全 文 ：[研究简报 ]
无胶筛分芯片电泳研究贝类
毒素-软骨藻酸与寡聚
DNA的相互作用
周小棉1, 2 , 李大志1, 3 , 沈　铮1 , 刘　伟3 , 李桂茹4 , 林炳承1
( 1. 中国科学院大连化学物理研究所 , 大连 116023;
2. 广州医学院附属广州市第一人民医院检验科 , 广州 510500;
3. 大连海关分析测试中心 , 大连 116001; 4. 大连医科大学附属第二医院 , 大连 116023)
关键词　无胶筛分芯片电泳 ; 相互作用 ; 软骨藻酸 ; 双链 DN A
中图分类号　 O657　　　　文献标识码　 A　　　　文章编号　 0251-0790( 2005) 07-1252-03
收稿日期: 2004-09-14.
基金项目: 国家自然科学基金 (批准号: 20275039)、国家自然科学基金重点项目 (批准号: 20035010)、 国家自然科学基金重大项目
(批准号: 20299030)及中国科学院仪器研制专项基金资助 .
联系人简介: 林炳承 ( 1944年出生 ) ,男 , 研究员 ,博士生导师 , 从事毛细管电泳和芯片实验室研究 . E-mai l: bclin@ dicp. ac. cn
近年来 , 我国日趋严重的赤潮已给海洋渔业带来了极大的损失 , 也对人类的健康构成威胁 . 赤潮
毒素可对海洋养殖产生严重的污染 , 食用贝类所富集的贝类毒素严重损害食用者身体健康 . 根据其中
毒症状 , 贝类毒素被分为 4大类: 引起腹泻性中毒 ( Diarrhetic Shel lfish Poisoning , DSP)的贝类毒素 ;
引起麻痹性中毒 ( Pa raly tic Shellfish Poisoning , PSP)的贝类毒素 ; 引起神经性中毒 ( Neuro to xic
Shellfish Poisoning , N SP)的贝类毒素以及引起记忆缺失的贝类毒素 ( Amnesic Shellfish Poisoning,
Scheme 1　 Chemical structure of domoic acid( DA)
ASP) . 而软骨藻酸 ( Domoic Acid, DA)是引起记忆
缺失的贝类毒素中的一种 . 它是 1987年加拿大爱
德华王子岛发生一系列食物中毒事件的主因 [1 ] . 软
骨藻酸是一种溶于水且具有强烈神经毒性的非蛋白
氨基酸类物质 , 它是由长链羽状硅藻代谢产生的 ,
其结构如 Scheme 1所示 .
以往对贝类 DA的研究主要集中在对这种毒素的检测 , 而近年的研究发现 , DA主要与中枢神经
系统中神经细胞的 N -甲基 -D-天冬氨基酸受体结合 [2 ] . Rue等 [3 ]发现 , DA能与金属离子铁、 铜结合 .
但是 , 目前对 DA与 DNA的作用了解较少 , 尚未见文献报道 . 我们用无胶筛分芯片电泳研究了 DA与
序列为 3′-GCAT TGGTTGACGT TGCA-5′双链 DNA的相互作用 , 结果表明 , DA对双链 DNA有断
裂作用 . 这一结果为人们认识 DA的毒理作用提供了新的参考 .
1　实验部分
1. 1　 试 剂 与 仪器 　 软 骨藻 酸 ( Domoic acid, DA )购 于美 国 Sigma 公 司 . 序 列 为 3′-
GCAT TGGT TGACGTTGCA-5′和 5′-CGTAACCAACTGCAACGT-3′互补的 DNA链由大连宝生物
工程有限公司合成 . 无胶筛分溶液为 pH= 8. 5, 100 mmo l /L Tris [ t ri s(h ydro xymethy l) methylamine,
Sigma ] , 100 mmo l /L硼酸 , 2 mmo l /L EDT A, 2. 0%羟甲基纤维素 ( Hydroxyprolymethy l cellulose
HPMC, 50 cps. Sigma ) . SYTOX Orange核酸染料购于美国分子探针公司 ( Molecula r probes,
Eugene, O R) . DN A进行在线标记 , 其染料与无胶筛分溶液混匀 , 其浓度为 1μmol /L.
自行设计与研制的芯片分析仪由一体化的芯片电泳平台、 光学检测、 CCD监测、 电源和软件操作
Vol. 26 高 等 学校 化 学 学 报 　 No. 7　
2 0 0 5年 7月 　　 　　　　　 CHEM ICAL JO URN AL OF CHIN ESE UNIV ERSITIES　　　　　 　　 1252～ 1254　
系统等部分组成 . 激光器为 532 nm半导体泵浦固体激光器 . 其详细情况参见文献 [4～ 6]. 微流控芯片
为自制注塑型三通道聚甲基丙烯酸甲酯 ( PMM A)芯片 [7, 8 ] ; 芯片通道长 5. 24 cm、宽 75μm、 深 30μm;
进样体积 177 n L.
样品准备: DN A单链用 10 mmol /L Tris-50 mmo l /L NaCl-1 mmo l /L EDTA buf fer( pH= 8. 5)缓
冲液按摩尔比稀释 . 取等体积的两条 DNA单链混合后 , 在 96℃水浴中退火 6 min. 取出自然冷却至
室温 3 h , 备用 . 用二次蒸馏水将双链 DNA稀释至 0. 1μmo l /L.
1. 2　实验过程　分离电压为 130 V /cm , 由正极至负极 , 抑制电压为 340～ 400 V /cm, 时间为 220 s;
进样电压 400 V /cm, 由正极至负极 , 时间为 30 s; 芯片在使用前用二次蒸馏水冲洗干净 , 再灌注电泳
缓冲液 , 同时将样品加入样品池中 , 尽量保持各池中液面高度一致 . 每次电泳完毕后 , 吸出各池中液
体 , 然后用二次蒸馏水冲洗通道 5 min.
2　结果与讨论
由图 1可见 , 双链 DNA( 18 bp)峰随 DA浓度的增大而降低 , 且有新的峰生成 , 表明 DA与 DNA
有相互作用 . 从 50μg /mL和 5μg /mL DA与 DNA反应 60 min后的情况分析 (图 1) , 50μg /mL DA
作用后生成了 2个比 18 bp DN A小的 DNA( 2个新峰 ) , 说明高浓度的 DA可使 DNA发生断裂 , 而变
成短链 . 从反应时间看 , 在 50μg /mL DA作用下 , 随着作用时间的延长 , DN A峰高逐渐降低 , 而新生
成的 2个峰的峰高亦有所下降 , 但变化不显著 (图 2) .
Fig. 1　 Electropherograms of dsDNA mixed with
dif f erent mass concentrations of DA
d( DA) /(μg· mL- 1 ): a. 0; b. 50; c. 5.
Fig. 2　 Electropherograms of dsDNA mixed with
50μg /mL DA at dif ferent reactive time
a. 10 min; b . 60 min; c. 90 min; d . 120 min.
Fig. 3　 Electropherograms of dsDNA mixed with
5μg /mL DA at diff erent react ive time
a. 10 min; b . 60 min; c. 90 min; d . 120 min.
5μg /mL DA与 DNA作用的情况与高浓度时
的情况相似 , 唯一不同之处是新生成的峰由一个渐
渐转变成 2个 , 在 120 min后最为明显 , 这有利于
认识 DA与 DNA相互作用的过程 (图 3) . 因本实
验采用的方法为无胶筛分芯片电泳 , 所以 DN A是
按其大小进行分离的 , 最先被检测到的是较小的
DNA, 随后是较大的 DNA分子 . 表明 DA对双链
DNA有断裂作用 . 因此 DA的毒理作用可能包括
DA对 DNA的这种损伤作用 .
本文实验结果表明 , DA与 18 mer ds DN A存
在着强相互作用 , DA对双链 DNA有断裂作用 , 这
为人们进一步认识 DA的毒理作用提供了实验依
据 . 无胶筛分芯片电泳作为分析 DNA相互作用的方法不仅具有快速、简单、 方便的特点 , 而且具有样
品用量少、 分析时间短、 分析灵敏度高等优势 , 是一种研究相互作用的新方法 .
1253No. 7 周小棉等: 无胶筛分芯片电泳研究贝类毒素 -软骨藻酸与寡聚 DN A的相互作用 　　　
参　考　文　献
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[ 2 ]　 Berman F. W. , M urray T. F. . Journal of Neurochemis t ry[ J ] , 1997, 69: 693— 703
[ 3 ]　 Rue E. , Bruland K. . Marine Chemis try [ J ] , 2001, 76: 127— 134
[ 4 ]　 ZHOU Xiao-Mian(周小棉 ) , DAI Zhong-Peng(戴忠鹏 ) , LIN Bing-Ch eng(林炳承 ) . Chem. J. Chines e Universi ties(高等学校化
学学报 ) [ J ] , 2004, 25( 3): 336— 340
[ 5 ]　 ZHOU Xiao-Mian(周小棉 ) , LIU Da-Ru (刘大渔 ) , ZHON G Yun-Tao(钟润涛 ) et al . . Elect rophoresis [ J ] , 2004, 25, 3032—
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[ 6 ]　 ZHO U Xiao-Mian(周小棉 ) , DAI Zhong-Peng(戴忠鹏 ) , LUO Yong(罗　勇 ) et al . . Chem. J. Chinese Universi ties(高等学校化
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[ 7 ]　 ZHOU Xiao-Mian(周小棉 ) , DAI Zhong-Peng(戴忠鹏 ) , LUO Yong(罗　勇 ) et al . . China Patent [P] , ZL02 353 129. 0, 2003
[ 8 ]　 ZHOU Xiao-Mian, DAI Zhong-Peng, LUO Yong et al . . Journal of Separat ion Science[ J] , 2005, 28: 225— 233
Interaction Between Domoic Acid and Double-Stranded Oligodeoxy-
nucleotide Studied by Using Microchip-based
Non-gel Sieving Electrophoresis
ZHOU Xiao-Mian
1, 2 , L I Da-Zhi
1, 3 , SHEN Zheng
1 , L IU Wei
3 , L I Gui-Ru
4 , LIN Bing-Cheng
1*
( 1. Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China;
2. Department of Clinical Laboratory , Guangzhou First Municipal People′s Hospital ,
Aff iliated of Guangzhou Medical College , Guangzhou 510500, China;
3. Dalian Customs Laboratory , Dalian 116001, China;
4. The Second Aff iliated Hospital , Dalian Medical University , Dalian 116023, China)
Abstract　 The interaction betw een domoic acid( DA) and 18-mer double-stranded DN A( dsDN A) w as
investigated by using microchip-based non-gel sieving electrophoresis. For the 18-mer dsDN A with a
sequence of 3′-GCAT TGGT TGACGT TGCA-5′, th e amount of f ree dsDN A decreases wi th the
increase of the added DA and also w ith the increase of reactiv e time. Meanwhi le, the new ly-produced
tw o peaks w ere observed. The experimental results show that there is a strong interaction betw een
DA and the 18-mer dsDN A. DA makes the deg rada tion of the 18-mer dsDN A. The non-gel sieving
electrophoresis on microchip is a rapid, convenient, highly sensitiv e method for studying the
interaction betw een DN A and small molecules.
Keywords　 Microchip non-sieving elect rophoresis; Interaction; Domoic acid; 18-mer dsDN A
( Ed.: K, G)
1254　　　 高 等 学 校 化 学 学 报 Vol. 26