全 文 ：植物保护学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， ２０１５， ４２（３）： ３７６ － ３８１ ＤＯＩ： １０􀆰 １３８０２ ／ ｊ． ｃｎｋｉ． ｚｗｂｈｘｂ． ２０１５􀆰 ０３􀆰 ０１４
基金项目： 新疆维吾尔自治区科技支疆项目（２０１３９１１０９０）
∗通讯作者（Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）， Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｑｉａｎｙｉｋｅ１２３＠ １２６． ｃｏｍ， Ｔｅｌ： ０９９９ － ８３２１３２７
收稿日期： ２０１４ － ０５ － ２３
新疆三种葡萄病毒 ＲＴ⁃ＰＣＲ检测及序列分析
梁巧玲１ 　 乾义柯２∗　 张　 娜３ 　 陆　 平２ 　 刘绪斌２
（１．伊犁职业技术学院， 新疆 伊宁 ８３５０００； ２．伊犁出入境检验检疫局， 新疆 伊宁 ８３５０００；
３．伊犁师范学院， 新疆 伊宁 ８３５０００）
摘要： 为研究新疆葡萄中沙地葡萄茎痘伴随病毒（Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｒｕｐｅｓｔｒｉｓ ｓｔｅｍ ｐｉｔｔｉｎｇ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ，
ＧＲＳＰａＶ）、葡萄斑点病毒（Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｆｌｅｃｋ ｖｉｒｕｓ，ＧＦｋＶ）及葡萄病毒 Ａ（Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｖｉｒｕｓ Ａ，ＧＶＡ）的发生
情况和新疆分离株系统进化关系，分别克隆 ３ 种病毒新疆分离株部分基因区域，应用 ＲＴ⁃ＰＣＲ对新
疆 ６４ 份葡萄样品中上述 ３ 种病毒进行检测，并进行系统进化分析。 结果显示，ＧＲＳＰａＶ、ＧＦｋＶ 和
ＧＶＡ的检出率分别为 ３１􀆰 ３％ 、６２􀆰 ５％和 ２５􀆰 ０％ 。 新疆 ＧＲＳＰａＶ分离株（ＫＪ８０１８４７）与美国 ＧＲＳＰａＶ
分离株 （ＡＹ３６８５９０）同源性达 ９６􀆰 ５９％ ；新疆 ＧＦｋＶ 分离株 （ＫＪ８０１８４６ ）与日本 ＧＦｋＶ 分离株
（ＡＢ２２２８６１）及中国辽宁 ＧＦｋＶ分离株（ ＪＦ９２７９４２）的同源性分别为 ９１􀆰 ７０％和 ９１􀆰 ０３％ ；新疆 ＧＶＡ
分离株（ＫＪ８０１８４５）与波兰 ＧＶＡ 分离株（ ＪＮ８６０９９７）同源性为 ９３􀆰 ８８％ ，与中国四川 ＧＶＡ 分离株
（ＨＱ６７１６５５）及辽宁 ＧＶＡ分离株（ＦＪ４４５２２０）的同源性分别为 ９２􀆰 ９２％和 ８９􀆰 ５３％ 。 表明 ３ 种葡萄
病毒在新疆发生比较普遍，且新疆分离株与国内其它地方的分离株存在较大差异。
关键词： 葡萄病毒； ＲＴ⁃ＰＣＲ检测； 序列分析
ＲＴ⁃ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ｔｈｒｅｅ ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｒｏｍ
Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ｕｙｇｈｕｒ Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ Ｒｅｇｉｏｎ
Ｌｉａｎｇ Ｑｉａｏｌｉｎｇ１ 　 Ｑｉａｎ Ｙｉｋｅ２∗ 　 Ｚｈａｎｇ Ｎａ３ 　 Ｌｕ Ｐｉｎｇ２ 　 Ｌｉｕ Ｘｕｂｉｎ２
（１． Ｙｉｌｉ Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｙｉｎｉｎｇ ８３５０００， Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ｕｙｇｈｕｒ Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ Ｒｅｇｉｏｎ， Ｃｈｉｎａ；
２． Ｙｉｌｉ Ｅｎｔｒｙ ａｎｄ Ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕ， Ｙｉｎｉｎｇ ８３５０００， Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ｕｙｇｈｕｒ Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ Ｒｅｇｉｏｎ， Ｃｈｉｎａ；
３． Ｙｉｌｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｙｉｎｉｎｇ ８３５０００， Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ｕｙｇｈｕｒ Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ Ｒｅｇｉｏｎ， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｇｒａｐｅ ｖｉｒｕｓ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｒｕｐｅｓｔｒｉｓ ｓｔｅｍ ｐｉｔｔｉｎｇ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ
（ＧＲＳＰａＶ）， Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｆｌｅｃｋ ｖｉｒｕｓ （ＧＦｋＶ）， Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｖｉｒｕｓ Ａ （ＧＶＡ）， ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅｉｒ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ
ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｗｉｔｈ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ ｏｔｈｅｒ ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ ｏｒｉｇｉｎｓ， ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｖｉｒｕｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＲＴ⁃
ＰＣＲ ｉｎ ６４ ｇｒａｐｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ Ｘｉｎｊｉａｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ
ｗｉｔｈ ＧＲＳＰａＶ， ＧＦｋＶ ａｎｄ ＧＶＡ ｗｅｒｅ ３１􀆰 ３％ ， ６２􀆰 ５％ ａｎｄ ２５􀆰 ０％ ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ＧＲＳＰａＶ ｉｓｏｌａｔｅ
（ＫＪ８０１８４７） ｆｒｏｍ Ｘｉｎｊｉａｎｇ ｓｈａｒｅｄ ９６􀆰 ５９％ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｗｉｔｈ ＵＳＡ ｉｓｏｌａｔｅ （ＡＹ３６８５９０）， ａｎｄ ＧＦｋＶ ｉｓｏｌａｔｅ
（ＫＪ８０１８４６） ｓｈａｒｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｏｆ ９１􀆰 ７０％ ａｎｄ ９１􀆰 ０３％ ｗｉｔｈ Ｊａｐａｎ ｉｓｏｌａｔｅ （ＡＢ２２２８６１） ａｎｄ
Ｌｉａｏｎｉｎｇ （ Ｃｈｉｎａ） ｉｓｏｌａｔｅ （ ＪＦ９２７９４２ ）， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． ＧＶＡ ｉｓｏｌａｔｅ （ ＫＪ８０１８４５ ） ｓｈａｒｅｄ ９３􀆰 ８８％ ，
９２􀆰 ９２％ ａｎｄ ８９􀆰 ５３％ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｗｉｔｈ Ｐｏｌａｎｄ ｉｓｏｌａｔｅ （ＪＮ８６０９９７）， Ｓｉｃｈｕａｎ （Ｃｈｉｎａ） ｉｓｏｌａｔｅ （ＨＱ６７１６５５）
ａｎｄ Ｌｉａｏｎｉｎｇ （ Ｃｈｉｎａ） ｉｓｏｌａｔｅ （ ＦＪ４４５２２０）， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ
ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ｗｅｒｅ ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｉｎ Ｘｉｎｊｉａｎｇ ｗｉｔｈ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｆｒｏｍ ｏｔｈｅｒ ｉｓｏｌａｔｅｓ
ｉｎ Ｃｈｉｎａ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｖｉｒｕｓ； ＲＴ⁃ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ； ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ
　 　 葡萄是目前已知感染病毒最多的果树，已报道
的葡萄病毒有 ５５ 种，分属 ７ 个科 ２０ 个属（王引权
等，２００４）。 沙地葡萄茎痘相关病毒（Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｒｕｐｅｓ⁃
ｔｒｉｓ ｓｔｅｍ ｐｉｔｔｉｎｇ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ，ＧＲＳＰａＶ）和葡萄病毒
Ａ（Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｖｉｒｕｓ Ａ，ＧＶＡ）分别是葡萄皱木复合病
（ｒｕｇｏｓｅ ｗｏｏｄ ｃｏｍｐｌｅｘ ｄｉｓｅａｓｅ）的主要病原，该病导
致葡萄嫁接不亲和、开花延迟、生长衰退，甚至死亡
（Ｍａｒｔｅｌｌｉ ＆ Ｊｅｌｋｍａｎｎ，１９９８）。 葡萄斑点病毒（Ｇｒａｐｅ⁃
ｖｉｎｅ ｆｌｅｃｋ ｖｉｒｕｓ，ＧＦｋＶ）是葡萄斑点病毒属 Ｍａｃｕｌａｖｉｒｕｓ
的代表种（Ｍａｒｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ． ，２００２），该病毒引起的葡萄
斑点病是一种通过嫁接广泛传播的葡萄病毒病害，
在世界各个葡萄产区普遍发生。
近年来，随着葡萄种植区的不断建立和扩大，葡
萄扦插苗的调运日益频繁，由于病毒可随感染种苗
进行扩散和传播，新疆各地葡萄病毒病时有发生，且
种类繁多，出现复合侵染的概率较高，尤其是近几年
引种葡萄苗木中携带的病毒经过一段时间的潜伏和
积累，葡萄病毒病害大面积暴发，严重影响其开花、
生长，甚至造成整株死亡，部分田间发病率达到
１００％ 。 目前国内有关辽宁、山东、四川等地区葡萄
病毒病研究较多，对新疆葡萄病毒病的研究相对较
少，仅有学者对新疆葡萄上的类病毒如葡萄黄斑类
病毒 １（Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｙｅｌｌｏｗ ｓｐｅｃｋｌｅ ｖｉｒｏｉｄ １，ＧＹＳＶｄ１）、葡
萄黄斑类病毒 ２ （Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｙｅｌｌｏｗ ｓｐｅｃｋｌｅ ｖｉｒｏｉｄ ２，
ＧＹＳＶｄ２）和澳大利亚葡萄类病毒（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ ｇｒａｐｅ⁃
ｖｉｎｅ ｖｉｒｏｉｄ， ＡＧＶｄ） 等进行了相关检测 （彭山等，
２００８；范旭东等， ２０１１； ２０１２ ），并对新疆石河子
ＧＲＳＰａＶ的检测技术进行了探索（牛建新和李东栋，
２００２；牛建新等，２００７），而针对新疆葡萄病毒株系
差异以及 ＧＦｋＶ、ＧＶＡ 田间发生情况的研究未见报
道。 因此，本研究对新疆葡萄主要种植区 ＧＲＳＰａＶ、
ＧＶＡ和 ＧＦｋＶ 进行 ＲＴ⁃ＰＣＲ 检测，分别克隆了新疆
分离株的部分基因序列，利用核酸数据库（ＮＣＢＩ）已
知分离株核酸序列，开展了 ３ 种病毒的系统发育分
析，以期对葡萄病毒病防控提供理论支持。
１ 材料与方法
１􀆰 １ 材料
供试病株：２０１３ 年 ５—１０ 月采集新疆伊宁、博
乐、玛纳斯、石河子、乌鲁木齐、吐鲁番、库尔勒等地
区田间疑似葡萄病毒病害植株 ６４ 份，于 － ８０ ℃保
存备用。
培养基：ＬＢ（ ｌｕｒｉａ ｂｅｒｔａｎｉ）液体培养基：１０ ｇ ／ Ｌ
胰蛋白胨、５ ｇ ／ Ｌ 酵母提取物、１０ ｇ ／ Ｌ ＮａＣｌ；ＬＢ 固体
培养基：在液体培养基的基础上，每 １ Ｌ另加 １５ ｇ琼
脂粉；含异丙基⁃β⁃ｄ⁃硫代半乳糖苷 （ ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ⁃β⁃ｄ⁃
ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ，ＩＰＴＧ）和 β⁃半乳糖苷酶显色底物（５⁃
Ｂｒｏｍｏ⁃４⁃ｃｈｌｏｒｏ⁃３⁃ｉｎｄｏｌｙｌ β⁃Ｄ⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ， Ｘ⁃ｇａｌ ） 的
ＬＢ平板：涂板时先涂 ２０ ｍｇ ／ ｍＬ Ｘ⁃ｇａｌ ４０ μＬ，再涂
２００ ｍｇ ／ ｍＬ ＩＰＴＧ ４ μＬ。
试剂：ＲＮＡｐｒｅｐ Ｐｕｒｅ 植物总 ＲＮＡ 提取试剂盒
（ＤＰ４３２）由北京天根生物科技有限公司提供；Ｏｎｅ
Ｓｔｅｐ ＲＴ⁃ＰＣＲ Ｋｉｔ Ｖｅｒ． ２ （ ＲＲ０５５Ａ）、 Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ
ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ Ｖｅｒ． ２􀆰 ０、ＰＭＤ１９⁃Ｔ质粒
载体、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α感受态细胞均由宝生物
工程（大连）有限公司提供。
引物：根据 Ｈａｂｉｌｉ ｅｔ ａｌ． （２００６）报道设计 ＧＲＳＰａＶ
检测引物 Ｓｙ９Ｆ：５′⁃ＡＧＧＡＴＴＣＣＡＡＡＣＴＧＴＡＧＡＧＣＡＡ⁃３′
和 Ｓｙ８Ｒ：５′⁃ＴＴＧＧＴＣＧＴＣＡＴＣＴＴＣＣＡＧＴＴ⁃３′；根据 Ｓｈｉ
ｅｔ ａｌ． （２００３）报道设计 ＧＦｋＶ 检测引物 Ｕ２７９：５′⁃ＴＧ⁃
ＧＴＣＣＴＣＧＧＣＣＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＧＴＡ⁃３′和 Ｌ６３０：５′⁃ＧＧＣ⁃
ＣＡＧＧＴＴＧＴＡＧＴＣＧＧＴＧＴＴＧＴＣ⁃３′；根据 Ｍｉｎａｆｒａ ｅｔ ａｌ．
（１９９７）报道设计 ＧＶＡ检测引物 Ｈ５８７：５′⁃ＧＡＣＡＡＡＴ⁃
ＧＧＣＡＣＡＣＴＡＣＧ⁃３′和 Ｃ９９５： ５′⁃ＡＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＡＧＴ⁃
ＣＡＴＣＴＴＧＧ⁃３′。 以上引物均由宝生物工程（大连）有
限公司合成。
仪器：ＶＥＲＩＴＩ ２􀆰 ０ ＰＣＲ 扩增仪，美国 ＡＢ 公司；
ＡＩＩｅｇｒａ ２５Ｒ 高速冷冻离心机，美国贝克曼公司；
ＨＥ９９ 电泳仪，美国 ＧＥ 公司；Ｇ∶ ＢＯＸ ＥＦ 凝胶成像
系统，美国基因公司；Ｃｌｉｍａｃｅｌｌ ４０４ 培养箱，德国
ＭＭＭ公司；ＷＤ⁃９４０３Ｃ 紫外透射仪，北京市六一仪
器厂。
１􀆰 ２ 方法
１􀆰 ２􀆰 １ 总 ＲＮＡ提取及 ＲＴ⁃ＰＣＲ扩增
参照 ＲＮＡｐｒｅｐ Ｐｕｒｅ植物总 ＲＮＡ提取试剂盒操
作说明提取总 ＲＮＡ。 ２５ μＬ ＰＣＲ 反应体系：Ｐｒｉｍｅ⁃
Ｓｃｒｉｐｔ １ Ｓｔｅｐ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ １ μＬ、２ × １ Ｓｔｅｐ Ｂｕｆｆｅｒ １２􀆰 ５
μＬ、１０ μＭ 上下游引物各 １􀆰 ０ μＬ、模板 ＲＮＡ ０􀆰 ５
μＬ、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ２Ｏ ９􀆰 ０ μＬ。 反应程序：第 １ 阶段
５０ ℃ ３０ ｍｉｎ，９４ ℃ ２ ｍｉｎ；第 ２ 阶段 ９４ ℃ ３０ ｓ，退火
３０ ｓ（退火温度：Ｓｙ９Ｆ ／ Ｓｙ８Ｒ 为 ５６ ℃；Ｕ２７９ ／ Ｌ６３０ 为
５５ ℃；Ｈ５８７ ／ Ｃ９９５ 为 ５２ ℃），７２ ℃ １ ｍｉｎ，共 ３５ 次
循环；７２ ℃ ５ ｍｉｎ；４ ℃终止反应。 ＰＣＲ 扩增产物在
１􀆰 ５％琼脂糖 １ × ＴＡＥ 缓冲系统中电泳，每孔加样 ６
７７３３ 期 梁巧玲等： 新疆三种葡萄病毒 ＲＴ⁃ＰＣＲ检测及序列分析
μＬ，用凝胶成像系统观察并摄影记录。
１􀆰 ２􀆰 ２ ＰＣＲ扩增产物纯化、克隆及序列测定
在紫外透射仪上切下含目的 ＰＣＲ 产物的琼脂
糖块，用 Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ
Ｖｅｒ． ２􀆰 ０ 从琼脂糖凝胶上回收扩增片段，取 ２ μＬ 回
收产物与 ２ μＬ ＰＭＤ１９⁃Ｔ质粒载体加 ｄｄＨ２Ｏ ６􀆰 ０ μＬ
于 １６ ℃ 连接 ３０ ｍｉｎ 后，转化到 １００ μＬ Ｅ． ｃｏｌｉ
ＤＨ５α感受态细胞中。 在含有 ＩＰＴＧ 和 Ｘ⁃ｇａｌ 的 ＬＢ
平板上挑取白色菌落摇菌培养，提取重组质粒
ＤＮＡ，经 ＥｃｏＲⅠ酶切电泳鉴定后，筛选出含有正确
插入片段的重组克隆送生工生物工程（上海）股份
有限公司进行序列测定。
１􀆰 ２􀆰 ３ 序列分析及同源性比较
在 ＮＣＢＩ核酸数据库中进行 ＢＬＡＳＴ 比对分析，
从 ＧｅｎＢａｎｋ中获得 ５ 个不同地理来源的 ＧＲＳＰａＶ分
离株 ＲＮＡ 复制酶基因（ＲＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｓｅ ｇｅｎｅ），１６ 个
不同地理来源的 ＧＶＡ 分离株部分 ＣＰ（ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）
基因，９ 个不同地理来源的 ＧＦｋＶ 分离株 ＲＮＡ 复制
酶基因。 用 ＤＮＡｓｔａｒ 软件将序列比对分析，构建系
统发育树。
２ 结果与分析
２􀆰 １ 三种葡萄病毒 ＲＴ⁃ＰＣＲ检测结果
采用特异性引物对采集的 ６４ 份病害样本进行
ＲＴ⁃ＰＣＲ扩增，ＧＲＳＰａＶ、ＧＦｋＶ 和 ＧＶＡ 阳性样品检
出率分别为 ３１􀆰 ３％ 、６２􀆰 ５％和 ２５􀆰 ０％ ，其中 ＧＲＳＰａＶ
和 ＧＦｋＶ混合侵染率为 １８􀆰 ８％ ，ＧＦｋＶ 和 ＧＶＡ 混合
侵染 率 为 ６􀆰 ３％ 。 引 物 Ｓｙ９Ｆ ／ Ｓｙ８Ｒ 对 样 品 中
ＧＲＳＰａＶ检测结果显示，阳性条带为 ６２８ ｂｐ，且扩增
效率相对其它 ２ 种病毒要低（图 １⁃Ａ）；引物 Ｕ２７９ ／
Ｌ６３０ 对样品中 ＧＦｋＶ 检测结果显示，阳性条带为
３５２ ｂｐ，在预期条带 ４１５ ｂｐ与 ３１５ ｂｐ之间（图 １⁃Ｂ）；
引物 Ｈ５８７ ／ Ｃ９９５ 对样品中 ＧＶＡ 检测结果显示，阳
性条带为 ４３０ ｂｐ（图 １⁃Ｃ）。
图 １ 引物 Ｓｙ９Ｆ ／ Ｓｙ８Ｒ（Ａ）、Ｕ２７９ ／ Ｌ６３０（Ｂ）及 Ｈ５８７ ／ Ｃ９９５（Ｃ）的 ＲＴ⁃ＰＣＲ扩增产物电泳图
Ｆｉｇ． １ Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ ｏｆ ＲＴ⁃ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｕｓｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ Ｓｙ９Ｆ ／ Ｓｙ８Ｒ （Ａ），
Ｕ２７９ ／ Ｌ６３０ （Ｂ） ａｎｄ Ｈ５８７ ／ Ｃ９９５ （Ｃ）
Ｍ： Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ ２０００； ＣＫ： 空白对照； １ ～ ２： 葡萄样品。 Ｍ： Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ ２０００； ＣＫ： ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ； １ － ２： ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｓａｍｐｌｅ．
　
２􀆰 ２ 三种葡萄病毒克隆测序结果
克隆质粒经 ＰＣＲ鉴定，得到与目标片段大小相
符的 ＤＮＡ序列，ＧＲＳＰａＶ、ＧＦｋＶ和 ＧＶＡ的新疆伊宁
分离株序列大小分别为 ６２８、３５２、４３０ ｂｐ。 将所得序
列提交至 ＧｅｎＢａｎｋ，序列登陆号分别为 ＫＪ８０１８４７、
ＫＪ８０１８４６ 和 ＫＪ８０１８４５。
２􀆰 ３ 三种葡萄病毒的新疆分离株序列分析
通过同源性及进化树分析，ＧＲＳＰａＶ 新疆分离
株（ＫＪ８０１８４７）与 ＧＲＳＰａＶ 美国分离株（ＡＹ３６８５９０）
相似度最高，核苷酸序列同源性达 ９６􀆰 ５９％ ，与澳大
利亚分离株（ＥＵ２７１７９９）同源性为 ９１􀆰 ６４％ ，与巴西
分离株 （ ＨＭ１３０５２４ ） 同源性为 ９１􀆰 ５４％ （图 ２ ）。
ＧＦｋＶ新疆分离株（ＫＪ８０１８４６）与 ＧＦｋＶ 日本分离株
（ＡＢ２２２８６１）相似度最高，核苷酸序列同源性为
９１􀆰 ７０％ ，与中国辽宁分离株（ ＪＦ９２７９４２）同源性为
９１􀆰 ０３％ ，与智利分离株 （ ＨＭ６３６８５２ ） 同源性为
８７􀆰 ９６％ ，与意大利分离株 （ ＧＵ８１２８９８）同源性为
８７􀆰 １５％ ，与意大利（ＦＭ２００４２６）和巴西（ ＪＮ５４５８３７）
分离株同源性则在 ８０％以下（图 ３）。 ＧＶＡ 新疆分
离株（ＫＪ８０１８４５）与 ＧＶＡ波兰分离株（ＪＮ８６０９９７）相
似度最高，核苷酸序列同源性达 ９３􀆰 ８８％ （图 ４），与
南非（ＫＣ９６２５６４）和中国四川（ＨＱ６７１６５５）分离株同
源性分别为 ９３􀆰 ０２％ 和 ９２􀆰 ９２％ ，与巴西分离株
（ＡＹ３４０５８１） 同源性为 ９０􀆰 ５９％ ，与美国分离株
（ＨＱ６７６９９９）同源性为 ９０􀆰 ７４％ ，与意大利（Ｘ７５４３３）
和以色列（ＡＹ６７６３１６）分离株同源性分别为 ９１􀆰 ４％
和 ９０􀆰 ９１％ ， 与 中 国 辽 宁 （ ＦＪ４４５２２０ ）、 智 利
（ＨＭ６３６８６６）、约旦（ＡＹ５９４１７６）、捷克（ＥＵ００８５６１）
８７３ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷
图 ２ ＧＲＳＰａＶ（ＫＪ８０１８４７）部分基因序列系统进化树分析
Ｆｉｇ． ２ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐａｒｔｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＧＲＳＰａＶ （ＫＪ８０１８４７） ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ ｏｒｉｇｉｎｓ
　
图 ３ ＧＦｋＶ（ＫＪ８０１８４６）部分基因序列系统进化树分析
Ｆｉｇ． ３ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐａｒｔｉａｌ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＧＦｋＶ （ＫＪ８０１８４６） ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ ｏｒｉｇｉｎｓ
　
图 ４ ＧＶＡ（ＫＪ８０１８４５）部分基因序列系统进化树分析
Ｆｉｇ． ４ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐａｒｔｉａｌ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＧＶＡ （ＫＪ８０１８４５） ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ ｏｒｉｇｉｎｓ
　
９７３３ 期 梁巧玲等： 新疆三种葡萄病毒 ＲＴ⁃ＰＣＲ检测及序列分析
和伊朗（ＧＵ０８４１６５）的分离株同源性均低于 ９０％
（图 ４）。
３ 讨论
葡萄病毒的检测技术比较成熟，除 ＲＴ⁃ＰＣＲ 检
测技术成功地应用于 ＧＲＳＰａＶ、ＧＶＡ、ＧＦｋＶ 等葡萄
病毒的检测外，还有利用特异性核酸探针检测葡萄
病毒，分子杂交（ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ）技术检测葡萄卷叶病
毒（Ｓａｌｄａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ． ，１９９４；Ｈａｂｉｌｉ ｅｔ ａｌ． ，１９９７）、葡萄
扇叶病毒（Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ． ，１９９１；Ｍｏｎｉｓ，２０００）等。 谷洪
仓等（１９９４）、魏梅生等（１９９５）用生物素标记葡萄病
毒 ｃＤＮＡ探针，检出病毒 ＲＮＡ 灵敏度可达 １０ ｐｇ。
Ｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ． （２００８）利用 ＲＴ⁃ＰＣＲ、实时荧光 ＲＴ⁃ＰＣＲ
及微阵列芯片技术对 １３ 种葡萄病毒进行了检测分
析。 本研究利用 ＲＴ⁃ＰＣＲ 技术对新疆葡萄植株中
ＧＲＳＰａＶ、ＧＦｋＶ和 ＧＶＡ进行了系统检测，相对荧光
标记的核酸探针检测技术灵敏度要低，在检测带毒
率较低的样品时可能出现阳性漏检；相对微阵列芯
片检测技术在病毒种类及变异种方面存在局限性，
特别是在检测复合侵染样品时会出现侵染种类漏检
或无法区分变异株的可能。 虽然核酸探针、荧光标
记及微阵列等技术具有特异性强、灵敏度高、通量大
等优点，但操作程序较为复杂，技术成本较高，所需
检测设备也较为昂贵，特别是作为基层检测机构更
难普及。
本研究结果表明，所检样品中带 ＧＦｋＶ 的比率
为 ６２􀆰 ５％ ，具有较高的带毒率，ＧＲＳＰａＶ 和 ＧＶＡ 的
带毒率也在 ２５􀆰 ０％以上，说明该 ３ 种病毒在新疆葡
萄种植区存在较为普遍，且所检样品中 ＧＲＳＰａＶ 和
ＧＦｋＶ、ＧＦｋＶ和 ＧＶＡ 均出现混合侵染。 ＧＲＳＰａＶ 新
疆分离株扩增得到的复制酶基因在 ＧｅｎＢａｎｋ 中
ＢＬＡＳＴ，与美国分离株 （ ＡＹ３６８５９０ ） 相似度高达
９６􀆰 ５９％ ，未见中国其它地方分离株相关基因片段的
出现。 ＧＦｋＶ 新疆分离株与 ＧＦｋＶ 日本分离株
（ＡＢ２２２８６１）和中国辽宁分离株（ ＪＦ９２７９４２）同源性
分别为 ９１􀆰 ７０％和 ９１􀆰 ０３％ ，而与其它分离株均存在
较大变异。 ＧＶＡ 新疆分离株（ＫＪ８０１８４５）与波兰分
离株（ＪＮ８６０９９７）相似度最高，核苷酸序列同源性为
９３􀆰 ８８％ ， 与 中 国 四 川 （ ＨＱ６７１６５５ ） 和 辽 宁
（ＦＪ４４５２２０ ） 分离株同源性分别为 ９２􀆰 ９２％ 和
８９􀆰 ５３％ 。 表明 ＧＶＡ新疆分离株与其它区域分离株
均存在较大差异，与王建辉等（２０１３）报道的 ＧＶＡ
种群包含不同致病性的变异株，且变异株之间具有
显著的核酸变异性一致。 由此可见，新疆 ３ 种葡萄
病毒分离株与国内其它地域分离株存在较大的遗传
差异，或许是不同地域分离株适应不同环境的结果，
也可能是新疆外来葡萄苗木来源地的不同所致，具
体原因还有待进一步研究。
参 考 文 献 （Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）
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（责任编辑：李美娟）
１８３３ 期 梁巧玲等： 新疆三种葡萄病毒 ＲＴ⁃ＰＣＲ检测及序列分析