全 文 ：第 1 2卷 遗传学专辑 云南大学学报 (自然科学版 )
成的蛋白质 , 过氧化物酶作为连接环境作用与代
谢的一个重要酶类 . 在微重力胁迫作用下其活性
和同工酶组成发生 了变化 , 也应该是植物对环境
变化作出的一种反应 。
单胞藻视紫红质的免疫荧光定位
米玉 兰 1 ,
( 1
. 中国农科院作物所 、 北京
P
.
H e g ema
n
nZ
100 0 8 1 ; 2
. 德国马普生化所 , D 一 80 33 )
无论是单细胞的低等植物 , 还是多细胞 的高
等植物 , 都要从 自然界获取光和微量钙离子 , 把
太阳能变成生物能 (A T P ) , 把 aC Z + 变成具有生
物活性的复合钙调蛋白 ( aC Z + · CaM )
, 进而启动
DN A 的合成 、 有丝分裂的发生等细胞生命活动 。
视紫红质 ( r h司 o iSP n) 与视觉密切相关 , 过去一
直被认为仅存在于人和动物眼晴视网膜棒状细胞
内。 视紫红质在植物界 的发现 , 不仅揭示 了勾通
植物细胞与 自然界的 “ 光钙通道 ” , 连接细胞分裂
周期与生理节律的秘密 “ 键 ” , 显示 着 24 h 一个
周期的守 时蛋白或生理植物钟 , 控制着 A T P ,
叭M P 和 。 2 十 · aC M 的生化效应的 “ 遥控器 ” , 而
且找到了通过控制植物细胞生 化反应 “ 遥控器 ”
或 “拨 ” 生理植物钟的方法 , 达到控制植物细胞
分裂周期并操纵植 物细胞生命活动之 目的的理论
依据。
在 “ 绿藻铁硫蛋白 ( fr xB ) 的免疫荧光定位 ”
等 3 篇论文在国际刊物上发表的同时 (张玉兰等 ,
19 a3
,
b
, 。
)
, 于 1 99 2 年第一作者开 始 r 题为 “ 绿
藻视紫红质的免疫荧光定位 ” 研究项 目 , 该项 目
包括 : 视紫红质的提取和纯化 , 相应抗体的制备
及免疫荧光细胞学鉴定 3 部分研究内容 。 根据第
一作 者申请的德 国 D入虹又23 号项 目设计方案 ,
第二作者 ( 1 9 93) 提取 /纯化 了这个最高光吸收值
为 4 9 5 ~
, 分 子 量 为 32 K l ) 的光 捕 获蛋 白
(几 t e i n of e a p t u r i n g l ig h t ) , 并制备成相对应的抗
体 ( a n t i 一 r hdo o 哪 in a n t i l沮刃y ) 或视紫红质特异探
针 ( r h司 o p s in pobr e s ) 。
应用 “ 铁硫蛋白免疫荧光定位技术 ” , 利用与
视紫红质相对应的抗体 , 对绿藻细胞周期中各个
特定时间点上的视紫红质的形态 、 大小 、 位置进
行 了分析 。 结果发现 : ( 1) 已经提取 /纯化的这个
光捕获蛋白是视紫红质 , 也就是说 , 已经制备的
这个抗体是与视紫红质相对应的抗体 。 ( 2) 这个
分子量为 32 K D , 最高光吸收值为 4 95 nt 的视紫
红质位于绿藻色素眼点附近的质膜上 , 而在叶绿
体和眼点消失的白藻中 , 它依然存在于质膜上 。
它是一个氨基在质膜外 、 梭基在质膜内 、 跨质膜
7 次 、 能 “ 移动 ” 的糖蛋白 ; ( 3) 在光 /暗 ( 12 h/
12 h) 周期 中 , 其同步化营养细胞的视紫红质形
态 、 大小及其位置的变化都准确显示着 24 h 一个
周期 , 特别是位置呈 “ 时针 ” 规律变化 。 在光期 ,
亲代视紫红质所显示的荧光标记从大变小 , 从多
变少 , 从有变无 , 从挂钟 “ 12 点位置 ” 移到 “ 6
点位置 ” , 即从叶绿体前部移到细胞表面的赤道
区 , 最后到达叶绿体后部 ; 在暗期 , 随着细胞分
裂过程的发生 , 子代视紫红质所显示 的荧光标记
从小变大 、 从少变多 、 从挂钟 “ 6 点位置 ” 移到
“
12 点位置 ” , 即从叶绿体后部移向卵裂面相对着
的位置 , 最 终到达靠近细胞核或鞭毛基体区域。
这个 “ 移动 ” 或守 时蛋 白 ( t ime k e eP i n g p ort e in )
准确地显示着 2 4 h 一个周期 。 ( 4) 在雌雄配子交
配的过程中 , 视紫红质的变化规律与 fr xB 蛋白质
的变化规律 几 乎完全 一致 (张玉 兰 , 19 92 和
19 93 )
。 雌雄配子相互混合 10 而 n 后 , 来 自父母
双方的视紫红质显示 在一个含有 2 个细胞核 、 2
个淀粉核 、 2 个叶绿体和 4 根鞭毛的初级合子中 ,
与原来的雌雄 配子视紫红质没有太多区别 。 大约
Z h 后 , 来 自父母双方的视紫红质几乎融合在一
起 , 并重新显示出母系遗传现象。
该研究为 “ 眼虫藻生物钟控制点的细胞 /分子
学机制 ” 研究 (张玉兰 , K . oG t o) 的成功奠定
了基础。 19 98 年 12 月 , 国内外报纸纷纷转载 了
“ 美国科学促进会评选出 1 998 年世界十大科学发
云南大学学报 (自然科学版 )第 1 2卷 遗传学专辑
现 ” 报道 , 其中第一项就是 “ 细胞生物钟的发
现 ” 。 如今 , 我们的细胞生物钟研究已经进人 了分
子学机制的阶段 。
基金项目 : 此项研究为德国 D A A D 4 23 号资助项 目,
中国 95农 18 02 和中国农科院刃 301 一 9 号资助项 目。
低能离子注入的拟南芥菜遗传变异效应
的 R A P D 分析研究初报
陈冬花 , 张根发
(北京师范大学生物系 , 北京 10 08 75)
近年来 , 低能离子注人作为一种新型诱变技
术在作物改良方面应用较多 , 离子注人对农作物
的增产效应已经在某些作物的研究中得到 了证实 ,
尤其是在水稻 、 小麦 、 棉花等作物的研究上 已经
取得 了很多成果 。 研究表明 , 离子注人突变率高 ,
对于其引起的突变 , 在细胞学上 已经有一些证据 ,
例如 , 根尖及花粉母细胞中染色体行为的变 化 ,
出现落后染色体 , 染色体桥等 。 但是分子水平上
的证据不多。 拟南芥菜作为生物学研究中的模式
物种 , 有生长期短 , 遗传背景清楚等优点 , 本实
验就是要通过对它的研究阐明离子注人诱变的机
理。 实验选用 了 R A卫D 方法从分子水平证明 」’ 低
能离子注入所引起的突变 。
19 8 年 12 月在北京师范大学低能所用氮离
子注入拟南芥菜种子 , 能量 为 10 0 ke V , 剂量从
10 13 到 s x 101 5 io sn/ c澎 不等 。 处理后 即进行种
植 , 对处理后 的种子进行萌发实验表明 : 经离子
注人的种子萌发率比正常对照有所下降 , 但是不
同处理之间也不相同 , 101 3 , 47 % ; 101 4 , 30 % ;
5 又 20 1 4 , 3 3 % : 10 15 , 4 3 % ; 正常 , 5 4 % 。 经 T
检验 , 差异显著 。 这说明萌发率的差异是由于离
子注人引起的 。
对于突变体的鉴定 , 用的是 R A卫D 方法。 这
种方法以传统 P C R 为基础 , 不同之处是所用引物
为 10 个碱基序列随机的引物 。 基本程序如下 : 模
板 D N A 的提取 , P C R 反应 , 电泳。 P C R 反应体
系 中各 反应物浓度经 摸索确定为 : d N T P s Z 0 0
拼
mo l / L
; M解12 2 . 0 m mo l/ L ; 模板 D N A 20 n g ;
引物 0 . 3 拜 mo 丫;L aT q 酶据来源不同用量不同
0
.
4 一 I U 。 反应程序如下 : 94 ℃ 5 而 n ; 94 ℃ 1
而 n ; 35℃ 30 5 , 4 0℃ 30 5 , 4 5℃ 30 5 , 72 ℃ 2
而 n ; ( s e y e les ) 94℃ 30 5 , 3 5℃ 45 5 , 40℃ 4 5 5 ,
4 5℃ 4 5 。 , 7 2℃ 2而 n ; ( 4 0 。y e les ) 72℃ 10 而n o
这个程序有 3 个退火湿度的程序 , 这样既保证了
引物与模板的充分结合 , 又尽量避免 了碱基间的
错配 。 P C R 产物在 1 . 4 % 的琼脂糖胶中电泳 , 紫
外灯下观察记录结果。
实验中建立 了 3 个基因池 (随机抽取正常 6
株 , s x l o `3 5 株 , 10 ` 5 6 株 ) 共筛选 了 175 个引
物 , 其中一些引物中出现了差异带 , 这些条带的
统计结果如表 1。 另外 , 在单株及第二代的分析
中也出现 一了差异带。
表 i 低能离子注入的拟南芥菜 MI D N A
基因组 R八卫D 分析结果
剂 量 引物数量 条带总数 差异带数 D N A变异频率 / %
s x 10 1 3 178 8 7 9 6 7 7 7
10 1 5 178 9 10 9 5 10
,
4
在初步的实验探索过程中 , 证明离子注人确
实可以引起突变 , 并可从分子水平上被鉴定出来 。
从获得的实验结果还可 以看出 : 离子注人对植物
的诱变有剂量效应 , 10 15 处理高于 5 x 10。 。 我们
将在此基础上对 M , 是行更深人的研究 , 同时对
映 也要跟踪分析 , 以期对离子注人的诱变效应有
更进一步的 了解 。
基金项目 : 此项研究为国家自然科学基金资助重大项
目。