全 文 ：生命科学与实验研究
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研究目的:
本研究涉及中药复方制品及生物医药领域,探讨一种牛樟芝深
层发酵复方制品及制备方法。
背景技术:
牛樟芝简称“樟芝”,学名为Antrodia Camphorata,俗名牛樟
菇、红樟芝、樟内菇、樟菇、血灵芝等。野生牛樟芝唯一赖以为生的宿
主----台湾牛樟树（Cinnamomum kanehirai),牛樟树为台湾独
有之原生珍贵树种,生长在海拔四百五十至二千公尺之间,牛樟芝
生长于老龄牛樟树干腐朽的中空内部或倒伏树干的潮湿表面。,生
长期在每年六至十月,子实体形态多变化,有板状、锺状、马蹄状或
塔状;初生时鲜红色,渐长变为白色、淡红褐色、淡褐色或淡黄褐色。
牛樟芝气芳香味辛苦、平。牛樟芝含有许多的生理活性成分,如多糖
体、三萜类化合物、超氧歧化酶、腺苷、蛋白质（含免疫蛋白)、维生素、
微量元素、核酸、凝集素、氨基酸、纤维素、血压稳定物质等。牛樟芝的
有效成分中以多糖和三萜类化合物为最特别,是其他菇菌无法相比
的。樟芝在子实体阶段多醣体含量,约2%,具有免疫生理活性、预防
及控制肿瘤等生理活性,主要含β-D-glucan（β-D-葡聚糖))其作
用是透过激发巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞以及自然杀手细胞
等来增强免疫功能,进而达到抗肿瘤的效果。牛樟芝多糖体中有强
心、降血压、降血糖、抗血栓等功效。由于牛樟芝在台湾被视为独特
一种牛樟芝深层发酵复方制品的制备方法研究
郭震宇 1 郭耀荣 1 吴松刚 2 黄建忠 2 林金科 3
(1.福建华尔康生物科技有限公司 福建福州 350015;2.福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心 福建福州 350108;3.华
尔康生物药物研究所 福建福州 350015)
摘要:目的 探讨一种牛樟芝深层发酵复方制品的制备方法。方法 选择以茯苓粉、山药粉、葛根粉、蜂花粉、大豆粉等原料配制深层发酵培养
基,经深层发酵培养富含牛樟芝多糖的牛樟芝菌丝体发酵液,与采用超临界CO2技术提取、酶解、分离、过滤、浓缩制得的佛手、黄精、枸杞、砂仁、
椇余甘子、枳 子等中草药提取液复合。结果 配制为一种牛樟芝深层发酵复方制品。结论 该方法优化了牛樟芝多糖等活性成分的含量,具有产量高、
时间短、成本低,可以工业化生产,而且高效环保,具有开发应用前景。
关键词:牛樟芝 深层发酵 培养基 复方制品 制备方法
中图分类号:Q93 文献标识码:A 文章编号:1674-2060(2016)04-0003-02
Study on A Preparation Method of Antrodia
Submerged Fermentation Compound
Product
Abstract: Objective To investigate a preparation method of Antrodia submerged fermentation compound product. Methods Use the raw materials including
poria powder, yam powder, arrowroot powder, bee pollen powder, soybean powder to prepare the submerged fermentation culture medium, by which cultivate
polysaccharide-rich Antrodia mycelium fermentation broth, and then compound it with bergamot, Huang Jing(polygonatum), Chinese wolfberry, Amomum,
emblica, Hovenia as well as other herbs extracts obtained through extraction, enzymatic isolation, filtration and concentration with supercritical CO2 technology.
Results Prepare a compound product of Antrodia submerged fermentation. Conclusion This approach optimizes the content of Antrodia polysaccharides and
other active ingredients, with advantages such as high yield, short preparation time, low cost, access to industrialized production, efficient and environmental
friendly. It has both development and application prospects.
Key Words: Antrodia; submerged fermentation; culture medium; compound product;preparation method
成分 多糖体 总三萜 蛋白质 维生素 可溶性膳食纤维
含量 2.3 16.6 3.4 1.6 16.5

表 1 天然牛樟芝主要成分及含量 （g/100g 干重)
成分 多糖体 总三萜 蛋白质 维生素 可溶性膳食纤维
实施例1
发酵液
5.6 1.8 2.5 1.7 13
实施例 2
发酵液
6.0 1.5 2.6 1.8 14
实施例 3
发酵液
6.2 1.6 2.6 1.6 12

表 2 牛樟芝发酵液主要成分及含量 （发酵液浓度 Brix=18.0-
20.0%,g/100ml)
成分 多糖体 总三萜 蛋白质 维生素 可溶性膳食纤维
实施例1
发酵液干粉
28.0 9.0 11.5 5.5 43
实施例 2
发酵液干粉
30.0 7.5 13.0 5.8 44
实施例 3
发酵液干粉
31.0 8.0 13.0 5.6 42

表 3 牛樟芝发酵液制成干粉主要成分及含量 （g/100g 干重)
成分 多糖体 总三萜 蛋白质 维生素 可溶性膳食纤维
实施例 1
中草药提取液
4.8 0.9 2.8 2.6 16
实施例 2
中草药提取液
4.6 0.8 2.8 2.5 18
实施例 3
中草药提取液
4.8 0.8 2.7 2.8 19

表 4 中草药提取液主要成分及含量 （浓度 Brix=18.0-20.0%,
g/100ml)
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而珍贵的药用真菌,因此具有极高的研究和商业价值,也是目前台
湾最昂贵的野生真菌,在港澳被称为“神芝”,台湾民间称之为“森林
中的红宝石”。由于牛樟树遭大量砍伐,以致濒临绝种,已被台湾列
为珍宝级保育树种。
制备方法与结果
本研究重点为一种牛樟芝深层发酵复方制品的制备方法。该制
备方法步骤实施是:以茯苓粉、山药粉、葛根粉、蜂花粉、大豆粉、酵
母粉、葡萄糖、磷酸氢二钾、硫酸镁等配制深层发酵培养基,营养全
面,能不断补充氮源、碳源,能有效满足牛樟芝菌丝体生长对营养的
需求,提高获得大量菌体与代谢产物,大幅提高多糖体等有效活性
成分的含量经深层发酵培养富含牛樟芝多糖的牛樟芝菌丝体发酵
液,与采用超临界CO2技术提取、酶解、分离、过滤、浓缩制得的佛手、
椇黄精、枸杞、砂仁、余甘子、枳 子等中草药提取液复合配制而成复
方制品。本方法的优点是优化了牛樟芝多糖等活性成分的含量,具
有产量高、时间短、成本低,可以工业化生产。
1、 一种牛樟芝菌的深层发酵的培养基:深层发酵培养基的原
料按重量百分比:茯苓粉1.5%、山药粉1.5%、葛根粉1.5%、大豆粉2.
0%、蜂花粉2.0%、葡萄糖3.0%、酵母粉0.3%、硫酸镁0.2%、磷酸氢二
钾0.3%、氯化钠0.2%,余量:水,pH:5-7,粉末:80-100目。
2、 一种牛樟芝深层发酵复方制品的制备方法。制品配方:牛樟
芝多糖体发酵液50%、中草药提取液佛手10%、黄精10%、枸杞10%、余
甘子10%、砂仁5%、蜂王浆5%。
3、 制备工艺步骤
（1)菌种:台湾牛樟芝菌种。
（2)培养基:
斜面培养基:马铃薯煮汁1000ml、葡萄糖20g、琼脂20g、蛋白胨
20g、硫酸镁0.2%,pH自然;
深层发酵培养基（按重量百分比):茯苓粉1.5%、山药粉1.5%、葛
根粉1.5%、大豆粉2.0%、蜂花粉2.0%、葡萄糖3.0%、酵母粉0.3%、硫
酸镁0.2%、磷酸氢二钾0.3%、氯化钠0.2%,余量水,pH:5-7,粉末:
80-100目。
（3)发酵工艺流程:

斜面菌种 摇瓶种子 种子罐 发酵罐 发酵产物
5-7d


酶解 均质处理 膜过滤

26-28℃
2-3d
200目 50-55℃
1-2h
2-3d 2-3d
26-28℃
4.发酵培养条件
①将接种的斜面放于26-28℃下培养5-7d,菌丝体长满斜面;
微带白色;
②将长满菌丝体的斜面接种于500ml三角瓶盛200ml液体培养
基,于摇床180r/min转速下,26-28℃振荡培养2-3d,长满白色的菌
丝;
③种子罐种子培养,按种量10%-15%、温度26-28℃,光照条件:
连续黑暗条件,搅拌速度150-180r/min,无菌空气通气量为每分钟
1:0.5v/v,min,罐压0.04-0.05Mpa,发酵培养40-48h;pH降至3.
5-4.0之间,菌丝体发酵培养成熟。
④发酵培养:接种量15-20%,温度26-28℃,搅拌速度为150-
200r/min,无菌空气通气量为每分钟1:0.5v/v,min,罐压0.04-0.
05Mpa,培养40-48h。发酵液变稠,菌体开始自溶,pH降至3.5-4.0,
残糖量降至0.3%左右,菌丝体发酵成熟即为发酵终点结束。
⑤酶解:加入复合蛋白酶和0.5%,淀粉酶0.5%,蛋白酶为2×
105u/kg,淀粉酶为1.0×105u/kg,纤维素酶为1.5×105u/kg。温度
保持在50-55℃,酶解浸提2-3h。
⑥均质处理:经酶解处理的牛樟芝发酵液先经胶体磨均质,旋
转磨转速800-1000r/min。使菌丝体等物料颗粒崩解,,达到均质,再
经高压均质机（40Mpa-60Mpa),使发酵液在高压作用下通过200目
膜过滤。
天然牛樟芝与牛樟芝发酵液主要成分检测对照表
5、制备中草药提取液:采用超临界CO2萃取、酶解、超滤、浓缩
制成中草药提取液。
其制备方法与步骤:
前处理: 椇精选合格的佛手、黄精、茯苓、枳 子、余甘子、枸杞、砂
仁等中草药原料分别进行粉碎,细度为3-5mm,按配方配比投入提
取罐中,加水1:10,浸泡3-5小时,采用超临界CO2萃取。萃取条件为:
萃取釜压力为24-30Mpa,萃取温度60-80℃,Ⅰ级分离釜压力为8-
10Mpa,Ⅱ级分离釜压力为6-8Mpa,CO2流量为120-150L/h,收集
萃取后的提取液,离心分离:转速2000-3000r/min,时间为6-
10min,得萃取液。
余下萃余物（余渣)采用复合酶解提取:将萃余物（药渣)按料液
比1:10加纯净水,调pH值为4.5-6.0,温度60-80℃,浸煮6-12h,然
后降温至50-55℃,加入纤维素酶进行酶反应1-2h,再加入淀粉酶进
行酶解反应时间为1-2h。该酶解过程采用超声辅助条件下进行。超
声波频率为25-30KHz,纤维素酶的酶活力为2.5万u/g,酶用量为萃
余物重量的1.0-1.2%;淀粉酶的酶活力为1万u/g,酶用量为萃余物
重量的1.0-1.2%。酶解反应之后,将料液升温至100-110℃,灭酶3-
5min,然后料液用膜过滤方式,滤液备用,得酶解提取液。
6、浓缩液调配牛樟芝复方口服液制品
将牛樟芝菌深层发酵提取液、中草提取液、酶解提取液混合均
匀,注入低温真空浓缩罐中浓缩,在真空度为0.09Mpa下,减压浓缩
至可溶性固体物含量为10%-12%,浓度Brix=20.0-23.0%,冷却至
室温,加入5%蜂王浆,搅拌均匀,均质处理,调配pH5.0-6.0,用
30ml、50ml、100ml、250ml棕色瓶罐装。
7、牛樟芝复方固体制品
将牛樟芝菌深层发酵提取液、中草提取液、酶解提取液混合均
匀,注入低温真空浓缩罐中浓缩,在真空度为0.09Mpa下,减压浓缩
至可溶性固体物含量为10%-12%,浓度Brix=20.0-23.0%,进行冷
冻干燥、制粉,加入5%蜂王浆干粉,再混合,制粒,整粒、制成颗粒剂
或压片包装。干燥失重≤5.0
研究结论
一种牛樟芝深层发酵复方制品的制备方法研究,选择以茯苓
粉、山药粉、葛根粉、蜂花粉、大豆粉等原料配制深层发酵培养基,经
深层发酵培养富含牛樟芝多糖的牛樟芝菌丝体发酵液,与采用超临
界CO2技术提取、酶解、分离、过滤、浓缩制得的佛手、黄精、枸杞、砂
成分 多糖体 总三萜 蛋白质 维生素 可溶性膳食纤维
生产批次1 5.2 1.35 2.65 2.15 14.5
生产批次2 5.3 1.65 2.7 2.15 16.0
生产批次3 5.5 1.6 2.65 2.20 15.5

表 5 牛樟芝深层发酵复方液体制品主要成分检测 （浓度
Brix=18.0-20.0%,g/100ml)
成分 多糖体 总三萜 蛋白质 维生素 可溶性膳食纤维
生产批次1 10.9 3.3 2.85 4.6 19.0
生产批次2 11.5 2.9 2.80 3.9 21.0
生产批次3 11.9 3.0 2.85 3.8 20.5

表 6 牛樟芝深层发酵复方固体制品（颗粒剂、片剂)主要成分
检测 （g/100g 干重)
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2.2 两种方法染色结果对比
iNOS、eNOS和nNOS的染色结果阳性反应均呈棕黄色(图1)。
NOS主要表达在细胞质内,及少量细胞膜和细胞核内。图中因睾丸
组织结构复杂,eNOS染色组经过复染,而iNOS和nNOS组未经过复
染,但也能观察到组织结构。各试验组中,SP法与ABC法相比较,在
染色背景相同的情况下,SP法蛋白染色结果显得更清晰,其中nNOS
试验组中两种方法均存在非特异性染色。
3 讨论
免疫组化技术是利用已知的特异性抗体或抗原特异性结合的
特点, 通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂通
过借助显微镜的观察, 从而在抗原抗体结合部位确定组织细胞结
构的一门组化技术。免疫组化标准化染色技术是一项实验性很强的
技术。现行的免疫组化染色法除了ABC法和SP法外,还有Envision、
Elivision TM和Maxvision TM法。这三种方法是在前两种方法的
基础上发展起来的,使用起来操作简便,速度更快,比较适合医院临
床标本的检测[3]。它们的敏感性比较现在还存在争议,所以ABC法和
SP法做为传统的方法现在还在广泛使用,尤其在教学和科研中。
ABC法和SP法相比较哪种方法更优,也存在争议。由于整个免
疫组化过程步骤较多,标本组织来源不同, 细胞分化不一, 抗原含
量不等, 显色反应所需时间不可能完全一致等因素会使得各种染
色方法都存在优劣之分。本实验中每步按操作要求严格操作,实验
过程由一人单独操作。另外,实验标本选择的组织切片之间相差不
超过3片,使染色组织标本之间具有可比性;所使用试剂除ABC复合
物和HRP标记的链酶亲和素不同外,其它均为同一批配制的相同试
剂,使得方法之间也具有可比性。本实验显示,检测不同组织中
NOS,SP法明显优于ABC法。
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椇仁、余甘子、枳 子等中草药提取液复合, 配制成一种牛樟芝深层
发酵复方制品。该方法优化了牛樟芝多糖等活性成分的含量,具有
产量高、时间短、成本低,可以工业化生产,而且高效环保,具有开发
前景。
检测标准与方法:
(1)多糖体（以葡萄糖计),苯酚-硫酸法。
(2)总三萜（以熊果酸计),紫外分光光度测定法。
(3)蛋白质（以干基计,N×6.25),采用GB5009-2010标准检测。
(4)维生素,采用HPLC高效液相色谱法GB5009.82-2003标准
检测。
(5)可溶性膳食纤维,采用GB/T5009.88标准测定方法。
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