全 文 ：第 1卷第 5期
2 0 0 5年 1 0月
南 方 水 产
Sou th China F isheries Science
Vo l.1, No. 5
O c.t , 2005
收稿日期:2005-06-24;修回日期:2005-07-01
资助项目:国家 “ 863” 高技术研究发展计划项目 (2003AA627030)
作者简介:苏天凤 (1969 -), 女 , 副研究员 , 从事渔业生物多样性保护与种质资源保存研究。 E-m ail: lu5555@ sohu. com
通讯作者:张汉华 , E-m ail: zhh502@ 163. n et
研究简报
华南沿海 4个地理群体江蓠的遗传变异分析
苏天凤 , 张汉华 , 吴进锋
(中国水产科学研究院南海水产研究所 , 广东 广州 510300)
摘要:利用 ISSR标记技术对江蓠属的 2个种细基江蓠繁枝变种 (Gracilaria tenuistipitata) 和龙须菜 (Gracilaria
lemaneiform is) 的遗传变异进行了研究。所用的细基江蓠繁枝变种材料分别来自粤东 (6株)、 粤西 (3株)、 北
部湾 (3株)及海南岛 (5株), 龙须菜来自汕头南澳岛。用 6条 ISSR引物进行筛选 , 有 5条可扩增出清晰可辩
条带。这 5条引物共扩增 72条带 , 其中 53条 (73.61%) 表现出多态性。根据 Nei等的遗传相似性系数进行分
析 , 结果表明:除海南种群外 , 同一种群中株间相似性达 1. 000, 无任何变异;海南种群各株间相似性在 0. 899
～ 1.000之间。 4个地理群体的细基江蓠繁枝变种的相似系数在 0. 7955 ～ 0.8764之间 , 北部湾与粤东的江蓠细基
繁枝变种的相似性最高 (S为 0. 8764), 北部湾与粤西的细基江蓠繁枝变种相似性最低 (S为 0.7955)。龙须菜
与细基江蓠繁枝变种 2种间的遗传距离为 0.4630。
关键词:细基江蓠繁枝变种;龙须菜; ISSR;遗传变异
中图分类号:S968. 43+4;Q755 文献标识码:A 文章编号:1673 -2227 - (2005) 05 - 0056 -04
Analysis on genetic diversity of four geograph ical populations of sea
mossGracilaria in the coast of waters south Ch ina
SU Tian-feng, ZHANG Han-hua, WU Jing-feng
( Sou th China Sea F isheries Research Institute, Chinese Academy of F ishery Sciences,
Guangzhou 510300, China)
Abstrac t: ISSR technique was used to investigate the gene tic diversity o f the 2 Gracilaria algae, including 1 stra in G. lem aneiform is
from Nanao Island and 17 stra insG. tenuistipitata var. liui, which came from w estGuangdong w aters (3 stra ins), ea st Guangdongw a-
ter (6 stra ins), Be ibu Gulf(3 stra ins) and H ainai Island (5 stra ins) . O f the 6 ISSR prim ers sc reened, 5 prim e rs cou ld produce
clear bands. A to ta l o f 72 bands we re am plified and 57(79.17%) revea led po lym orphism. The da tawe re used to generate Nei′s sim i-
larity coe fficien t(S). The results show ed:besides the popula tion o f H ainan, the re w asn′t any genetic dive rsity in individuals inte r-
population because their gene tic sim ilarity w ere a ll 1. 000, the gene tic sim ilarity of popu la tion of H ainan w as am ong 0. 899 ～ 1.000.
The gene tic sim ilarity w ere 0. 7955 ～ 0.8764 am ong the fou r geog raph ica l popu la tions ofG. tenu istipitata. The max imum sim ilarity oc-
curred be tw een Beibu Gu lf and East Guangdong wa ters (S =0.8764) . The gene tic distance between G. lemaneiform is and
G. tenuistipitata w as 0.4630.
K ey words:Gracilaria tenuistipita ta var. liui;G. lem aneiform is; ISSR; gene tic dive rsity
第 5期
苏天凤等:华南沿海 4个地理群体江蓠的遗传变异分析
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江蓠属暖水性红藻类 , 大多数为一年生 , 分布于温带 、
亚热带和热带海域。细基江蓠繁枝变种为多年生 , 一年四季
均能生长 , 分布在低潮线以下的水域中 , 是我国华南沿海大
面积栽培的对象 , 其鲜品可鲍养殖的饲料 , 干品用于提取藻
胶。龙须菜多生长在潮间带下部沙沼中到潮下带 , 是提取琼
脂的优良原料。
在真核生物基因组中均存在着由 1 ～ 4个碱基对组成的
简单重复序列 ( sim ple sequence repea t, SSR)。简单序列重复
区间扩增多态性 ( inter-sim ple sequence repea t, ISSR) 是由
Z ietkiew icz等 [ 1]于 1994年创建的 、 在 SSR基础上发展起来的
一种分子标记。它的生物学基础仍然是基因组中存在的
SSR。 ISSR标记根据生物广泛存在 SSR的特点 , 利用基因组
中常出现的 SSR本身设计引物 , 无需预先克隆和测序 , DNA
用量少 , 技术要求低 , 成本低廉。相对于随机引物扩增多态
性 (RAPD)技术 , ISSR则具有更好的稳定性和可重复性 ,
可以提供更为可靠的遗传信息 。其在植物领域中已经广泛用
于重要的农作物如水稻 、 小麦和大豆等的品系鉴定 、 遗传作
图 、 基因定位及遗传多样性分析等 [ 2 - 4] 。但在藻类分析研究
中并不多见 , 本文利用 ISSR技术主要对华南沿海的常见细
基江蓠繁枝变种和龙须菜遗传变异进行了初步研究。
1 材料和方法
1.1 研究材料
研究所用的材料分别来自粤东 (yd, 6株)、 粤西 (yx,
3株)、 北部湾 (bb, 3株) 及海南岛 (hn, 5株 ) 的大鱼
港 , 龙须菜来自汕头南澳岛 ( st, 1株)。带回实验室后先在
自来水下清洗 , 后在蒸馏水中清洗 , 稍干即在解剖镜下观察
以确定没有其它微藻 。
1.2 方法
1. 2.1 基因组 DNA的提取 采用杭州维特洁生物技术有
限公司生产的动 /植物组织细胞基因组 DNA小量纯化试剂
盒 , 按照说明提取基因组 DNA, 所获 DNA稀释 10倍后用于
扩增。
1.2. 2 ISSR的 PCR扩增 ISSR引物由原上海博亚生物技
术有限公司合成 , 其序列见表 1。用于 PCR反应的试剂购自
宝生物工程 (大连) 有限公司。 PCR反应在德国 B IO-M etra
T1The rmocyc ler PCR仪上进行。 PCR反应总体积为 50 μL,
其中 10×Ex Taq Buffe r 5μL, Ex Taq po lyme rase 0. 3μL (1.5
U), dNTP (2.5 mm ol L - 1) 4 μL, 10 pmo l μL - 1引物 2μL,
1 μL模板 DNA, 其余为灭菌蒸馏水。扩增条件为:94℃预
变性 5 m in, 之后进行 32个循环 (94℃ 50 s, 48℃ 2 m in,
72℃ 2 m in), 引物 P4和 P6的复性温度为 50℃, 最后 72℃
延伸 7 m in。
1.2. 3 ISSR产物的检测 扩增产物经 1. 5%TAE琼脂糖
凝胶中电泳 , 在英国 Syngene公司的 G enG en ius全自动凝胶
成像分析系统照像。
1.2. 4 数据分析 统计 ISSR扩增条带的有无 , 强带和可
重复出现的弱带记为 1, 否则为 0。采用 Ne i等的计算法 S =
2N xy / (N x +Ny) 计算两两材料间的相似性系数 ( sim ilarity
coefficient), 其中 N xy为材料 x和 y共有的条带 , N x和 N y 分
别为材料 x和 y各自的条带数 [ 5] 。 P 为遗传距离 , 按公式 P
=1 -S计算。
2 结果与讨论
2.1 基因组 DNA扩增结果
所用 6条引物分别来自龙须菜 [ 6] 、 串珠藻 Batrachosper-
mum boryanum 的 ISSR序列 [ 7]以及江蓠 G.gracilis的 SSR序
列 [ 8] 。除 1条引物扩增带模糊未扩增出条带外 , 其它引物扩
增带清晰。由于 5条引物在除海南岛外种群中扩增情况完全
相同 , 因此将各个种群的 DNA混合后扩增 , 扩增情况见表 1。
从引物 P1扩增电泳 (图 1) 可知 PCR扩增条带大小在
0.30 ～ 3. 0 kb之间 。不同引物在所有材料中的扩增条带总数
不同 , 5条引物的扩增条带总数从 3条到 21条不等。 引物
P1扩增条数最多 , 其次为 P3, 最少为 P4。
表 1 引物序列及扩增结果
Tab.1 The sequences and am plif ied resu lts of 5 prim ers
引物
prime r
序列
sequence
扩增位点数
no. of bands
多态位点数
no.o f po lym orphicbands
多态位点比例 /%
p ropo rtion o f po lym orph icbands
P1 (GA)7GT 21 17 80.95
P2 (GA)7AC 15 13 86.67
P3 (CA)6GG 19 14 73.68
P4 (GT)6CC 3 3 100.00
P5 (GAA)6 14 6 42.86
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第 1卷
图 1 引物 P1 (左)和 P2 (右) 的扩增图谱
0. 空白对照;M. DNA标记
F ig. 1 Am plified bands of prim er P1 ( le ft) and P2 ( righ t)
0. b lank contrast;M. DNA m arker
2.2 数据分析结果
根据 p=多态性扩增片段数 /扩增片段总数 , 计算出 5
份材料间的多态性位点比例为 73. 61%, 其相似性系数及相
对遗传距离见表 2。
数字矩阵对角线下的数据表示遗传距离 , 数字矩阵对
角线上的数据表示遗传相似性系数。将此结果用 NJ方法进
行处理 , 得到图 2所示的聚类结果。
表 2 5种江蓠材料间的遗传相似性系数和相对遗传距离
Tab. 2 G ene tic sim ilar ity ind ices and relative gene tic am ong 5 Gracilarias
样品 samp les st yy bb yd hn
st - 0.4938 0.4578 0. 5366 0. 6588
yy 0.5062 - 0.7955 0. 8050 0. 8046
bb 0.5422 0.2145 - 0. 8664 0. 8043
yd 0.4634 0.1950 0.1336 - 0. 8132
hn 0.3412 0.1954 0.1957 0. 1868 -
图 2 用 NJ法构建的 5种江蓠亲缘关系图
F ig.2 Rela tionships among 5Gracilarias based on N J me thods
3 讨论
本实验利用 ISSR技术对细基江蓠繁枝变种种内及不同
地理种群间与龙须菜的遗传变异进行了研究 , 发现除海南
种群外 , 其它群体种内各株间相似系数均为 1.000, 说明细
基江蓠繁枝变种种内的遗传多样性极小。 但是不同地理群
体间的遗传变异较大 , 遗传变异最大的发生在北部湾与粤
西群体之间 , P 值达 0.2145。据葛颂等引用的文章 , 认为
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苏天凤等:华南沿海 4个地理群体江蓠的遗传变异分析
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以无性繁殖为主的植物由于每个无性集群在大部分位点上
都是纯合的 , 形态变异也很小 , 因此遗传多样性水平较低 ,
但不同的无性集群之间都有很大或明显的差异 , 这是因为
遗传变异分布在无性集群之间 [ 9] , 本文的结论与之十分相
符 , 也与以下等人的研究结果相符。徐涤等 [ 10]利用 RAPD
技 术 对 条 斑 紫 菜 ( Porphyra yezoensis) 和 坛 紫 菜
(P.haitaneusis) 的遗传变异进行研究 , 认为青岛海区的野
生条斑紫菜品系与日本的养殖品系之间的遗传距离甚至大
于与坛紫菜养殖品系之间的遗传距离 , 据此认为地理环境
会造成紫菜的遗传差异。杨锐等 [ 11]也认为不同的环境因素
是造成坛紫菜遗传变异的主要因素。据本实验的研究结果
也可以得出造成细基江蓠繁枝变种遗传差异最主要的因素
是地理环境。分析海南种群较其它种群具有较高的遗传多
样性的原因 , 极有可能是因为海南岛较其它地方高温的缘
故。在热带 , 高温使得生物的生殖力增高 , 突变率亦增多 ,
因而生物种类和生物遗传多样性增加。 苏天凤等 [ 12]利用
RAPD技术研究发现海南的合浦珠母贝种群高于其它地理
种群的遗传多样性。刘必谦等 [ 13]认为温度是造成牡蛎种群
遗传多样性的主要原因 , 但卫明 [ 14]等在利用控制区序列分
析环境因子对大石鸡种群遗传结构的影响时认为大石鸡种
群遗传变异与年平均气温负相关 , 说明随环境温度的升高
大石鸡种群遗传多样性反而下降。认为这与大石鸡的起源
有关 , 大石鸡起源于柴达木盆地 , 适于在年平均气温只有 2
～ 4℃生活 , 因此物种的遗传多样性与温度正相关否还与物
种本身的起源环境有关。
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