全 文 ：收稿日期:2013 － 12 － 11
基金项目:广元市科技支撑计划项目(2012)。
作者简介:王跃华(1963 －) ，女，教授，主要从事药用植物栽培与生药学研究;E-mail:1961689636 @ qq． com。
正交试验法在山葵多倍体诱导中的应用
王跃华1， 段茂华1， 任三军2， 陈传凤1，
彭 双1， 严幸林1， 孙燕霞1
(1．成都大学生物产业学院， 四川 成都 610016; 2．广元市玺府开发有限公司， 四川 广元 648017)
摘要:目的:改良山葵现有品种，丰富物种资源，增加其有效成分的含量。方法:采用正交试验法考察了秋水仙素浓度、秋
水仙素浸泡时间和浸泡温度对山葵种子多倍体诱导率的影响。结果: 在考察的各因素中，对山葵植物种子多倍体诱导率
的影响大小为秋水仙素的浓度 ＞秋水仙素浸泡时间 ＞秋水仙素浸泡的温度。结论:用 L9 ( 3
3 ) 正交试验筛选出诱导山葵
多倍体植株的最佳组合条件为 A 3 B 3 C 3，即用 1． 0%的秋水仙素溶液在 20 ℃的条件下浸泡山葵种子 24 h，其多倍体诱
导率最高，为 50． 847%。经植物形态组织学和染色体数检测，诱导后的植物材料具有明显的多倍体特征。
关键词: 正交试验;山葵;秋水仙素
中图分类号: S 567 文献标志码: A 文章编号: 1001 － 4705(2014)05-0042-04
Application of Orthogonal Experiment in Polyploid Induction of Wasabi
WANG Yue-hua1，DUAN Mao-hua1，ＲEN San-jun2，CHEN Chuan-feng1，
PENG Shuang1，YAN Xing-lin1，SUN Yan-xia1
(1． Department of Biological Engineering，Chengdu University，Chengdu Sichuan 610160，China;
2． Xihu Development CO．，Ltd．;Guangyuan Sichuan 648017，China)
Abstract:Objective:Improved Wasabi existing varieties，enriched in species resources，increased their content
of active ingredients． Method:Investigated by orthogonal test concentration of colchicine，colchicine different
immersion time and temperature on the induction of polyploidy horseradish seeds． Ｒesult:The factors in the
study of polyploid plants wasabi induction rate the degree of influence is:colchicine concentrations ＞ colchicine
immersion time ＞ Temperature． Conclusion:Using L9(3
3)orthogonal test induced polyploid plants wasabi
optimal induction conditions，the best combination of polyploid induction A 3 B 3 C 3，which uses 1． 0%
colchicine treatment of seeds，placed at 20 ℃ 24 h，its highest rate of polyploid induction up to 50． 847% ．
Plant material has obvious characteristics after induction of polyploid by detection of histology plant morphology
and chromosome number．
Key words: orthogonal test;wasabi;colchicine
山葵(Eutrema wasabia (Sieb)Maxim． )又名山嵛
菜，为十字花科山嵛菜属多年生草本植物［1］，是一种
名贵珍稀的香辛蔬菜，主要在日本、东南亚国家及港澳
台地区消费，市场售价极高，是一种很有发展前景的
出口创汇特色蔬菜［2］。山葵因具有强烈刺激性的辛
辣味和特殊的香辛味而备受青睐。山葵植株体内含有
异硫氰酸酯类化合物，具有防腐、抗癌、抗感染、抑制血
小板凝聚、增进食欲和促进淀粉性食物的消化、稳定
肠胃中的维生素 C 以及清除消化道中的寄生虫等功
效［3，4］。但由于山葵种子具有顽拗种子的特点，因此
部分地区的山葵植物主要采用分株繁殖，但分株繁殖
不仅存在多代营养繁殖种性退化严重的问题，而且繁
殖系数低、种苗带菌严重，极易导致病害大面积发生，
从而使山葵植物的产量和质量受到很大影响，造成严
重经济损失［5，6］。
多倍体植物往往具有器官巨大性特点［7］;并且，
由于细胞染色体加倍，染色体上基因调控有效化学成
分含量也往往较正常二倍体高［8］。因此，开展植物多
倍体诱导对于提高其产量和质量具有重要的作用。
·24·
第 33 卷 第 5 期 2014 年 5 月 种 子 (Seed) Vol． 33 No． 5 May． 2014
表 5 用秋水仙素诱导种子后的生长情况
材料 胚根 下胚轴 子叶柄 子叶 叶片 小苗发育
对照组
形态正常，生长速度较
快，细长，为圆锥形，有
主根，从下胚轴 1 /4 处
和末端长出侧根。
生长速度较快、
细长。
生长速度快，细
长。
形状接近圆形，长:
宽为 1． 2:1，颜色为
绿色。
生长正常叶缘的腺
体较小，颜色为绿
色，形状为心形。
各器官大小均匀，
生长较快。
诱导组
粗壮，且较短，生长速
度较慢，无主根，从下
胚轴末端长出侧根。
生长速度较慢，
为短粗壮，明显
变短。
生长速度较慢，
粗短。
肥厚，形状为椭圆
形，长:宽为 2:1，颜
色为深绿色，稍向
下卷。
增厚，叶缘的腺体
明显变大，颜色为
深绿色，形状常为
不规则的心形。
小苗粗壮、矮化，生
长较慢。
1 材料与方法
1． 1 材 料
山葵种子采自四川广元的山葵植物栽种基地。
1． 2 方 法
1． 2． 1 多倍体诱导的正交试验法
按表 1 选择 3 因素和 3 水平。将山葵种子分别用
浓度为 0． 1%、0． 5%和 1． 0%的秋水仙素溶液浸泡，并
放置于 5 ℃、10 ℃和 20 ℃的条件下，分别处理 6 h、
12 h和 24 h。
表 1 L9(3
3)因素和水平表
水平
A(处理浓度)
(%)
B(处理时间)
(h)
C(温度)
(℃)
1 0． 1 6 5
2 0． 5 12 10
3 1 24 20
1． 2． 2 多倍体植物的鉴定
撕取山葵植物表皮细胞制片，在 40 倍的显微镜下
观察表皮气孔的大小和保卫细胞中叶绿体的数目和大
小。取山葵根尖于 0． 2%的秋水仙素溶液中预处理
2． 5 h左右;水洗后用甲醇-冰醋酸(3 ∶ 1)固定液固定
4 h;再用混合酶(纤维素酶和果胶酶各占 2． 5 %)在
25 ℃恒温箱内处理 3 h;倒去酶液，用蒸馏水洗 3 次，
每次 2 min;去除蒸馏水后制备细胞悬液，用悬滴法制
片，干燥后用 Giemsa 染色后观察检测细胞中的染色
体数。
2 结果与分析
2． 1 正交试验结果
将在不同条件下处理的上述 9 组山葵种子取出后
播种在用 0． 1%的多菌灵和 0． 1%的高锰酸钾分别消
毒 12 h 后由珍珠岩和营养土按 2 ∶ 1配制的土壤里。
每组处理播种 120 粒，并在 20 ℃、光照强度为2 500 lx
的条件下培养。播种 3 d后可观察到有种子的种皮破
裂并长出了白色的胚根，4 d后可观察到有绿色的子叶
开始长出，随后种皮也开始脱落。本实验的多倍体诱
导率是以山葵种子萌发后，在长出第 2 片真叶时开始
统计其多倍体诱导率(结果见表 2) ，本实验统计的多
倍体诱变率包括了各种形式的嵌合体植物。
表 2 山葵种子多倍体诱导试验结果
No． A B C 萌发数 萌发率(%) 多倍体数
多倍体诱导率
(%)
1 1 1 1 68 56． 667 8 11． 765
2 1 2 2 65 54． 167 7 10． 769
3 1 3 3 43 35． 833 12 27． 907
4 2 1 2 54 45． 000 13 24． 074
5 2 2 3 48 40． 000 14 29． 167
6 2 3 1 60 50． 000 22 36． 667
7 3 1 3 67 55． 833 31 46． 269
8 3 2 1 63 52． 500 30 47． 619
9 3 3 2 59 49． 167 30 50． 847
注:统计诱变率以萌发的种子为基数。
2． 2 极差分析
从对表 2 多倍体的诱导结果进行分析可得出极差
分析结果(见表 3)。在本试验所设定的因素中，因素
A的极差值最大，为 0． 314，说明秋水仙素的浓度对山
葵种子的多倍体诱导率影响最大，其次是因素 B 即秋
水仙素处理时间，极差值为 0． 111，而因素 C 的极差值
最小，为 0． 059，说明在山葵种子的多倍体诱导过程
中，用秋水仙素处理种子的温度条件对实验结果的影
响作用相对较小。由表 3 还可看出，山葵种子多倍体
诱导的最佳组合为 A 3 B 3 C 3，即用 1． 0%的秋水仙素
溶液在 20 ℃的条件下浸泡山葵种子 24 h，其多倍体诱
导率最高，为 50． 847 %。
表 3 极差分析表
因素 A B C
K 1 0． 504 0． 821 0． 961
K 2 0． 899 0． 876 0． 857
K 3 1． 447 1． 154 1． 033
k 1 0． 168 0． 274 0． 320
k 2 0． 300 0． 292 0． 286
k 3 0． 482 0． 385 0． 344
Ｒ 0． 314 0． 111 0． 059
表 4 方差分析表
因素 SS df MS SSE MSE F值 F0． 05 F0． 01 显著性
A 0． 150 2 0． 075 0． 001 0． 001 135． 040 19 99 ＊＊
B 0． 021 2 0． 011 0． 001 0． 001 19． 230 19 99 *
C 0． 005 2 0． 003 0． 001 0． 001 4． 738 19 99
注: ＊＊表示该因素在 0． 01 水平上差异极显著; * 表示该因素在0． 05
水平上差异显著。
·34·
研究报告 王跃华 等:正交试验法在山葵多倍体诱导中的应用
A．二倍体胚根; B．四倍体胚根。
图 1 胚根的比
A．二倍体胚轴; B．四倍体。
图 2 胚轴的比较
A．二倍体子叶柄; B．四倍体子叶柄。
图 3 子叶柄的比较
A．二倍体子叶; B．四倍体子叶。
图 4 子叶的比较
从表 4 可以看出，因素 A 的 F 值
为 135． 040，F ＞ F0． 01，说明因素 A 达
到了极显著水平;因素 B 的 F 值为
19． 230，F ＞ F0． 05，说明因素 B 达到了
显著水平;而因素 C的 F值为 4． 738，
小于 F0． 05和 F0． 01，说明因素 C 对实验
结果影响不显著。
2． 2 山葵多倍体植物的鉴定
2． 2． 1 形态学鉴定
经秋水仙素诱导后的山葵种子播
种于育苗盘中，通过与未处理的对照组
山葵种子的发育情况比较(表 5)可以
看出，经诱导的山葵种子萌发后所形成
的植物具有明显的多倍体形态特征
(如图 1 ～6) ;另外，取诱导后山葵植物
的根尖进行染色体数检测(结果如图
7) ，对照组的染色体数 2 n = 26 与文献
记载相符［9］，而诱导组的染色体数
2 n =4 x =52(如图 7) ，由此可进一步
确定诱导后的山葵植物为多倍体。
2． 2． 2 组织学鉴定
分别撕取二倍体和四倍体山葵植
物的叶表皮细胞，制片后在 40 倍的显
微镜下观察(如图 8) ，可见多倍体的
山葵植物叶的表皮细胞，在单位面积
内的气孔器数目相对较少，但组成气
孔器的保卫细胞体积明显增大，并且
保卫细胞中的叶绿体体积也较二倍体
细胞中明显增大。
3 讨 论
正交试验是研究多因素多水平的
一种实验设计方法，它是根据正交性
从全面试验中挑选出部分有代表性的
点进行试验，这些有代表性的点具备
了“均匀分散，齐整可比”的特点，是
一种高效率、快速和经济的实验设计
方法［10］。本实验采用了正交试验方
法，对影响山葵多倍体诱导的秋水仙
素浓度、秋水仙素浸泡时间和处理温
度进行了较为系统、深入的研究，并从
中筛选出了诱导山葵多倍体的最佳方
案，即用浓度为1． 0%的秋水仙素溶液
浸泡山葵种子，并放置在 20 ℃条件下
处理24 h，其多倍体诱导率最高，为
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第 33 卷 第 5 期 2014 年 5 月 种 子 (Seed) Vol． 33 No． 5 May． 2014
A．二倍体真叶; B．四倍体真叶。
图 5 真叶的比较
A．二倍体植株; B．四倍体植株。
图 6 植株的比较
A．二倍体染色体数目; B．四倍体染色体数目。
图 7 染色体的比较
A．二倍体气孔; B．四倍体气孔。
图 8 气孔的比较
50． 847%。
在试验中发现，用秋水仙素处理
山葵种子后易得到嵌合体形式的山葵
多倍体植物，这一研究结果与崔翠［11］
的研究结果一致。通过观察经诱导后
的山葵种子萌发产生的幼苗可发现，
用 0． 1%的秋水仙素溶液处理山葵种
子后获得的嵌合体山葵植物发生的恢
复突变率最高，为 70% ～ 80%，而采
用 1． 0%的秋水仙素溶液处理山葵种
子后获得的嵌合体山葵植物发生恢复
突变率最低，仅为 20%左右。因此，
选择适宜的秋水仙素浓度对植物种子
进行多倍体诱导，是获得稳定多倍体
植物的重要条件。
参考文献:
［1］朱进．湖北高山地区引种山葵的关键技
术［J］．长江蔬菜，2011(15) :7 － 8．
［2］蔡光泽． 山葵种子的采集、处理及贮藏
［J］．种子，2002，21(6) :106．
［3］周林松．日本山葵高山引种和旱地高产
栽种技术［J］．丽水农业科技，2005(1) :
20 － 36．
［4］Yu EY，Pickering IJ，George GN，et al． In
situ observation of the generation of
isothiocyanates from sinigrin in horseradish
and wasabi［J］． Biochimica et Biophysica
Acta，2001，1527:156 － 160．
［5］林加根，赖正锋，吴维坚，等． 日本山葵
的组培快繁试验研究［J］． 现代农业科
技，2008(21) :22 － 24．
［6］何万兴，吴志平，宁红，等． 四川山葵病
虫害调查［J］． 西南农业学报，2005，18
(1) :63 － 65．
［7］韦荣昌，吴庆华，马小军，等．植物多倍体
研究进展［J］．种子，2013，32(7) :50 －52．
［8］王跃华．川黄柏多倍体诱导研究［J］．中
国中药杂志，2006，31(6) :448 － 451．
［9］崔翠，何凤发． 山葵的核型分析研究
［J］．西南大学学报，2008，30(4) :135．
［10］祝国强，刘庆欧．医药数理统计方法［M］．
北京;高等教育出版社，2004:201 －222．
［11］崔翠． 山葵种苗生产激素体系的优化
及其多倍体诱导的初步研究［D］． 重
庆:西南农业大学，2005．
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研究报告 王跃华 等:正交试验法在山葵多倍体诱导中的应用