0 U/μL，0.25 μg/μL才能有最佳的反转
录结果；PCR反应中，TaqDNA聚合酶，dNTPs，引物浓
度，Mg2+浓度分别要分别达到 0.02 U/μL、0.2 mmol/L，
0.5 μmol/L和 2 mmol/L才能有最佳扩增结果。
2.3三种病毒核酸的测序结果
本试验所获得含有目的片段的菌液经中国农业
科学院重大工程实验室双向测序后，通过 Vector 9.0
的 Conting软件得到了三种病毒 LSV、CMV和LMoV
图 1 LSV, CMV和 LMoV病毒分布电泳图
注: 1:外层鳞片; 2:中层鳞片; 3:内层鳞片
Figure 1 The electrophoretogram of LSV, CMV, LMoV viruses
Note: 1: Out scales; 2: Middle scales; 3: Inner scales
图 2三重复合 RT-PCR产物凝胶电泳图
注 : M: DNA Marker; 1 : LSV; 2: CMV; 3: LMoV; 4: LSV+
LMoV; 5: CMV+LMoV; 6: LSV+CMV; 7: LSV+CMV+LMoV;
8:健康叶片
Figure 2 The electrophoretogram of triple multiplex-RT-PCR
products
Note: M: DNA Marker; 1: LSV; 2: CMV; 3: LMoV; 4: LSV+
LMoV; 5: CMV+LMoV; 6: LSV+CMV; 7: LSV+CMV+LMoV;
8: Health leaf
www.molplantbreed.org
DOI: 10.3969/mpb.007.000948951
各自 CP基因的核酸序列。
2.3.1百合无证病毒(LSV)的测序结果
检测结果表明，该品种组织中扩增到的特异性条
带，和阳性对照所得片段大小相同，大小约为 857 bp。
经克隆测序得大小为 857 bp的片段(图 3)，该片段经
在 GenBank中搜索，得到的所有序列全部为 LSV序
列，60%以上的序列和本序列同源性为 98%以上，其
中和 X15343.1、AY577530.1 和 AY620984.1 等最高
一致性均可达 99%，故所得到的序列确为 LSV。
2.3.2黄瓜花叶病毒(CMV)的测序结果
检测结果表明，该品种组织中扩增到的特异性条
带，和阳性对照所得片段大小相同，大小约为 609 bp。
经克隆测序得大小为 609 bp的片段(图 4)，该片段经
在 GenBank中搜索，得到的序列均为 CMV序列，且
同源性都在 92%以上，其中与 AJ131618、AJ495841
和 AJ296154等的一致性均为 100%，说明该序列确
为 CMV序列。
2.3.3百合班驳病毒(LMoV)的测序结果
检测结果表明，该品种组织中扩增到的特异性条
带，和阳性对照所得片段大小相同，大小约为 609 bp。
经克隆测序得大小为 609 bp的片段(图 5)，该片段经
在 GenBank中搜索，得到的序列均为 CMV序列，且
同源性都在 92%以上，其中与 AJ131618、AJ495841
和 AJ296154等的一致性均为 100%，说明该序列确
为 CMV序列。
3讨论
百合内层、中层和外层鳞片病毒含量不同，外层
鳞片＞中层鳞片＞内层鳞片，从而验证了病毒的表达
与寄主的生理代谢有密切关系。从病毒种类来看，
LSV、LMoV的内层、中层、外层鳞片的特异扩增条带
的强度比较一致，而 CMV在外层鳞片扩增较强，在
内层鳞茎最弱，说明 CMV在内层鳞片含量较少,可
能预示 CMV的表达与植株的代谢强度有关。
图 5 Siberia LMoV 3测序结果
Figure 5 The sequence of the LMoV 3 terminal
图 4 CMV3测序结果
Figure 4 The sequence of the CMV 3 terminal
图 3 LSV的 3端测序结果
Figure 3 The sequence of the LSV 3 terminal
三种百合种球病毒 RT-PCR检测
Detection of Three Kinds of Lily Mother Bulb Virus by Using RT-PCR Techniques 952
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
根据百合种球不同结构选择不同的 RNA提取
方法。内层鳞片采用改良 Invitrogen公司的 Trizol试
剂法提取，中层、外层鳞片采用改良 CTAB法提取试
剂提，均可得到满足 RT-PCR试验要求的 RNA。可以
考虑采用试剂盒进行鳞茎的 RNA提取，但是也需要
探索不同试剂用量及操作步骤的改良。
优化了 RT-PCR检测体系，包括 RNA提取的方
法，总 RNART-PCR活性检测的方法的优化，建立 RT
优化体系及 PCR优化体系及反应程序，并对影响
RT-PCR体系的 RT成分浓度、PCR成分浓度进行了
优化。所需试剂全都商品化，每个样品的直接检测费
用为 35~45元左右，是单一 RT-PCR的 30%。
RT-PCR产物测序结果与预期大小一致，通过与
NCBI GenBank上登录的三种病毒的分离物的序列
进行对比得知本试验分离物外壳蛋白序列与其它分
离物 CP基因序列同源性很高，高度保守。
参考文献
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Quarantne), 10(4): 223-226 (沈淑琳, 1996,百合病毒病及
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毒病的发生与症状类型,植物保护, 30(5): 62-65)
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