全 文 ：　　基金项目:教育部博士点基金(编号:20050610056)
通讯作者:李为民 , E-mail:weimi003@yahoo.com
·论著·
山葵对肺癌组织 hnRNPA2 /B1 表达的影响
陶然　李为民　陈文彬
四川大学华西医院呼吸内科(四川成都　610041)
　　【摘要】　目的　通过建立大鼠肺癌模型 , 研究山葵提取液对肺癌早期分子标志物 hnRNP
A2 /B1的调节作用 ,进一步阐明山葵抗肺癌作用的分子机制。方法　将 36只 Wistar大鼠随机分为
肺癌模型组(对照组)和山葵治疗组(实验组)。按 1 mL碘油内含 3-甲基胆蒽(MCA)50 mg配制致
癌质碘油。每只大鼠均用 MCA碘油溶液 0.1 mL在左肺叶支气管内灌注诱癌。实验组于诱癌前 1
周开始胃饲山葵提取液至动物被处死 ,对照组于同一时间胃饲等量生理盐水 。造模后第 30、60及
90 d分批处死大鼠 ,每次 6只。免疫组织化学法和RT-PCR法检测肺癌组织 hnRNPA2 /B1的蛋白和
基因表达。结果　山葵提取液能降低肺癌组织 hnRNPA2 /B1的蛋白表达 ,在第 30、60及 90 d的抑
制率分别为 51.0%、51.0%和 45.1%。山葵提取液同时降低了 hnRNPA2 /B1 mRNA的表达 , 在第
60和 90 d的抑制率分别为 79.5%和 58.0%。结论　山葵提取液能降低肺癌早期分子标志物
hnRNPA2 /B1的表达 , 可能是其抗肺癌的分子机制之一。
【关键词】　山葵;　大鼠;　3-甲基胆蒽;　肺癌;　hnRNPA2 /B1
EffectofwasabiontheexpressionofhnRNPA2 /B1 inlungcancer　TAORan, LIWei-min, CHEN
Wen-bin.DepartmentofRespiratoryMedicine, WestChinaHospital, SichuanUniversity.Chengdu, Sichuan,
610041, China
Corespondingauthor:LIWei-min, E-mail:weimi003@yahoo.com
【Abstract】　Objective　Ananimalmodeloflungcancerwasestablishedtostudywhetherwasabi
couldinhibittheexpressionofhnRNPA2 /B1 inlung.Methods　Thirty-sixWistarratswererandomly
dividedasmodelgroupandwasabigroup.0.1 mLofarcinogeniciodizedoil[ 50 mg3-methylcholanthrene
(MCA)in1 mLcarcinogeniciodizedoil] wereinstilledintratrachealytoinducelungcancer.Aweek
beforeinstillationofMCA, thewasabigroupwasorallyadministeredwasabiextractsolutionuntilthe
animalswerekilledwhilethemodelgroupwasgivenisometricsalineatthesametime.Sixratsineach
groupwererandomlykilledon30thday, 60thdayand90thday.ImmunohistochemistyandRT-PCRwere
usedtomeasuretheproteinandmRNAexpressionofhnRNPA
2
/B
1
, respectively.Results　Wasabi
loweredtheproteinexpressionofhnRNPA2 /B1 withatotalinhibitoryrateof48.5%.Atthe30th, 60thand
90thday, theinhibitoryratewas51.0%, 51.0% and45.1% respectively.Meanwhile, wasabiloweredthe
mRNAexpressionofhnRNPA2 /B1 withatotalinhibitoryrateof60.5%.Atthe60thand90thday, the
inhibitoryratewas79.5% and58.0%, respectively.Conclusion　Wasabisolutioncandown-regulatethe
expressionofhnRNPA
2
/B
1
whichmaybeamolecularmechanismsbywhichwasabiinhibitslungcancer.
【Keywords】　Wasabi;　Rat;　3-methylcholanthrene;　Lungcancer;　HnRNPA2 /B1
　　肺癌为最常见的恶性肿瘤 ,目前我国肺癌的发
病率和病死率已占多数大城市恶性肿瘤的首位 [ 1] 。
流行病学调查显示 ,山葵等十字花科蔬菜的消费与
癌症危险呈负相关 [ 2, 3] 。大量实验亦证实 ,山葵中
的异硫氰酸盐成分具有抗癌作用 [ 4, 5] 。但山葵对肺
癌早期分子标志物 hnRNPA2 /B1表达的影响国内
外尚未见报道 。本实验通过建立大鼠肺癌模型 ,研
究山葵提取液对 hnRNPA2 /B1的调节作用 ,为进一
步阐明山葵抗肺癌作用的分子机制提供实验依据 。
材料与方法
一 、动物分组及处理
·107·中国呼吸与危重监护杂志 2008年 3月第 7卷第 2期　ChinJRespirCritCareMed, March2008, Vol.7, No.2
健康 Wistar大鼠 36只 ,雌雄各半 ,年龄 4 ～ 6个
月 ,体重 150 ～ 180 g。按随机数字法分为肺癌模型
组(对照组)和山葵治疗组(实验组),每组 18只 。
实验组按照 0.2 mL/只的剂量每日胃饲山葵提取
液 ,直至动物被处死。在给药的第 8 d用 3-甲基胆
蒽(MCA)碘油溶液 0.1 mL对大鼠左肺叶支气管作
一次性灌注诱癌 [ 6, 7] 。诱癌后第 30、60及 90d分批
处死大鼠 ,每次 6只。对照组大鼠按照 0.2 mL/只
的剂量每日胃饲生理盐水 ,直至动物被处死 。诱癌
方法与处死动物同实验组 。
二 、采用水蒸馏回流提取法制备山葵提取液
新鲜山葵粉 200 g与蒸馏水 1 000mL经加热浓
缩得 200 mL咖啡色混悬液 。致癌质碘油溶液按
1 mL碘油内含 MCA50mg配制。
三 、免疫组织化学染色
采用链霉素亲生物素-过氧化物酶法(SP法)。
一抗选用抗小鼠 hnRNPA2 /B1单克隆抗体(Sigma公
司),稀释度为 1∶400。检测步骤按 SP试剂盒(北京
中杉金桥生物技术有限公司)说明书进行 ,二氨基联
苯胺(DAB)显色。以 PBS代替一抗作阴性对照。所
有组织切片均于同一次染色以保持可比性。细胞内
见棕黄色颗粒为阳性。于 400倍高倍镜下 ,随机选取
10个视野 ,用 Laserpix图像分析软件测定积分光密度
值(IOD),比较 hnRNPA2 /B1表达的相对水平。
四 、RT-PCR
hnRNPA2 /B1上游引物 5′-AGGACCTGGAGGT-
GGCAAT-3′,下游引物 5′-TCCATAGTTGTCATAAC-
CAC-3′, TaqMan探针 5′-FAM-TGGAGGTAGCCCTG-
GTTAT-TAMRA-3′,扩增片段 127 bp。内参照 3′-磷
酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH)上游引物 5′-CCTCAA-
GATTGTCAGCAAT-3′, 下 游 引 物 5′-CCATCCA-
CAGTCTTCTGAGT-3′, TaqMan探针 5′-FAM-ACCA-
CAGTCCATGCCATCAC-TAMRA-3′, 扩 增 片 段
141 bp。以上引物及探针由上海生物工程有限公司
合成 。组织总 RNA提取按 Trizol说明书进行 ,扩增
条件如下:预变性 94 ℃ 2 min, 94 ℃ 20 s, 50 ℃
30s, 60 ℃ 40 s循环 45 次。 hnRNPA2 /B1 和
GAPDH在同一体系 , GAPDH复性温度为 56 ℃,其
余条件与 hnRNPA2 /B1相同。用 FTC2000实时荧
光定量基因扩增仪(加拿大 FUNGLYN公司)绘制扩
增动力学曲线 ,并由此计算 hnRNPA2 /B1相对于内
参照 GAPDH的基因表达量(2-ΔΔCt)。
五 、统计学处理
采用 SPSS11.0软件 ,数据均用 x-±s表示 ,用 t
检验进行统计学处理。P<0.05为差异有统计学意义。
结　　果
一 、病理学改变
HE染色证实 MCA诱发的大鼠肺癌均为支气
管鳞状细胞癌 ,癌巢形态不一 , 可见角化珠或角化
囊;癌细胞核大 ,异型 ,核染色质粗 ,核分裂相多 ,核
仁大 。未见其他类型的良 、恶性肿瘤。
二 、山葵对肺癌组织 hnRNPA2 /B1蛋白表达的
影响
光镜下 hnRNPA2 /B1阳性反应产物呈棕黄色
颗粒状 , 弥漫或散在分布。正常大鼠肺组织中
hnRNPA2 /B1 有少量表达 , 肺鳞癌细胞中 hnRNP
A2 /B1表达增强 ,而山葵提取液处理组中肺癌细胞
hnRNPA2 /B1表达降低(图 1)。
通过测定各标本 IOD值显示 ,山葵提取液可显
著降低 hnRNPA2 /B1 蛋白表达 , 总的抑制率为
48.5%,其中实验第 30、60及 90 d的抑制率分别为
51.0%、51.0%和 45.1%。结果见表 1。
表 1　两组大鼠 IOD值比较(x-±s)
时间　 肺癌模型组 山葵治疗组 抑制率(%) t值 P值
　　第 30 d 39 897.47±19 374.46 19 548.25± 8 694.79＊ 51.0 2.35 0.04
　　第 60 d 63 613.37±15 844.84 31 161.66±17 800.12＊＊ 51.0 3.34 0.00
　　第 90 d 76 771.46±15 616.20 42 170.18±20 127.02＊＊ 45.1 3.33 0.00
　　总计 60 094.10±22 415.87 30 960.03±18 025.02＊＊ 48.5 4.30 0.00
　　注:与肺癌模型组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01
　　三 、山葵对肺癌组织 hnRNPA2 /B1 mRNA表达
的影响
正常大鼠肺组织中 hnRNPA2 /B1 mRNA有少
量表达 ,而肺鳞癌细胞中 hnRNPA2 /B1表达增强 。
山葵提取液可抑制 hnRNPA2 /B1mRNA表达 ,总的
抑制率为 60.5%,其中实验第 60和 90 d的抑制率
分别为 79.5%及 58.0%。结果见表 2。
·108· 中国呼吸与危重监护杂志 2008年 3月第 7卷第 2期　ChinJRespirCritCareMed, March2008, Vol.7, No.2
表 2　各组大鼠 hnRNPA2 /B1 mRNA相对表达量比较(x-±s)
时间　　 肺癌模型组 山葵治疗组 t值 P值
　　　第 30 d 0.47±0.37 0.09±0.08 2.02 0.08
　　　第 60 d 2.19±1.28 0.45±0.36＊ 3.46 0.00
　　　第 90 d 3.55±1.29 1.49±1.34＊ 2.72 0.02
　　　总计 1.95±1.58 0.77±1.04＊ 2.46 0.02
　　注:＊与肺癌模型组比较 , P<0.05
讨　　论
山葵(wasabiajaponicamatsum)为十字花科山
葵属多年生草本植物 ,作为传统的调味品辛辣料有
数百年来历史。山葵中的葡糖异硫氰酸酯及分解产
物是其特殊辛辣味的来源 。黄明深 [ 8] 采用高温蒸
馏法和常温乙醚对山葵不同部位进行萃取 ,测定其
中的异硫氰酸盐(ITCs)含量 ,发现山葵根茎中异硫
氰酸酯的含量最高 , 为 0.841%;须根中次之 , 为
0.575%;叶片中最少 ,为 0.309%。近年来众多国
内外学者均证实 ,山葵中的 ITCs具有抗癌活性 。
Yano等 [ 9]发现山葵中提取的有效成分 6-MHITC通
过 Ⅰ相和Ⅱ相酶调节致癌物在体内的代谢 ,从而明
显阻遏 NNK诱导肺癌的作用。山葵提取液还可通
过其他途径在防癌方面发挥作用 。已有实验证明
ITCs可诱导多种肿瘤细胞发生细胞凋亡和细胞周
期阻滞 。目前认为 ITCs的这种作用与 MAPK信号
传导途径的主要激酶 、抗凋亡蛋白 、caspases系统 、
细胞周期蛋白等的作用都有关系。核内不均一核糖
核蛋白(hnRNP)是存在于细胞核中的一种 RNA结
合蛋白 ,由 30多个蛋白质小分子构成 ,其中 A1 、A2 、
B1 、B2 、C1及 C2为主要核心成分 ,特别是 A、B组为
基本核心成分。 Tockman等 [ 10] 首先用抗 hnRNP
A2 /B1单克隆抗体对肺癌的痰标本进行回顾性研
究 ,发现在绝大部分早期肺癌和癌前病变患者的痰
液中 hnRNPA2 /B1为阳性 。其总敏感性为 91%(鳞
癌 100%),特异性为 88%。其他学者的研究也表明
hnRNPA2 /B1的增高是肺癌形成的早期事件。
Fujimoto等 [ 11]提取绿茶中的 EGCG(表没食子
儿茶素没食子酸酯),作用于人肺癌细胞株 ,发现绿
茶多酚可抑制 hnRNPB1 mRNA及蛋白表达 ,其机制
尚不清楚。机体内实体瘤组织通常处于缺氧状态 ,
Garayoa等 [ 12]将人肺癌和乳腺癌细胞株置于低氧环
境 24 ～ 48 h,并通过免疫组织化学研究证实 hnRNP
A2 /B1的表达显著降低 , 由此推测缺氧可下调
hnRNPA2 /B1的表达 。
本实验发现 ,山葵提取液能降低 hnRNPA2 /B1
蛋白表达 ,抑制率达 48.5%。其中实验第 30、60和
90 d的抑制率分别为 51.0%、51.0%及 45.1%。
RT-PCR亦显示 , 山葵提取液可下调 hnRNPA2 /B1
mRNA表达 ,抑制率达 60.5%。其中实验第 60和
90d的抑制率分别为 79.5%及 58.0%。以上结果
提示山葵提取液可通过抑制 hnRNPA2 /B1表达 ,从
而发挥抗肺癌的作用 ,这可能是其抗肺癌的分子机
制之一 ,但山葵调节 hnRNPA2 /B1表达的机制尚不
清楚 ,有待进一步研究。
(本文图 1见插页第 7页)
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