全 文 ：Marine Sciences/Vol.24, No.2/2000 9
龙须菜藻红蛋白亚基基因的克隆及监测*
CLONING AND DETECTING OF SUBVUNIT GENE OF PHYCO-
ERYTHRIN OF Gracilaria kemaneiformis
隋正红 1 张学成 1 孔 杰 2
(1青岛海洋大学生命学院 266003)
(2中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛 266071)
关键词 龙须菜 ,藻红蛋白 ,基因
龙须菜(Gracilaria kemaneiformis)是红藻门江篱属
中一种重要的产琼红藻 , 具有巨大的潜在经济价值 。
红藻以藻胆蛋白为捕光色素[1 ] , 藻胆蛋白主要由藻红
蛋白(phycoery thrin , PE)、藻蓝蛋白(phycocyanin , Pc)和
别藻蓝蛋白(allophycocyanin ,APC)组成 。PE直接产于
光合作用 , 是第一级天线捕光色素 , 对藻体生理活动
有重大影响 , PE还可作为光合生物进化的标志 , 在实
际应用中 , 由于其优良的荧光特性 , 被广泛用作标记
物质 。另外 , 其光吸收区位于叶绿素 a不能吸收的蓝
绿光区 (498～ 565 nm), 可利用高等植物不能利用的
光能[ 2 ] , 如能通过藻红蛋白基因的导入而将高等植物
的光合作用器加以改造 , 使其光吸收范围扩大 , 可以
更好 、更充分地利用光能 , 将大大地促进高等植物的
生长发育 ,提高农作物的产量。
关于藻红蛋白亚基基因结构的研究 , 多在原核
蓝藻中进行 。在真核红藻中 , 仅见在 Aglaothamnion 、
Polydiphonia和 Rhodella 三个属分离出藻红蛋白亚基
全基因并进行序列沉淀的文章 。对江蓠属藻红蛋白基
因的研究国内外均未见报道 。而这方面的研究对了解
藻类光合进化 ,阐述光和作用机制均有重要意义 。
作者根据 Gene Bank中的藻红蛋白基因序列资
料 , 设计合成了引物 , 经过 PCR扩增反映 , 得到了预
期长度的片段 ,将 PCR产物用 dT克隆法插入载体 ,并
进行了检测 。
1 材料与方法
1.1 材料
野生型龙须菜采自青岛湛山湾;材料处理及培
养见文献[ 3] 。引物由中科院海洋所合成;Taq酶购自
中科院微生物研究所 , dNTP 、蛋白酶 K 、pGEM5zf(+)
质粒购自华美生物工程公司 ,其他药品均为分析纯 。
1.2 方法
1.2.1 DNA 提取 参照 Goff等 1988年的方
法 ,略有改动 。
取 30 ～ 300 mg藻体 , 用蒸馏水洗净 。加入大约
700 ～ 1 000 μl 提取液 0.5 % S D S , 0.01 mol/ L
Tris.HCl , 0.1 mol/L EDTA , pH8.0在 0 ℃冰浴中充分
研磨后 , 加蛋白酶 K(终浓度 100μg/ml), 在 50 ℃水
浴简短震荡 3.5 ～ 4 h 。15 000 r/min离心 10 min ,取上
清液 , 加等体积的酚抽提 , 15 000 r/min离心 10 min ,
取上清液 , 再以酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)及氯仿
抽提 , 1 500 r/min离心 10min ,取上清液 ,加入二倍体
积的无水乙醇使 DNA沉淀 , 离心 , 用 70 %的乙醇洗
沉淀两次 , 干燥后 , 溶解在 50μl无菌 TE(10 mol/L
Tris ,0.1 mol/L EDTA ,pH8.0)中 。 -20 ℃储存备用 。
1.2.2 PCR扩增条件 50μl反应体系中加入
正反向引物 P1 、P2各 1μmol/L ,Mg2 +3μmol/L , Taq酶
1μl 。
循环参数为 95 ℃80 s , 52 ℃120 s ,70 ℃80 s , 30
循环 ,最后于 72 ℃充分延伸 10min。
1.2.3 低融点琼胶糖法回收特异 PCR产物[4 ]
1.2.4 dT载体构建与 PCR产物连接
* 国家自然科学基金资助项目 39670405号。
收稿日期:1998-08-25;修回日期:1999-04-27
实验与技术
EXPERIMENT＆ TECHNIQUE
海洋科学/2000年/第 24卷/第 2期10
以 ECORV酶切载体 pGEM5zf(+),酶切完全后 ,
沉淀质粒 ,溶解于 10μl ddH2O 中 ,取 3μg加入 dTTP2
mmol/L、Taq酶 3 ～ 4μl , 10xPCR缓冲液 ,在 70μl反应
体积中 , 70 ℃反应 2 h ,加 T于平末端 ,反应完成以后
以酚 、氯仿抽提 ,乙醇沉淀 dT载体 。在 10μl连接体系
中加入 10 x连接缓冲液 , dT载体 200 ng , PCR产物
500 ng 及 T4DNA 连接酶 6Weiss单位 , 16 ℃反应过
夜 。
1.2.5 质粒转化 、细菌培养 、质粒提取见文献
[ 4] 。
2 结果与讨论
2.1 DNA的提取
结果见图 1 ,以蛋白酶 K法提取的 DNA有很好的
完整性 , “拖带”(smeer)区域少 ,这是保证有效扩增的
必要条件 。DNA多集中于 23K处 ,但实际上其分子量
不止 23K , 这是由于制备凝胶孔径原因 , 超过凝胶分
离范围后的分子量指示便不准确了 。经 260 nm紫外
吸收测定 DNA的含量约 30 μg/g藻湿重 。据 Pedro
1992年报道藻类 DNA的提取是在液氮中进行的 , 这
样可以充分破碎细胞 , 释放 DNA , 又能抑制细胞内源
性 DNA酶的活性 。由于条件所限 ,改用 0 ℃冰浴的充
分研磨 ,也可起到相同的作用。在此藻体 DNA提取方
法中 ,加入蛋白酶 K后的震荡非常重要 ,这样既能使
图 1 蛋白酶法 K提取龙须菜 DNA
1 , 2:龙须菜 DNA , 3:λDNA/EcoRI+HindIII)
酶充分作用又可加快作用速度 。需注意的是最后
DNA的溶解 , 溶解 TE中 EDTA的浓度不要超过 0.1
mmol/L ,否则会在PCR反应体系中带入过多 EDTA而
抑制 Taq酶活性 ,必要时可用双蒸水溶解 。
在操作过程中 ,要注意动作要轻 ,尤其是抽提时 ,
不要剧烈震荡 ,以防止对 DNA大分子的机械剪切 ,破
坏其分子完整性 。
2.2 PCR反应
结果见图 2 , 作者得到了专一的扩增条带 , 扩增
产物的分子量约为 710 bp左右 , 与估计的分子量大
小一致 。有关核红藻 PE基因序列的资料较少 , 仅有
仙菜(Aglaothamnion)、多管藻(Polysiphonia)和紫球藻
(Rhodella)三种藻的基因序列 ,且与龙须菜不同属 。这
三个序列的保守性较高 ,根据这仅有的三个序列合成
了引物得到了扩增 , 而且分子量的大小与预期相近 ,
说明真核红藻 PE序列是很保守的 。
图 2 PCR扩增结果
1:扩增产物 2:λDNA/EcoRI+HindIII
在这种基因克隆性质的 PCR反应中 ,特别要注意
扩增循环中的退火温度 , 应尽可能地高 , 如作者的反
应中 ,引物的 Tm值为 58 ～ 60 ℃,采用了超过 50 ℃的
复性温度 ,只有这样才能保证 PCR产物的专一性 。否
则 , 若用较低的复性温度 , 即使得到与估计分子量大
小相近的 PCR产物 ,也不能有十分的把握 ,这是特异
产物 。
2.3 产物的回收
将 710 bp带用低熔点琼脂糖法回收 。虽然得到的
是单一的扩增条带 , 还是应该纯化产物;如果不是单
一的扩增条带 ,则更应该回收分子量在某一范围内的
条带 。
熔点琼脂糖法是比较好的 DNA回收方法 , 回收
率比较高 。在紫外灯下切出含 DNA条带胶条时 ,应使
不含 DNA的胶区尽可能少 , 否则在以后的抽提过程
实验与技术
EXPERIMENT＆ TECHNIQUE
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实验与技术
EXPERIMENT＆ TECHNIQUE
中 ,琼脂会吸附一部分 DNA ,使回收产率下降 。
而在最后的溶解回收产物时 , 应用小体积 , 以提
高 DNA浓度 ,在反应中 ,将 250μl PCR扩增的回收产
物溶解在 10μl ddH2O中 ,估计 DNA浓度高于 0.1μg/
μl ,这样才能有较多的扩增片段连接到载体上 。
2.4 dT载体构建及产物连接
粒载体 pGEM5zf(+)以 ECOR V酶切以产生平末
端 ,然后在 Taq酶作用下产生 dT载体 。结果见图 3 ,由
结果可见 ,未酶切质粒由于是超螺旋 ,迁移率大 ,在酶
切后变成线状分子 , 移动速度变慢 , dT载体的分子量
与原线状载体分子量差不多 。
DNA片段与载体的连接可有多种形式 ,其中包括
平末端的连接 , 但其效率较低 , 尤其是理论上应该是
平末端的 PCR产物与平端载体的连接更低 , 究其原
因是在于 , Taq酶有在 PCR产物的末端优先添加 A的
性质 ,因而发展了 dT载体技术 ,即在产生的平末端载
体后加 T ,则正可起类似粘端连接的作用 , 据Marchuk
1990年报道连接效率极大地提高了 。
在实验中采取了这种连接方式 ,得到了较高的连
接效率 ,平均达到 20 %,即在每 5个转化菌落中就有
一个是连接了外源 DNA片段的转化子 。因而这是一
种比较有效的克隆 PCR产物的新方法 , 值得推广应
用 。
另外在连接反应中 , 需注意连接反应的体积 , 作
者采取了 10μl连接体积 ,并采用 DNA片段量大大超
过 dT载体量的反应条件 , 这样才能使 DNA片段有最
大的可能连接到载体上 。
图 3 dT载体的构建
1:dT载体 , 2:λDNA/Hind Ⅲ ,3:酶切后 pGEM5zf(+),
4:未酶切PGEM5zf(+).
2.5 检测
将连接产物转化入感受态的 JM109 ,在加了氨苄
青霉素 、X-gal 、IPTG的培养基上进行选择 , 由于α-互
补作用 , 白色菌斑便有可能为重组子 。总共得到了 3
个白斑菌落 , 对它们进行扩增培养提取质粒后 , 与空
载体一起电泳 , 发现它们的分子量的确增大了 , 估计
是插入了外源片段 , 作者又用 PCR方法进行了检测 ,
结果见图 4 , 由图 4可见 , 3个白色菌落中的两个在同
样的扩增条件下得到了单一扩增 , 且分子量大小与从
原基因组扩增得到的相同 ,而空载体没有得到扩增 。
进一步测序结果也说明我们得到了重组子 ,有关序列
测定及分析将另文报道 。
图 4 PCR扩增检测重组子
1.2:重组质粒子的 PCR扩增 , 3:λDNA/EcoRI+Hind Ⅲ .
3 结论
本文报告了从龙须菜克隆藻红蛋白亚基基因的
操作过程 。据红藻藻红蛋白亚基基因保守序列合成引
物 , PCR扩增 , 以 dT载体法克隆回收的产物 , 并用
PCR方法检测假定重组子 , 证实这是一种可行的克隆
基因方法 。
参考文献
1 曾呈奎、周百成。进化论选集。北京:科学出版社 , 1983。
34～ 43
2 张学成等。青岛海洋大学学报 , 1996, 26:318～ 326
3 金冬燕等译。J.萨姆布鲁克等著。分子克隆。北京:科学
出版社 , 1992。 16～ 322
4 Geider , R.J.et al..Algal Photosynthesis.New York:
Chapman and Hall , 1992.125～ 156
(本文编辑:张培新)