全 文 ：第 42卷 第 3期 海 洋 与 湖 沼 Vol.42, No.3
2 0 1 1 年 5 月 OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICA May, 2011

* 国家自然科学基金项目 , 40776064 号 ; 教育部长江学者与创新团队项目 , IRT0734 号 ; 教育部博士点基金项目 ,
200816460002号; 宁波市重大科技项目, 2006C100030号; 宁波科技计划项目, 2007A31004号。刘宝宁, E-mail:liubaoning@126.com
① 通讯作者: 周成旭, E-mail: zhouchengxu@nbu.edu.cn
收稿日期: 2010-04-01, 收修改稿日期: 2011-03-08
几种菱形藻及其近缘种分类界定的比较研究*
刘宝宁 刘 晨 周成旭① 吴小凯 孙 雪 徐继林
(应用海洋生物技术教育部重点实验室 宁波大学 宁波 315211)
提要 菱形藻是较常见的羽纹硅藻类, 其中一些种类的外部形态十分相似, 差异细微, 很难从经
典形态分类的角度准确区分, 造成此类微藻在分类地位上的混乱。作者综合利用经典形态分类方法、
ITS(Internal transcribed spacer sequences)序列分析方法以及基于脂肪酸甾醇的化学分类多种方法, 对
4 株从形态观察初步确定为菱形藻及其近缘种类的野外采集样品以及在分类上仍存分歧的小新月菱
形藻(Nitzschia closterium f. minutissima)和三角褐脂藻(Phaeodactylum tricornutum), 进行了几种易混
淆种类界定的差异比较研究。结果显示, 基于多种方法的微藻种类鉴定, 能获取比单一鉴定方法更多
的鉴定信息, 并且几种方法能获得比较一致的结果; 分别明确了野外水样中的四株微藻品系的分类
地位 , 其中的 3 株分别为拟尖刺菱形藻 (Pseudo-nitzschia pungens Hasle)、柔弱拟菱形藻
(Pseudo-nitzschia delicatissima)、新月筒柱藻(Cylindrotheca closterium), 但另外一株仅能确定为细柱
藻属的一种, 仍不能鉴定到种。分析结果还表明, 小新月菱形藻应属于舟形藻目, 褐指藻科, 褐指藻
属, 这与之前有学者报道的结果一致。
关键词 菱形藻, 近缘种, 分类, 比较研究
中图分类号 Q949.27
海洋微藻不仅构成了全球物质循环和能量流动
的重要环节, 而且, 在人类活动中扮演了举足轻重的
作用: 新能源开发、赤潮灾害与防治、全球气候变化
等等(殷明焱等, 2009; 刘静雯等, 2010)。微藻的结构
相对简单, 但种类繁多, 细微的形态结构差别就形成
了不同的生态位和生态作用 , 既造成了对微藻分类
的困难, 也说明了对微藻精确分类的必要。实践证明,
仅依赖硅藻的形态特征为主要依据的经典分类 , 不
仅工作繁复, 分类标准难于精确定位, 而且难于区分
形态一致但生态作用完全不同的种类。
随着研究技术以及生物化学和分子生物技术研
究的不断进步, 在经典形态分类学的基础上, 形成了
基于生化物质差异的化学分类法和典型基因分析为
基础的分子生物学分类方法 , 多种方法的综合利用
为疑难种及易混淆种类的界定提供了可能。徐继林等
(2007)对微藻的脂肪酸和甾醇的聚类分析研究发现 ,
微型藻类的化学分类方法是微藻分类学的一个很好
的补充。通过多种分类方法的结合, 对众多经典分类
难于区分或不能区分的种类进行准确定位 , 是现代
分类学的研究目标和任务。
菱形藻是羽纹硅藻纲中分布广泛的一大类群 ,
该类硅藻的许多种类具有几乎相似的外部形态特征,
从而造成很多种类的分类歧义。在 Grethe(1994)将拟
菱形藻从菱形藻中分成独立一属之前 , 拟菱形藻是
作为菱形藻中的亚属。石娟等(2008)利用分子生物学
方法分析小新月菱形藻 (Nitzschia closterium f.
minutissima)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)
以及新月筒柱藻(Cylindrotheca closterium)发现, 小新
月菱形藻并不属于菱形藻属, 而应属于褐指藻属, 并
且极有可能是三角褐指藻的一个藻株。陆开宏等
(2001)在进行三角褐指藻培养的过程中也发现, 三出
的三角褐指藻在培养过程中有时会出现梭形细胞。两
352 海 洋 与 湖 沼 42卷
者似乎存在生理状态相关的同种易形。同样, 李海涛
等(2007)测定了野外水样中两株形态上与新月筒柱藻
和长菱形藻(Nitzschia longissima)相似的微藻的 18S
rRNA 和 rbcL 基因, 并结合形态学特征判断两株微
藻均归属于筒柱藻属。另外, 高杨等(2005)认为同属
于拟菱形藻属的种类 , 一些赤潮有毒种和无毒种的
区分也相当困难。
基于多种分类方法的综合应用 , 作者就不同来
源的几株初步鉴定为菱形藻及其近源种的微藻分类
和种间差异进行了比较研究。通过形态学观察、ITS
序列分析、基于脂肪酸及甾醇特征的聚类分析等方法
的综合应用 , 建立了几种微藻种类鉴定和种间差异
的相关资料, 并且, 在比较和探讨多种分类方法结果
的基础上 , 就微藻的分类方法学问题以及菱形藻及
其近源种易混淆的种类鉴定问题进行了讨论。
1 材料和方法
1.1 藻种来源与培养
藻种来源于宁波大学微藻种质室。室内保种的藻
类培养在 f/2 培养液中, 均为单种培养。除特别说明
外 , 用于检测的微藻均是经新鲜培养液重新活化培
养至指数生长期时取样的。
野外样品分别分离自浙江沿海水样和大西洋水
样, 通过光学显微镜观察初步确定为菱形藻类, 在本
文中编号分别为: NSP、NATO、NC、PN。除 PN的
培养温度为 25℃外, 其他藻及其他激活培养条件均
为: 20℃, 4000—5000lx(L:D = 12h:12h)。
室内保种样品为小新月菱形藻 (N.closterium f.
minutissima, NFC) 和 三 角 褐 指 藻 (P.tricornutum,
PTB)。由于小新月菱形藻与三角褐指藻分类界定尚存
歧义, 所以, 本研究中将三角褐指藻也作为被研究种
类之一。温度 18℃, 光照 2000 lx, L:D = 12h:12h。
1.2 细胞形态观察
将单种培养生长活跃的微藻细胞用于显微观察。
在光学显微镜(Olympus BX60)下进行活体和固定细
胞的观察和拍照。扫描电镜观察的样品处理方法(邢
小丽等, 2007)为: 离心收集生长到指数期的微藻, 加
入等体积的甲醛固定 24 h, 水洗 3至 4次, 之后加入
1 倍体积的浓硝酸和 3 倍体积浓硫酸, 置于 100℃沸
水中水浴 3 min 至硅藻细胞中的有机物被完全氧化,
用蒸馏水多次水洗至中性后制片 , 自然晾干或在红
外灯下烘干后喷金 , 利用扫描电子显微镜 (日立
S3400 ) 进行扫描电镜观察和拍照。
1.3 ITS序列测定
1.3.1 DNA的提取 取 1.0 ml对数生长期的藻细
胞, 6000 r/min离心 8 min收集藻体。按照 UNIQ-10
柱式细菌基因组 DNA 抽提试剂盒(上海生工)的使用
说明提取藻细胞基因组 DNA。最后用 30 μl洗脱液进
行 DNA的洗脱。
1.3.2 PCR 扩增与检测 ITS 扩增所用引物 P2,
5′-GTAGGTGAACCTGC(AG)AAGGATCA-3′ 和 P4,
5′-CGACA(TG) ATGCTTAA(AG)TTCAGC(AG)GG-3′,
分别对应于 18S rDNA 3′末端和 24S rDNA 5′末端区域。
PCR扩增在 GeneAmp PCR system 5600( Perkin
Elmer)中进行。总反应体积为 20 μl, 其中模板 DNA
为 2 μl, Mg2+ 浓度为 1.5 mmol/L, 各 dNTP浓度为 0.2
mmol/L, 引物浓度为 0.2 μmol/L, Taq酶 1单位。PCR
扩增程序为 94℃, 预变性 5 min, 然后按照 94℃变性
50 s, 50℃复性 1 min, 72℃延伸 1 min的程序进行 30
个循环, 循环结束后 72℃延伸 8 min。在 1.0%的琼脂
糖凝胶电泳, 在紫外透射分析仪上观察结果。
1.3.3 PCR 产物的回收与克隆 用 BioSpin Gel
Extraction Kit试剂盒(杭州昊天)进行 PCR产物的回收,
将回收的 PCR产物与 pMD 18-T载体连接后转化感受
态 E.coli JM109。挑选白色菌落用通用引物对进行
PCR扩增以检测重组子。
1.3.4 测序与序列分析 将扩增培养后的重组菌
落送去测序(上海生工 英骏公司)。
1.4 脂肪酸甾醇检测
1.4.1 实验器材
1.4.1.1 试剂 标准甾醇、三氟双(三甲基硅烷基)
乙酰胺 (BSTFA)购自美国 SIGMA-ALDRICH 公司 ,
正己烷、氯仿为美国 TEDIA公司产色谱纯试剂, 14%
BF3-CH3OH溶液为美国ALLTECH公司, 色谱纯正己
烷为美国 TEDIA 公司, 甲醇、氯仿、二氯甲烷、乙
醚、无水硫酸钠、氢氧化钾均为国产分析纯。
1.4.1.2 仪器 QP2010 气相色谱-质谱分析仪(日
本 SHIMADZU公司), 30 m ×0.25 mm×0.25 μm SPB-50
色谱柱 (美国 SUPELCO 公司 ); 冷冻干燥机 (美国
LABCONCO公司)。另外, 国产旋转蒸发仪、旋涡混
合仪、高速分散匀质机、高速离心机、水浴锅、电子
天平等。
1.4.1.3 样品 藻种在 2500 ml的锥形瓶中进行扩
增培养, 每天定时摇动 8次, 取样跟踪细胞密度变化,
3期 刘宝宁等: 几种菱形藻及其近缘种分类界定的比较研究 353
当种群生长处于对数生长后期或平台期时 , 4000
r/min 下离心收集, 冷冻干燥, 20℃温度下充氮冷冻
保存。
1.4.2 样品分析 称取 20 mg左右的微藻干品, 参考
Bligh等(1959)法提取总脂; 总脂提取后加入 2 ml 5%—
6% 氢氧化钾甲醇水(体积比为 4∶1)溶液, 充氮气 1
min, 密封, 60℃水浴皂 2 h, 冷却, 皂化液加 15 ml饱
和氯化钠溶液 1 ml, 再用 HCl(1∶1)调 pH小于 1; 氯
仿和正己烷(体积比为 1∶4)6 ml分 3次提取, 加入 1 g
无水硫酸钠吸水 12 h, 旋转蒸发仪真空干燥, 加入
100 μl过量 BSTFA, 密封, 60℃水浴 2 h, N2吹干, 正
己烷定容, 进行 GC-MS分析。
1.4.3 定性定量分析和数据处理 根据GC-EIMS-
TIC 中各组分的离子碎片质量谱图, 通过对 NIST 库
和 WILEY 库检索并参考脂肪酸和甾醇标准谱图进行
鉴定。用面积归一法计算各脂肪酸、甾醇的百分组成。
每种微藻平行培养 3次, 每个样品平行测定 2次,
取均值进行统计处理。以所测定的每种脂肪酸、甾醇
的相对含量作为变量 , 欧几里德距离平方 (Squared
Euclidean distant)作为聚类统计量, 应用统计分析软
件(SPSS16.0)中分层聚类方法分析。
2 结果
2.1 细胞形态的差异比较
本文中作者研究的 6 种微藻品系, 除 NFC(小新
月菱形藻)和 PTB(三角褐脂藻)为实验室长期培养种
外, 其余均为野外水样。基于 4种野外微藻的光学显
微镜和扫描电镜的细胞形态学特征 , 结合文献资料
(金德祥等, 1965 a,b), 初步将 NSP和 PN归为拟菱形
藻属(Pseudo-nitzschia), NATO 和 NC 归为筒柱藻属
(Cylindrotheca), 通过细胞形态特征方面的观察和比
较分析, 明确差异和相似性所在。
2.1.1 NFC 和 PTB NFC 细胞纺锤形, 中央膨大,
两端渐尖 , 朝同一个方向弯曲似月牙形 ; 细胞长约
12 μm, 宽 2—3μm。PTB具有卵形, 梭形和三出放射
形三种不同的形态 , 这三种形态在不同的环境条件
下可以转变。在正常的液体培养的条件下, 多是三出
放射形细胞和少量的梭形细胞 , 这两种形态都没
有硅质的细胞壁(金德祥等, 1965 a,b)。三出放射形细
胞臂长约 6—8 μm。梭形细胞长约为 10 μm, 中央宽
约 3 μm, 向两端渐狭(图 1:e)。光学显微镜下观察,
NFC 细胞和 PTB 培养液中的梭形细胞形态上很相似
(图 1e、f)。


图 1 6种微藻品系的光镜和电镜照片
Fig.1 LM and SEM photos of the 6 microalgal strains
a. PN的电镜照片; b. PN的光镜照片; c. NSP的电镜照片;
d. NSP的光镜照片; e. 三角褐脂藻(Phaeodactylum tricornutum,
实验室编号为 PTB)的光镜照片; f.小新月菱形藻(Nitzschia
closterium f. Minutissima, 实验室编号为 NFC)的光镜照片;
g. NATO的光镜照片; h. NC的光镜照片（A、B、C、D、E、
F标尺示 10μm, G、H标尺示 20 μm）

2.1.2 PN 和 NSP 光学显微镜下观察生活细胞,
PN和 NSP相邻细胞借壳面均可以连成滑动的细胞链,
PN 长链甚至可以滑动成细胞完全重叠。最大链状伸
张时, PN最少相连部分为细胞长度的 1/5以上(图 1b),
NSP 相连部分为细胞长度的 1/6 以下, 且没有大幅度
的胞间滑动。扫描电镜观察, PN的单个细胞较粗, 宽
354 海 洋 与 湖 沼 42卷
5—9 μm, 龙骨点明显(图 1 a)。NSP细胞较细小, 宽
1.3—3 μm, 没有点条纹(图 1 c, d), 其特征和金德祥
(1965)有关尖刺拟菱形藻 (Pseudo-nitzschia pungens
Hasle)和柔弱拟菱形藻(Pseudo-nitzschia delicatissima)
的描述相似。
2.1.3 NATO和 NC NATO和 NC细胞两端都具
有较长的突出, 且突出向同一方向弯曲, NC 细胞两
端的突出较 NATO细长(图 1 g, h)。光学显微镜下两
者的单个细胞形态十分相似, 很难区分。
2.2 ITS序列相关性分析
根据测得 6种微藻的 ITS序列与 NCBI国际基因
数据库中已录入的硅藻的 ITS序列进行 BLAST比对,
NSP blastn 分值最高的为柔弱拟菱形藻 (Pseudo-
nitzschia delicatissima)、PN为尖刺拟菱形藻(Pseudo-
nitzschia pungens Hasle), 这与形态学上的鉴定结果
一致。NATO 为新月筒柱藻(Cylin-
drotheca closterium); 菱形藻属种、
拟菱形藻属种和新月筒柱藻与 NC
比对得分都很高, 其地位归属需要
进一步讨论。
根据 6株微藻品系的 ITS序列,
并通过 MEGA4 软件中 Pairwise
Distainces 分析得到各品系之间的
遗传距离(表 1)。通过表 1, 比较各
微藻品系之间的遗传距离可以发
现, NSP和 PN、NATO和 NC、PTB
和 NFC 之间的遗传距离很小, 分
别为 0.651、0.637、0.005。说明
NSP 和 PN、NATO 和 NC、PTB
和 NFC 的 ITS 序列的相似性非常
高, 亲缘关系很近。
将 6种微藻的 ITS基因序列与
NCBI 国际基因数据库中已录入的
部分硅藻的 ITS序列资料进行比较,
用 ClustalX4.0软件对 DNA序列进
行排列, 通过 MEGA4 软件包作系
统分析, 得到包括被研究藻种在内
的 25 种硅藻品系的最小临近法聚
类树(图 2)。
从系统树的分布来看 , 同一
门的微藻聚在同一簇中, 拟菱形藻
属的品系(PN、NSP)聚集在硅藻门
的同一簇中, 这一分类结果与传统
表 1 6 株微藻品系之间的遗传距离
Tab.1 The degree of genetic distance between the pairs of the
six microalgal strains
微藻 NSP PN NATO NC NFC PTB
NSP — — — — — —
PN 0.651 — — — — —
NATO 0.983 1.271 — — — —
NC 0.967 1.050 0.637 — — —
NFC 1.212 1.322 1.394 1.196 — —
PTB 1.216 1.327 1.383 1.200 0.005 —

分类学在属一级的分类一致。PTB 和 NFC 与基因库
中的 EF553459.1 (Nitzschia closterium f. Minutissim)
和 EF553458.1 (Phaeodactylum tricornutum)聚为一簇,
靴带支持率为 99%。同时发现 NC的分类位置仍然较
为模糊, 虽然与筒柱藻属的两个微藻品系(FJ864278、
AF289049)聚为一簇, 但是靴带支持率并不高。



图 2 基于微藻品系 ITS序列构建的最小邻近法聚类树
Fig.2 Phylogenetic relationship of the studied strains based on the ITS sequences
information
3期 刘宝宁等: 几种菱形藻及其近缘种分类界定的比较研究 355
2.3 脂肪酸甾醇检测结果及分析
2.3.1 微藻中脂肪酸鉴定 根据 1.4.2的检测方法,
分别检测了 NSP、NATO、NC、NFC、PTB、PN 的
脂肪酸相对含量。从 6 株微藻中共鉴定出 34 种脂肪
酸(表 2)。 其中, 饱和脂肪酸有 12种, 单不饱和脂肪
酸有 7 种, 多不饱和脂肪酸有 15 种。每种微藻都有
其特定的脂肪酸组成 , 甚至同一种的不同品系之间
也会有很大的差别(Alonso et al, 1992; Renaud et al,
1995; Volkman et al, 1989)。有些微藻的某种脂肪酸的
表达含量很高, 比如: C16:1(n-7)在 PTB和 NFC中的
百分比含量分别为 28.21%和 24.78%, 而在另外 4 种
微藻中该脂肪酸的检测含量相对较低。但是只针对于

表 2 各微藻品系脂肪酸的检测结果(占脂肪酸总含量的百分比)
Tab.2 Results of the fatty acid analysis in the microalgal strains (percentage of the total fatty acids)
序号 脂肪酸 PTB NFC NC NATO NSP PN
1 C12:0 — — 0.15 — — —
2 C13:0 — — 0.5 — — —
3 C14:0 8.21 6.17 10.41 9.96 23.24 31.51
4 C15:0 — 0.24 0.7 0.31 0.73 6.41
5 12Me-C15:0 — — — 0.38 — 1.41
6 13Me-C15:0 — — 3.55 0.85 2.16 0.62
7 C16:0 17.99 12.61 8.86 9.59 7.78 —
8 14Me-C16:0 — — 2.6 0.7 — —
9 C16:1(n-5) 3.58 1.29 — — — —
10 C16:1(n-7) 28.21 24.78 0.89 4.45 — 4.12
11 C16:1(n-9) — — 15.12 17.07 31.52 24.1
12 C16:2(n-4) 7.04 5.22 5.35 5.03 2.3 2.53
13 C16:2(n-6) — 1.12 2.71 — 5.66 —
14 C16:3(n-3) 7.95 6.93 — 10.25 — 8.2
15 C16:3(n-6) — — 7.2 — 4.47 —
16 C16:4(n-3) — 1.76 — — — —
17 C18:0 0.75 0.84 1.01 0.41 0.81 0.59
18 C18:1(n-7 ) 1.87 1.38 — — — —
19 C18:1(n-9) 0.99 1.03 11.93 2.78 10.18 1.74
20 C18:1(n-11) — — 1.73 — 1.25 —
21 C18:2(n-6) — 0.79 1.02 — 0.69 —
22 C18:3(n-6) — — 4.88 3.03 — —
23 C18:3(n-3) — — — 0.91 — —
24 C18:5(n-3) — — — 1.52 — —
25 C19:1(n-9) — — 2.13 — 0.87 —
26 3,7,11,15-M-C20:0 — — — — — 3.32
27 C20:4(n-6) — — 3.96 8.49 1.16 0.9
28 C20:4(n-5) — — — — 0.52 —
29 C20:5(n-3) 19.98 28.82 12.82 22.13 3.56 11.55
30 C22:4(n-7) — — — 1.11 — —
31 C22:5(n-3) — 0.81 — — — —
32 C22:6(n-3) 3.14 1.87 2.28 1.03 — 0.28
33 C24:0 — 2.99 0.2 — 0.76 —
34 C26:0 — — — — 1.34 2.72
35 其他类 0.29 1.35 — — — —
注: —表示未检出或检出量极少
356 海 洋 与 湖 沼 42卷
某个脂肪酸的比较具有一定的片面性 , 所以有必要
借助统计分析的手段对 6 种微藻品系的脂肪酸组成
进行聚类分析。
2.3.2 脂肪酸分层聚类分析 以所测定的每种脂
肪酸的相对含量为变量, 欧几里德距离平方(Squared
Euclidean distant)作为聚类统计量, 应用统计分析软
件(SPSS16.0)对微藻进行分层聚类分析。
从脂肪酸的聚类分析树状图(图 3)可以看出, 6株
微藻品系可聚集为 3类: NSP和 PN、NC和 NATO、
PTB和 NFC。在修正距离为 7时, NSP和 PN可以分
开; 在修正距离为 4左右时, NC和 NATO才能分开;
而 PTB 和 NFC 脂肪酸成分组成非常的接近, 两者几
乎不能分开。



图 3 各微藻品系的脂肪酸聚类分析树状图
Fig. 3 Cluster analysis of the microalgal strains based on
the fatty acid analysis

2.3.3 微藻中甾醇(酮) 的鉴定及分析 根据 1.4.2
的检测方法分别检测了 5 种微藻品系(NSP、NC、
NFC、PTB、PN)的甾醇相对含量, NATO的甾醇未检
测。根据各组分的 EI、CI 质谱数据, 并参考文献, 从
5株微藻中(Ghosh et al, 1998; Volkman et al,1997)共
检测到 13 种甾类物质(表 3), 包括 3 种 C27 甾醇、4
种 C28甾醇、6种 C29甾醇和 1种还无法确定出碳数
的甾醇。各甾醇在不同微藻中的分布程度也不一样,
表 3 5 种微藻品系中的甾醇
Tab.3 Sterols identified from five microalgal strains
序号 名称 分子式
1 C27:2(5,22/27Nor,24Me) C30H52OSi
2 C27:1(5) C30H54OSi
3 C27:2(Δ5 ,24) C30H52OSi
4 C28:1(5/24Me) C31H56OSi
5 C28:2 C31H54OSi
6 C28:2(5,24(28)/24Me) C31H54OSi
7 C28:3 (4,7,22/24Me) C31H52OSi
8 C29:0 C32H60OSi
9 C29:1 C32H58OSi
10 C29:1(5/24Ethyl) C32H58OSi
11 C29:1 (5/4, 24 Me) C32H58OSi
12 C29:1 (7/4, 24 Me) C32H58OSi
13 C29:2(5,22/24Ethyl) C32H56OSi
14 Unknown
注: 表示式 Cm: n (Δx/ y)中, m代表甾类化合物的总碳数, n
代表不饱和双键的数目, x表示双键的位置, y表示甲基、乙基或羟
基的位置及数量

有些微藻中只有一种甾醇 , 而有些微藻的甾醇种类
却很丰富。
这些甾醇结构多样, 根据各甾醇结构的不同, 可
把 5株微藻中检测到的甾醇分 4类(表 4): 第一类是 4
位无甲基 Δ5 甾醇, 第二类是 4位无甲基 5位饱和的
甾醇和甾烷醇, 第三类是 4-甲基甾醇和 4-甲基甾烷
醇, 另外一类是未定甾醇。甾醇类化合物占总脂的比
例虽然很低 , 但很多组分都是良好的微藻化学分类
学指标物(Volkman, 2003), 其中 C28:3(4,7,22/24Me)
[为 4 位无甲基 5 位不饱和甾醇(酮)]只有在 PTB 和
NFC 中检测到, 并且在 PTB 中的检测百分比达到了
63.2%, 故 C28:3(4,7,22/24Me)可以作为该藻的特征
甾醇。NSP和 PN中 C27:1(5)、C27:2(Δ5, 24)的检测量
百分比很高, 有可能成为这两种微藻的特征甾醇。

表 4 微藻中的甾醇组成
Tab.4 Sterol composition from different microalgal strains
微藻 4位无甲基 5位不饱和甾醇(酮) 4位无甲基 5位饱和甾(烷)醇 4位甲基甾(烷)醇 未定甾醇
PTB 6(21.2) 7(63.2) — 14(15.6)
NFC 6(81.7), 4(3.3) 7(4.4) 11(4.0),12(6.6) —
NC 2(24.15), 3(13.15), 10(1.08) — — 14(3.58), 8(58.04)
NSP 1(1.41), 2(55.62), 6(27.95) 13(2.94) — — 14(3.2), 5(8.88)
PN 2(41.79), 3(56.93), 10(0.73) — — 9(0.55)
注: 表中各甾醇代码对应表 2中各甾醇序号, 括号中数值为该甾醇占总甾醇的相对百分含量, —表示未检出或检出量极少
3期 刘宝宁等: 几种菱形藻及其近缘种分类界定的比较研究 357
3 讨论
由于菱形藻类形态上的差异细微 , 而且其中有
些差异可能是不同种水平上的差异 , 有些差异只是
地理区域上的差异或者是不同生长阶段形态上的差
异, 并且差异的程度没有一个确定的标准, 因此通过
经典形态分类学的方法对一些易混淆微藻进行鉴定
十分困难。而分子生物技术的介入, 可以通过分析其
遗传物质的差异并结合形态学的研究来确定其分类
地位(程金凤等, 2007)。由于 ITS有着较快的变异率,
多态性高, 因此它成为了属间、种间特别是种内水平
上进行系统分类的一个优良的分子标记 (Connell,
2001; Adachi et al, 1996)。但是该方法却极大地依赖
基因库中检索资料的丰富度。在 GeneBank中报道较
多的品系, 比如拟菱形藻属, 很容易将样品序列进行
比对得到结果, 但是对于一些研究较少的种类, 这一
做法并不十分完整可靠。
有研究表明 , 脂肪酸种类的不同及其相对含量
高低及特征成分等组成特性 , 可以作为微藻化学分
类学地位的重要依据(徐继林等, 2005)。脂类物质是
所有真核生物细胞膜的基本组成成分。脂肪酸是构成
细胞膜骨架的最主要成分 , 甾醇能控制膜的流动性
和渗透性 , 在某些植物体内还担负细胞增殖信号传
递、调节细胞膜结合酶活性的特殊功能, 所以不同种
类的生物体往往具有不同的脂肪酸和甾类化合物组
成(Hartmann,1998; Piironen et al, 2000)。以往的研究
往往局限于一类微藻里特定脂肪酸和甾醇的异同进
行化学分类学探讨 , 判断的主观性和实验人员实验
技术之间的差异势必会给分类结果带来较大的差异。
聚类分析是根据某些个体(样品)或变量(指标)的若干
特征加以分类的统计方法 , 可以避免主观因素带来
的差异(Viso et al,1993; Zhukova et al,1995)。有研究
发现 , 以所测定的每种微藻脂肪酸的相对含量为变
量, 欧几里德距离平方作为聚类统计量, 应用统计分
析软件(SPSS11.5)对微藻进行分层聚类分析的结果与
现行国际通用的海洋微藻的分类结果相吻合(章炜等,
2006)。本研究中作者应用该方法通过应用统计分析
软件(SPSS16.0)分析得到的 6 种微藻的脂肪酸分层聚
类分析的结果, 与基于 ITS序列的遗传距离分析的结
果以及形态鉴定的结果是一致的 , 为被研究种的种
类归属提供了有力的佐证。同时甾醇的成分分布和一
些特征甾醇也提供了一些种间差异的信息。比如甾醇
成分 C28:3(4,7,22/24Me)只有在 PTB和 NFC中能够
检测到, 并且在 PTB 中的检测百分比达到了 63.2%,
故 C28:3(4,7,22/24Me)可以作为该藻的特征甾醇。
NSP和 PN中 C27:1(5)、C27:2(Δ5, 24)的检测量百分
比很高, 有可能成为这两种微藻的特征甾醇。随着对
微藻中脂类物质分离、提取、纯化技术研究的不断深
入, 加上质谱、核磁共振等结构分析手段和脂类衍生
化技术的日益完善 , 可以构建海洋微藻脂类物质组
成结构快速查询信息库 , 并使其成为微藻化学分类
的一个重要辅助手段。
但是微藻的脂类生化组成受环境影响变化较大,
使得脂肪酸的化学分类学研究在微藻分类学上的应
用同样受到一定程度的限制(Volkman et al,1998; 徐
继林等, 2004)。研究表明, 利用微藻的脂肪酸组成或
典型代谢物对微藻进行聚类分析时, 针对不同微藻,
必须严格控制每次研究中培养条件的一致性 , 力求
避免外界环境差异的影响。本研究在相似的静态条件
下培养微藻各品系, 测得的脂肪酸成分分析中, 拟尖
刺菱形藻(PN)和柔弱拟菱形藻(NSP)的聚类关系相当
密切。由此可以看出, 静态而且一致的培养条件下微
藻脂肪酸、甾醇的聚类分析结果可以作为微藻分类的
有力证据。
从本文的研究结果来看 , 小新月菱形藻与菱形
藻属或细柱藻属的差异较大 , 反而和三角褐指藻在
形态特征、分子进化和生化组成方面给出的结果都表
现出极大的一致性, 三种分类学方法互相印证, 共同
为对小新月菱形藻分类地位的重新认识提供了证据
(石娟等, 2008), 实证了基于经典分类学、分子生物技
术和生化组成分析在微藻分类中的应用。
由于 GeneBank 中缺少与 NC 相关的检索资料,
故在分子进化方面没能给出明确的种类归属。比较而
言, NC 与菱形藻属代表种类的距离更远一些, 但是
在形态和脂肪酸组成上都和 NATO 十分相似, 脂肪
酸分析中 , 两者的有效相似距离更小于同属异种的
NSP和 PN, 由此推断 NC应为筒柱藻属中的一种。

致谢 宁波大学骆其君老师、严小军老师进行野外
采样, 谨致谢忱。
参 考 文 献
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A COMPARATIVE STUDY ON THE IDENTIFICATION OF
NITZSCHIA-RELATED SPECIES
LIU Bao-Ning, LIU Chen, ZHOU Cheng-Xu, WU Xiao-Kai, SUN Xue, XU Ji-Lin
(Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology (Ningbo University), Ministry of Education, Ningbo, 315211)
Abstract Nitzschia spp. belongs to a common group of pennate diatom. Some species in this genus have subtle morphological
differences, which make them difficult to be properly identified based on their morphological profiles only. In this paper, three taxo-
nomical methods, namely microscopy observation, internal transcribed spacer sequence (ITS) sequence analysis, and microalgal fatty
acids and sterols analysis, were used in the study of four field samples, which were preliminary identified to be Nitzschia genus and two
closely related species, i.e., Nitzschia closterium f. Minutissima and Phaeodactylum tricornutum, using morphological method. We
found that more information could be obtained by applying multiple methods in identifying microalgal strains than using only one
method. Similar taxonomic results were obtained using these three methods. From the study, three field samples were identified to be
Pseudo-nitzschia pungens Hasle, Pseudo-nitzschia delicatissima, and Cylindrotheca closterium, respectively. However, we were only
able to identify to the fourth strain as Cylindrotheca genus. The results also showed that Nitzschia closterium f. Minutissim belongs to
Naviculales, Phaeodactylaceae, Phaeodactylum, consistent with previous findings.
Key words Nitzschia; related species; taxonomy; comparative study