全 文 ：··实用肝脏病杂志2009年 10月第 12卷第 5期 J Clin Hepatol，October 2009.Vol.12 No.5
·论 著·
白黎芦醇对肝纤维化大鼠肝组织 E- 钙
粘附素表达的干预作用 *
万 荣 伍建业 刘 珺 权鹤鸣 牛培勤 王兴鹏 郭传勇
【摘要】 目的 研究 E-钙粘附素在不同肝纤维化阶段的表达情况以及在抗肝纤维化中药单体白黎芦醇干预下表达
的变化。方法 制备大鼠肝纤维化模型，分别给予小（40mg·kg-1）、中（120mg·kg-1）和大剂量（200mg·kg-1）白黎芦醇处理，取
肝组织检测 E-钙粘附素、转化生长因子 β（TGF-β）、基质金属蛋白酶抑制因子（TIMP-1）1 mRNA水平；采用放射免疫法检
测血清 HA和 pcⅢ水平。结果 正常组大鼠肝组织 E-钙粘附素呈低水平（0.515±0.02）表达，而随着肝纤维化的进展，其水
平增加，其中在 12 周时，肝组织 E-钙粘附素 m RNA水平（0.878±0.03）明显高于中剂量（0.755±0.24）和大剂量白黎芦醇处
理组（0.763±0.21，P <0.01）；在大鼠肝纤维化进展过程中，肝组织 TIMP-1和 TGF-β mRNA水平不断增加。结论 E-钙粘
附素在不同阶段肝纤维化大鼠肝组织均有表达，且随着纤维化程度的加重而表达增强。白黎芦醇可以明显改善大鼠肝纤维
化程度，并减少 E-钙粘附素 mRNA水平。
【关键词】 肝纤维化；白黎芦醇；E-钙粘附素；转化生长因子-β；基质金属蛋白酶抑制因子 1；大鼠
Inhibition of resveratrol，a herbal medicine，on expression of E- cadherin in hepatic tissues of rats with CCl4-
induced fibrosis WAN Rong，WU Jianye，LIU Jun，et al. Department of Gastroenterology，Tenth People’s Hospital，Affiliat－
ed to Tongji University，Shanghai 200072，China
【Abstract】 Objective The aim of this study was to explore the effect of resveratrol，a herbal medicine，on expres－
sion of E-cadherin in hepatic tissues of rats with CCl4- induced fibrosis. Method Hepatic fibrosis model in rats was
prepared，with the intragastric administration of resveratrol at low，middle and large doses. E-cadherin，TGF-β and TIMP-1
mRNA in different stages of hepatic fibrosis were determined by using RT-PCR. The serum HA and precollagen III lelves
were determined by radioimmunoassay. Result E-cadherin mRNA in normal rats（0.515±0.02） was low and steady，while
it increased in rats with hepatic fibrosis. The E-cadherin mRNA level at week 12 in rats with fibrosis （0.878±0.03） was
higher than in with resveratrol intervention （in middle dose was 0.755±0.24 and in large 0.763±0.21，respectively，both P
<0.01）；The changes of TGF-β and TIMP-1 mRNA were as the same manner as E-cadherin. Conclusion Resveratrol
has an inhibitory effect on hepatic fibrosis，maybe by decreasing the intrahepatic E-cadherin mRNA levels.
【Key words】 Liver fibrosis；Resveratrol；E-cadherin；Rat
目前认为，肝纤维化过程是肝星状细胞（Hepatic
satellite cell，HSC）在各种损肝因素持续刺激下被“激
活”，并大量合成细胞外基质（extracellular matrix，ECM）
在肝内沉积，引起肝小叶结构改变的病理过程[1，2]。随着对
肝纤维化发生机制认识的深入，黏附分子在肝纤维化中
的作用越来越受到重视，无论 HSC的激活、凋亡，还是
HSC与 ECM的相互作用都与黏附分子密切相关[3]。因此，
黏附分子可能作为诊断和治疗肝纤维化的新靶点。E- 钙
粘附素（E- cadherin）作为黏附分子中的重要一员，在肿瘤
转移方面的作用研究较多[4]，而其在肝纤维化及其与 HSC
的关系研究报道甚少。由于 E- cadherin的一些作用可能
是通过细胞因子如基质金属蛋白酶抑制因子（TIMP- 1）、
转化生长因子 -β（TGF-β）等而实现的[4～6]，因此本实验
研究了 E- cadherin、TIMP- 1和 TGF-β 在肝纤维化过程
中的表达情况，并观察了中药单体白黎芦醇治疗后对大
鼠肝纤维化的干预作用，以进一步了解白黎芦醇的抗肝
纤维化作用。
* 基金项目：上海市自然科学基金资助项目（编号：06ZR14090）
作者单位：200072 上海市 同济大学附属第十人民医院消化科
第一作者：万荣 男，39岁，副教授。主要从事消化系统疾病诊断与
治疗学研究。E-mail：wanrong1970@163.com
通讯作者：郭传勇，E-Mail：Guochuanyong@sina.com
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实用肝脏病杂志2009年 10月第 12卷第 5期 J Clin Hepatol，October 2009.Vol.12 No.5··
材料与方法
一、动物和试剂 雄性 SD大鼠 125只，体重 250±
50g，由中国科学院上海动物实验中心提供；中药单体白
黎芦醇购于上海纳贝生物技术有限责任公司。用于总
RNA提取的 Trizol 试剂盒购自 Intivigen 公司。两步法
RT- PCR试剂盒（AMV）Ver3.0购自日本 TAKARA公司。
E- 钙粘附素 mRNA 原位杂交试剂盒（MK1181b）、
TGF-β mRNA原位杂交试剂盒和大鼠 TIMP- 1 ELISA
试剂盒（EK0583）购自武汉博士德生物工程有限公司。
二、大鼠肝纤维化模型的制备 将 125只大鼠随机
分为正常对照组、模型组、小剂量、中剂量和大剂量白黎
芦醇干预组，每组 25只。用液体石蜡将 CCl4配成 40%的
溶液，按 0.75ml·100g-1给动物皮下注射，每周 3次，共
8wk。模型组动物在造模的同时，将白黎芦醇分别用无菌
蒸馏水稀释为 10mg/ml、30mg/ml和 50mg/ml，分别给大鼠
按 40mg·kg-1、120mg·kg-1和 200mg·kg-1灌胃，1 次 / 日，
共 13周。分别于造模后 4w、6w、8w、10w和 12w末取肝组
织（1cm×1cm×1cm），经 4%中性缓冲甲醛固定，石蜡包
埋，切片，行 HE和 VG染色，在光镜下观察肝组织病理学
改变。另取肝组织 - 70℃冻存。
三、血清学检测 透明质酸（Haluronic acid、HA），
Ⅲ型前胶原（PCⅢ）放射免疫试剂盒购于中国上海钰森公
司。肝功能检测用全自动生化分析仪测定血清谷丙转氨
酶（ALT），白蛋白（ALB），由我院检验科协作检测。
四、大鼠肝组织 E- cadherin、TIMP- 1、TGF-β mR-
NA检测 采用两步 RT- PCR 法行半定量检测。大鼠
E- cadherin扩增引物：正义链：5’- TTG ATG CCA GAC-
CGG AAG TG- 3’，反义链：5’- TTC TTC GCC GCC
ACC ATA C- 3’，扩增片断长度为 317bp；TIMP- 1扩增引
物：正义链：5’- ATA TTC TGT CTG GAT CGG C- 3’，反
义 链 ：5’- GCT TCG TCA TAC TCC TGT TT- 3’；
TGF-β 扩增引物：正义链：5’- TAA TGG TGG ACC
GCA ACA ACG- 3’，反义链：5- CTT GCT GTA CTG
TGT GTC CAG- 3’。以 GAPDH为内参照，扩增引物：正
义链：5’- TCC CTC AAG ATT GTC AGC AA- 3’，反义
链：5’- AGA TCC ACA ACG GAT ACA TT- 3’。扩增产
物长度为 309bp。各组 RT- PCR产物经电泳后，采用天能
GIS- 1000数码凝胶摄影系统拍照，测定各条带的吸光度
值，对 RT- PCR产物进行半定量分析，以每一条带与其相
对应的参照 GAPDH条带吸光度比值作为衡量各组不同
标本间表达差异的最终指标，避免因所提取 RNA标本浓
度差异而引起的误差。
结 果
一、病理学表现 在第 12周时，除正常对照组外，各
组动物均有不同程度的肝纤维化表现，其中以模型对照
组和小剂量组最明显，而中剂量和大剂量药物干预组动
物肝组织肝细胞再生和肝小叶重建明显。
二、白藜芦醇对大鼠肝功能的影响 从表 1可见，
中剂量和大剂量白藜芦醇干预组肝纤维化大鼠血清 ALT
水平明显低于模型对照组和低剂量干预组（P<0.01），提
示白藜芦醇在 120mg·kg-1剂量下可以明显改善肝脏炎症
程度。在第 6周时中剂量和大剂量白藜芦醇干预组肝纤
维化大鼠血清 ALB水平与模型对照组和低剂量组相比有
差异，但是无统计学显著意义（P<0.05）；但是随着治疗时
间延长至第 12周时，这一差异变得显著（P<0.01），说明随
着疗程的延长，白藜芦醇在 120mg·kg-1剂量下有明显的
改善肝功能的作用。
表1 白藜芦醇对肝纤维化大鼠血清ALT和ALB水平（x±s）的影响
与模型组比较：①P<0.05；②P<0.01
三、白藜芦醇对肝纤维化大鼠血清 HA和 pcⅢ水平
的影响 从表 2可见，中剂量和大剂量白藜芦醇干预组
肝纤维化大鼠血清 HA和 pcⅢ水平明显低于模型对照组
和低剂量处理组（P<0.01），提示白藜芦醇在 120mg·kg-1
剂量下可以明显改善肝脏纤维化程度。
表 2 白藜芦醇作用 12周对肝纤维化大鼠血清 HA和
pcⅢ水平（x±s）的影响
与模型组比，①P<0.01
四、大鼠肝组织 E- 钙粘附素、TIMP- 1和 TGF-β的
变化 见表 3～4。正常对照组动物肝组织 E- 钙粘附素
呈低水平稳定表达；各组肝纤维化大鼠随着肝纤维化的
进展，肝组织 E- 钙粘附素 mRNA增加。在第 12 周
TGF-β表达达到高峰，而中剂量和大剂量药物处理组肝
只数
ALT（U/L）
6wk 12wk 6wk 12wk
对照组 25 47.3±12.6② 46.2±12.8② 35.2±5.1 35.2±7.8
模型组 16 93.3±11.1 103.2±11.8 27.0±6.6 22.2±6.8
低剂量 18 89.9±17.5 99.7±25.4 29.9±13.5 27.1±10.1
中剂量 21 63.4±11.9② 60.3±12.5② 29.7±6.9① 29.1±6.5②
高剂量 22 61.0±17.3② 59.4±22.3② 30.8±7.9① 29.4±6.5②
ALB（g/L）
模型组 16 700.22±67.80 267.22±57.7
低剂量 18 499.12±29.45 232.12±21.51
中剂量 21 432.17±46.94① 199.12±36.48①
高剂量 22 380.35±27.80① 170.35±37.80①
只 数 HA（μg/L） pcⅢ（μg/L）
对照组 25 276.23±35.12 110.23±43.32
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内 TGF-β和 TIMP- 1 mRNA水平显著低于模型组和低
剂量处理组（P<0.01），提示白藜芦醇在 120mg·kg-1剂量
下可以减少促肝纤维化因子的表达。
表 3 不同时期肝纤维化大鼠肝组织E-钙粘附素mRNA（x±s）的变化
与模型对照组比，①P<0.05
表 4 不同时期肝纤维化大鼠肝组织 TGF-β和
TIMP-1 mRNA（x±s）的变化
与模型组比，①P<0.05；②P<0.01
讨 论
肝细胞的退行性病变，不论是可逆的还是不可逆的，
均可通过局部各种递质的释放引起炎症反应，后者通过
旁分泌和（或）自分泌途径刺激 HSC的激活，最终促进肝
纤维化的发生、发展。在此过程中，黏附分子起着重要的
作用[5，6]。抗黏附治疗可以减轻肝损伤。目前已发现的黏附
分子主要分五类：免疫球蛋白超家族、整合素家族、选择素
家族、钙粘附素（Cadherin）家族及其他未分类的黏附分子。
其中研究最多的是免疫球蛋白超家族和整合素家族。钙黏
附素最早由 Takeichi[6]发现，现已知 Cadherin家族共有 3
个成员：E- Cadherin、N- Cadherin 和 P- Cadherin。E- Cad-
herin 也被称作 Uvomorulin、L- CAM或 Cell- CAM120/80。
不同的 Cadherin分子在体内有其独特的组织分布，它们
的表达随细胞生长、发育状态不同而改变。Cadherin分子
以其独特的方式相互作用，其配体是与自身的 Cadherin
分子相同。目前，E- Cadherin的研究主要集中在肿瘤转移
方面[7]，而与肝纤维化及 HSC的关系研究所见文献报道
甚少。
本实验发现，静息的 HSC呈低水平表达 E- Cad-
herin，而活化的 HSC其 E- Cadherin基因及其表达产物均
增加。另外，模型组大鼠肝组织 E- Cadherin表达较正常
组明显增加，除肝窦周细胞、血管内皮细胞表达增强外，
肝细胞也出现阳性表达，从细胞水平提示 E- Cadherin的
表达与 HSC的活化和肝纤维化的发生密切相关。在肝纤
维化中，E- Cadherin可能的主要作用一方面是介导了各
种肝脏细胞与 ECM之间的相互作用和相互影响[8，9]；另一
方面，E- Cadherin所调控的信号蛋白也参与了生长因子
受体激活后的信号转导通路 [10]。炎症细胞也可通过
E- Cadherin或其他黏附分子结合而介导肝细胞和窦周细
胞损伤而致纤维化。
白藜芦醇为无色针状结晶，有四种存在形式，即顺式
白藜芦醇、反式白藜芦醇、顺式白藜芦醇苷和反式白藜芦
醇苷。后两种形式在肠道中可被糖苷酶分解释放出白藜
芦醇，发挥其药理作用[11]。目前，研究表明它具有抗肿瘤、
抗心血管疾病、抗突变、抗氧化、抗菌抗炎、保肝、抗肝纤
维化、诱导细胞凋亡及雌激素调节等广泛的生物学和药
理学活性。白藜芦醇抗肝纤维化的作用机理包括：①对脂
质过氧化有很强的抑制作用，能降低血清和肝脏的脂质，
减少脂质过氧化物在体内的堆积，保护肝脏不受损害；②
具有类雌激素样作用，可以保护肝细胞膜，减轻细胞损
伤。黄兆胜等[12]研究发现白藜芦醇甙对四氯化碳（CCl4）损
伤原代培养大鼠肝细胞有保护作用；③能诱导肝成纤维
细胞表型的改变，显著减少成纤维细胞的增殖。同时减少
Ⅰ型胶原蛋白的表达和金属蛋白酶 - 9的分泌，对肝纤维
化和肝癌的治疗有重要的意义[13]。另外，白藜芦醇还能通
过选择性下调细胞周期蛋白（cyclin）D1的表达，使星状
细胞静止在 G1期[14]，从而有利于抑制肝纤维化的形成。
吕秋军等[14]实验观察白藜芦醇对 CCl4致慢性肝纤维化大
鼠有明显的治疗作用。本研究发现在白藜芦醇干预下，E-
钙粘附素表达减少；而 E- 钙粘附素表达的减少或许又导
致 TGF-β受体数量和 TIMP表达的减少，从而减轻或者
抑制肝纤维化的进展。
随着对肝纤维化机制认识的深入，E- 钙粘附素在肝
纤维化过程中所起的作用越来越受到重视。E- 钙粘附素
有可能作为诊断肝纤维化程度、评估抗纤维化治疗疗效
的一个指标，同时也是治疗肝纤维化的新的靶位点。而中
药单体白黎芦醇因其丰富的药理作用而渐渐为人们所重
视，有希望成为抗肝纤维化治疗的新药[15]。
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4周 8周 10周 12周
对照组 0.519±0.21 0.516±0.25 0.513±0.13 0.515±0.26
模型组 0.587±0.23 0.767±0.21 0.872±0.22 0.878±0.32
低剂量 0.552±0.11 0.732±0.19 0.833±0.29 0.855±0.31
中剂量 0.555±0.17 0.723±0.23① 0.75±0.15① 0.755±0.34①
大剂量 0.542±0.34 0.728±0.38① 0.732±0.26① 0.763±0.39①
TGF-β
6wk 12wk 12wk
对照组 0.477±0.12 0.457±0.18 0.421±0.18
模型组 0.595±0.26 0.899±0.17 0.732±0.33
低剂量 0.533±0.15 0.827±0.19 0.701±0.29
中剂量 0.497±0.24① 0.720±0.28② 0.687±0.25①
大剂量 0.499±0.20① 0.710±0.22② 0.632±0.20①
TIMP- 1
6wk
0.443±0.21
0.521±0.26
0.518±0.23
0.520±0.27
0.511±0.24
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本研究进一步应用 HMGB1拮抗
剂 EP对 D- 氨基半乳糖盐酸盐诱导的急性肝衰竭大鼠
进行了干预治疗，并观察到 EP的保护作用。EP是一种稳
定的亲脂性丙酮酸衍生物，能通过降解谷胱甘肽成为二
硫化物，使细胞内氧化还原状态发生改变，从而抑制
NF-κB的转位以及 p38丝裂原活化蛋白激酶的信号转
导，并且抑制炎性介质的释放[8]。本研究结果显示：EP提
前干预显著降低了急性肝损伤大鼠肝组织 HMGB1
mRNA水平，而且 EP提前干预比造模后 2h给予 EP治
疗更有效。肝组织病理学检查亦显示：EP提前干预组大
鼠肝组织学得到明显的改善。EP治疗组大鼠肝组织学改
善没有 EP提前干预组显著，提示 EP能有效地保护 D-
氨基半乳糖盐酸盐诱导的大鼠急性肝损伤，保护效果与
药物的干预剂量成正相关，并且提前干预的效果更明显。
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