全 文 ：第 1 5卷第 2期
1 9 9 3年 1 2月
厦 门 水 产 学 院 学 报 vo l· 1 5N 0· 2
J O U R N AL O X l F八M EN FI S HR EI ES CO L L EG ED e e .珍 9 3
小红毛菜原生质体的分离及培养 ’
陈 昌 生
渡门水产学院水产养殖系 .厦门 31 60 1 2 )
摘要 :用蛋白酶和细菌酶分离出来的小红毛菜原生质体 , 在适宜的温度、 光照下 . 具有很强的再生能
力 . 培养 2一 3 天后 , 原生质体产生细胞壁 , 然后分裂成二个独立的细胞 . 经培养 . 这些细胞有的还能重
复同样的分裂 , 使单细胞数目剧增 . 这些细胞经诱导培养能萌发成小红毛菜 .
关键词 : 一 红毛菜户 酶 , 原生质体 , 培养 `
近年来 , 海藻细胞和原生质体的培养取得一定的进展价州乃 , 并在人工育苗和养殖上
逐步得到应用 (4, .56) . 这些研究表明 , 海藻的体细胞育苗可以缩短育苗周期 , _节省人力物
力 , 还可以摆脱采胞子受季节的限制 , 为海藻的苗种生产提供一条新途径 (6) .
小红毛菜 ( B an g “ ; lo fo 二 lt idl’c 口 la T an ak a ) 隶属红藻门 , 原红藻纲 ` ,攀玫毛滩自、 续
毛菜科 , 红毛菜属 , 它生长在潮间带的中潮区上 , 国内外有关小红毛菜的原生质体的研
究 , 尚末见过报道 . 本文主要介绍小红毛菜的原生质体分离 , 细胞分裂以及萌发长成新藻
体的过程 , ` 现报告如下 : 一 -· · 一 一 : - , 一 r ;
1 材料与方法
1 1 材料及处理
材料于 19 90 年 2一 5 月采 自日本长崎市野母崎的中潮区 . 通勺红毛菜附生于海萝藻体表
面 , 大小为 卜 Zcln . 藻体采何后 , 用消_毒海水反复洗涤数遍 , 先在室内弱光下 , 一 飞通气培
养 1一 2 天 、 试验时 , 再用消毒过滤海水洗一遍 、 然后用消毒刀片沿海萝藻体边缘之将小
红毛菜藻体切下 i 置于显微镜下观察补挑除其它杂藻 . 几
, 本试验是在 、日本国长崎大李水产学部藻类研究室做的 , 承蒙淤岭 、 藤田雄二奴抬导 , _ ’谨致谢意 .
本文 19 92 . .6 9 收到 ` · ` ” : · - 」 r
厦 门 水 产 学 院 学 报 第 5 1卷
L Z 酶液的制备
1
.
2
.
1 1%蛋白酶 (r Pt ocac s Pa ma n o) 6:称取 . 05 9蛋白酶 (日本天野制药公司产品 )溶
于 5 0m5 l 0m m ol /L H p E Es海水缓冲液 (PHs . o), 通过电磁搅拌器 , 搅拌 l om in , 然
后置于低温离心器中进行离心分离 ( 9 , o o r / m in, 20 m in, 5℃ ) . 去除残渣 , 把所得上清液
的 P H 值调整到 8 . 0 , 然后分装于各个小瓶 (每瓶 3m l) , 放在冰箱中保存 . 使用前解冻 ,
每 3m l 酶液中加人 52 . 6nI g 的 N a C I (渗透压调节剂 ) 即可使用 .
1
,
2
.
2 细菌酶 : 从病烂的紫菜叶状体上分离出来的假单胞菌 ( sP u do m on as s p ) 经过培
养 , 调制出来的酶液 , 调制方法同 ( 7) .
L 3 原生质体的制备
将 小红毛菜的藻体放人小试管内 , 加人 1% 蛋白酶垂直振动 . 酶解 1 小时后 , 用
0
.
3 m ol / L N a cl 的消毒海水 , 洗涤酶液二遍 . 吸掉上清液 , 接着加人细菌酶 , 酶解 2 小
时后 , 用孔径为 15拜m 的尼龙筛绢进行过滤 . 滤掉未解壁的组织团块 , 然后将滤液进行离
心分离 (2 , 500r / m in, s m in , 20 ℃ ) , 用含有 0 . 3m ol / L N a CI 的 f/ 2 培养液匆 , 洗涤酶液
和离心分离二次 .
L 4 原生质体的培养
在直径为 g cm 的培养皿中 , 先加人含有 .0 3 0 01 / L N a C I 的 f / 2 培养液 , 再加人原
生质体 , 然后每隔 12 小时左右降低培养液中的 N a C I 浓度 0 . l m ol / L (逐渐去除酶解时
所添加的 0 . 3m ol / L 渗透压调节剂 ) . 36 小时后更换正常的 f / 2 培养液进行培养 . 温度
试验是在五档可调的恒温培养箱 中进行 , 分为 10 , 15 , 20 , 25 , 30 ℃ . 光照试验分为
50 0
,
1 5 0 0 ,3 o 0, 50 0 01
x , 每天光照时间为 12 小时 . 原生质体分别置于上述不同的条件下培
养观察 .
2 结果与讨论
.2 1 细胞分裂
小红毛菜的原生质体大小为 10 一 12 拜m , 中间有一个星状色素体 (图版 L l ) . 原生质
体培养 2 天后 , 产生细胞壁 , 然后细胞逐渐拉长 (图版 I , 7) , 变成长椭园形 , 接着细胞
中间产生缴缩 (图版 I , 8一 9) , 最后分裂成大小为 10 一 12 I, m 的两个细胞 (图版 I , 4,
10 )
. 这两个细胞的大小 、 颜色 、 内容物含量等都大致相同 . 用微细玻璃管挑选这种细胞
进行单独培养 , 连续跟踪观察 , 发现这些细胞有的还会进行同样的分裂 . 就这种现象 , 笔
者进行了重复试验 , 结果基本相同 .
有的原生质体培养 3一 5 天后 , 细胞增大到 1 5一 17 拼m , 然后由母细胞分裂出一个大小
为 4一 5“ m 的小细胞 (图版 I , 5一 6) , 母细胞比子细胞大 5一 7 倍 . 新产生的小细胞颜色
浅 , 呈透明状 , 而且 内容物少 (图版 I , 6) . 经多次连续观察 , 这种分裂所需的时间短 ,
一般只需 1小时左右就可完成 . 由于快速形成 , 内容物分裂不完善的缘故 , 使这种大小差
异比较大的小细胞不具有再次分裂生长的能力 , 往往在 1一 2 天内就死亡消失 .
除了上述之外 , 还有少量的原生质体 , 在培养 3一6 天后 , 细胞逐渐增大 , 由原来的
10 一 1 2料m , 增大到 20 一 3 0“ m , 然后细胞内容物逐渐减少 , 成为中空状态 , 不具有萌发成
新藻体的能力 , 大约培养 5一 10 天 , 就逐渐死亡 .
第 2期 陈昌生 :小红毛菜原生质体的分离及培养
. 2 2再生新藻体
经连续培养观察 , 上述分裂的细胞经数天培养后 , 一端长出假根 (图版 n , 1 , 2) ,
另一端细胞开始分裂 , 长成完整的新藻体 (图版 n , 3 , 4) . 随着继续生长 , 一部分营养
细胞产生单胞子囊 , 放散出大小为 12 一 1 3料m 的单胞子 , 单胞子直接萌发成小红毛菜 (图
版 n , 5) . 此外 , 由原生质体长成的小红毛菜也会形成精子囊器和果胞子囊 (图版 n ,
6
,
7 )
。
从温度对小红毛菜原生质体生长的影响来看 , 高温不利于细胞的分裂生长 , 在 30 ℃
下培养 2 天 , 原生质体全部死亡 . 温度为 25 ℃ 时 , 大部分原生质体逐渐增大 , 内容物减
少 , 成为中空 , 然后逐渐死亡 , 但仍有极少数的原生质体产生细胞壁 , 形成假根 , 长成小
红毛菜 . 随着温度的降低 , 原生质体的生长能力逐渐增强 , 在 15 一 20 ℃时培养 2一 3 天 , 就
可产生细胞壁 , 开始二分裂 , 这时虽然也有一些细胞直接长成新个体 , 但为数较少 . 从第
10 一 1 5 天开始 , 细胞二分裂速度逐渐减弱 , 单细胞逐渐萌发长成新藻体 . 当温度降至
10 ℃时 , 原生质体的再生比较慢 , 往往要培养 5一 8 天后 , 才有一部分原生质体产生细胞
壁 . 然后细胞开始分裂和萌发 , 即使培养一个月也仅有 10 % 的原生质体长成 2一 3 细胞的
小芽 . 由此可见 , 1 5一20 ℃是原生质体生长的适宜温度 .
光照也会影响原生质休的再生 . 在低光照下 , 原生质体产生细胞壁之后 , 主要是萌发
成新藻体 , 而通过细胞分裂产生单细胞的数目就比较少 . 随着光强的增大 , 在初期培养
中 , 产生单细胞的数目比较多 , 尤其是 30 0 一 SO0 lx 这一光强范围 , 然后这些单细胞开始
长成新藻体 .
综上所述 , 在适宜的温度 、 光照下 , 小红毛菜的原生质体在初期培养的 5一 10 天内 ,
主要是细胞分裂 , 一分为二 , 使单细胞的数目剧增 , 随着继续培养 , 细胞开始逐渐转人萌
发阶段 , 长成新个体 . hc cn l( 9 89) 描述了线形紫菜 (P or 砷少r a iln ea r的 原生质分离及悬
浮培养的过程 . 他采用连续跟踪培养 , 发现线形紫菜的原生质体能不断进行二分裂 , 产生
很多独立的小细胞 , 这些小细胞经诱导培养 , 能长成新藻体 ( 10) . 从海藻的分类系统来
看 , 红毛菜和紫菜属于同一科 , 有一定的亲缘关系 . 它们之间不仅生活史相同 , 而且在原
生质体再生方式上也有很多相似之处 . 这种再生方式 , 在生产上对于增加苗种数量 , 扩大
苗种来源将有一定的意义 .
参 考 文 献
l 唐延林 . 紫菜营养细胞和原生质休的分离及培养 . 山东海洋学院学报 , 19 82 , 12 (4) : 37 一50
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,
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8 F u勇t a Y . a n d 5 . M ig i t a . F u s io n o f p r o t o p r a s ts fr o m t h a ll i a n d d e v o lo p m e n t o f fu s io n P r o d u e t s .
厦 门 水 产 学 院 学 报 第 5 1卷
恤 p, J . p h那 0 1, 1 9 86 , 3 5 : 2 0 1一 2 0 8
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图版 :1 1 ,小红毛菜的原生质休
2 : 原生质体产生细胞壁后进行细胞分裂
3一 : 分裂产生两个独立的细胞
5一石: 由母细胞分裂产生一个小细胞
7一10 ; 分裂的过程
(图 -2 10 标尺 = 1 5“ m )
第 2期 陈昌生 : 小红毛莱原生质体的分离及培养
图版 1: l一 : 原生质休产生假根
3一 : 萌发成新个体
: 5放出单胞子 .直接萌发成新个体
6: 产生精子囊器 , 放出精子
:7 形成果胞子囊 , 放出果胞子
厦 门 水 产 学 院 学 报 第 15 卷
S TU DI E SO N THEI SOI L A TO N N A D CU L TU RE
O FP RO TO L PA S TSO FB AN GL凌 GLI O O P EL Z了DI CO L A
C hn eC h an g h s en g
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X i a m e n 36 1 0 2 1)
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s t r ac t : U n d e r P r o P e r t em
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ht e p r o ot P l a st s o r B a n g她
glo ot 详 l id ic o 勿 i s o l a t ed b y P r o t e a -se P ( a m a n o ) 6 a n d b a e t er i a e n z y m e s h o w s v e r y s t r o n g
er 罗 n cr a t in n ca P a d t y . A t ht e in i t i a l s at g e p f t h e e ul t u r e , e a hc c a n P r o d u e el l w a l , d i v id ed
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e p e n d en t ce l l s
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ht e er P r o d u e ed m o n o lC l
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罗mr in a 协 a n d g or w int o e o m m o n B a n g勿 g le 勿详 lt 记 ic o la .
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o l d s : B an ig a声 n z y m e ,P r o t o P l a st
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