全 文 ：现代生物医学进展 www.biomed.net.cn Progress in Modern Biomedicine 2009 Vol.9 No.17
凹顶藻萜类化合物对小鼠 H22肿瘤生长及 VEGF、PCNA表达的影响
刘克为 1 梁 惠 2△ 高 华 3 贺 娟 4
（1青岛大学医学院附属医院肿瘤科 山东青岛 266003；2青岛大学医学院医学营养研究所 山东青岛 266021；
3青岛大学医学院医学药学系 山东青岛 266021；4青岛大学医学院附属医院营养科 山东青岛 266003）
摘要 目的：观察凹顶藻提取物（Laurencia terpenoid extract，LET）对接种 H22细胞小鼠的肿瘤生长及血管内皮细胞生长因子
（VEGF）、增殖细胞核抗原（PCNA）表达的影响。方法：昆明小鼠随机分为 5组（10只 /组），即模型组、LET低中高剂量组（25、50、
100 mg/kg·d-1）、环磷酰胺组（CTX对照组）。各组小鼠左前腋下皮下接种 H22肝癌细胞，第二天除模型组外，其余 4组分别以不同
剂量的 LET、CTX灌胃，于 15天后处死，完整剥离出肿瘤，称重，计算抑瘤率。免疫组化法测定肿瘤组织中 VEGF、PCNA的表达。
结果：LET低、中、高剂量组小鼠 H22肿瘤质量增长均较模型组缓慢（P<0.05），抑瘤率分别为 27.5 %、34.9 %、41.4 %；同时 LET中、
高剂量组 VEGF阳性表达较模型组显著减少（P<0.05），低剂量组未见明显变化，但 LET各剂量组 PCNA阳性表达较模型组显著
减少（P<0.05）。结论：LET各剂量组可以抑制小鼠 H22肿瘤的生长，具有较高的抑瘤活性，且中、高剂量组能抑制 VEGF的表达
（P<0.05），低、中、高剂量组能抑制 PCNA的表达（P<0.05）。LET对肿瘤组织 VEGF、PCNA表达的抑制作用可能是其抗 H22肿瘤及
抗血管生成的一个重要原因。
关键词：凹顶藻；萜；H22肿瘤；血管内皮生长因子；增殖细胞核抗原
中图分类号：R73.354，R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-6273（2009）17-3243-04
Effects of Laurencia Terpenoids on Tumor Growth and Expression
of VEGF and PCNA in H22 Mice
LIU Ke-wei1, LIANG Hui2△, GAO Hua3, HE Juan4
（1 Oncology Division of the Affiliated Hospital, Medical College, Qingdao University, 266003, Qingdao, China;
2 Department of Nutrition, Medical College, Qingdao University, 266003, Qingdao, China;
3 Department of Pharmacology, Medical College, Qingdao University, 266003, Qingdao, China;
4 Nutrition Division of the Affiliated Hospital, Medical College, Qingdao University, 266003, Qingdao, China）
ABSTRACT Objective: To observe the effect of Laurencia terpenoid extract（LET）on tumor growth, VEGF and PCNA in H22 mice.
Method: KM mice were randomly divided into five groups: the model group, the LET group (25，50，100mg/kg·d-1), the cyclophos-
phamide group (the CTX control group) and each group had ten mice. H22 Cells were inoculated subcutaneously into left anteromedial of
KM mice. Animals of four groups (except the model group) were treated with ig LET of different dosage and CTX on the second day and
executed after 15 days. We weighed the tumor which was stripped completely and calculated the tumor inhibition rate. Simultaneously
the expression of VEGF and PCNA in tumor tissue were determined by immunohistochemistry. Result: In vivo, the increase of H22 tumor
weight in LET groups was slower than that in model group (P<0.05), and the tumor inhibition rate was 27.5%, 34.9%, 41.4% respective-
ly. The treatment with mid and high-dose LET inhibited the expression of VEGF (P<0.05), while there is no significant changes in
low-dose group. Different dose LET inhibited the expression of PCNA (P<0.05) within tumor. Conclusion: LET inhibits tumor growth
possessing higher tumor inhibition rate, as well as PCNA expression in H22 mice (P<0.05). Mid and high-dose LET inhibited the expres-
sion of VEGF (P<0.05). The depressant effect may be an important reason for opposing H22 tumor and angiogenesis.
Key words: Laurencia; terpenoid; H22 tumor; vascular endothelial growth factor; proliferating cell nuclear antigen
Chinese Library Classification: R73.0.5, R285.5 Document code: A
Article ID: 1673-6273（2009）17-3243-04
*基金项目：山东省科技厅科技攻关项目（2006GG2302002），青岛市科技局科技计划资助项目（08-2-1-5-nsh）.
作者简介：刘克为（1963-），女，硕士，副主任医师，主要研究方向：肿瘤治疗与预防研究
电话：0532-82913036，E-mail:keweiqy@126.com.
△通讯作者：梁惠，电话：0532-83812434，E-mail:qdlianghui@126.com .
（收稿日期：2009-07-16 接受日期：2009-08-12）
前言
萜类化合物在自然界分布很广，不仅存在于陆地动植物
中，在海洋生物如海藻中亦很丰富。很多萜类化合物具有抗病
毒、抗肿瘤、抗氧化等生理活性，故从海洋藻类中开发抗肿瘤的
天然药物具有广阔前景[1]。从红藻凹顶藻属 Laurencia tristicha
中分离得到的倍半萜 Laurebiphenyl对肺腺癌、胃癌、肝癌、结
肠癌等具有细胞毒活性[2]。另外从福建红藻 Callophycus serra-
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DOI:10.13241/j.cnki.pmb.2009.17.046
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tus中分离得到的双萜化合物 Bromophycolide A对多种人肿瘤
细胞株有细胞毒活性[3]。作者前期研究从采自中国南海的三列
凹顶藻（Laurencia tristicha Tseng）中得到含量丰富的萜类化合
物提取物[4]，本研究观察其对昆明小鼠 H22肿瘤组织中血管内
皮细胞生长因子（VEGF）及增殖细胞核抗原（PCNA）表达的影
响，并初步探讨其可能的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 三列凹顶藻 采于广东省湛江市硇洲岛附近海域，由中国
科学院海洋研究所提供并鉴定，标本现存于该所海藻化学研究
室。
1.1.2 实验动物及瘤株 清洁级昆明小鼠，18-23 g，雄性，由青岛
市实验动物中心提供。H22小鼠肝癌细胞株，由中国医学科学院
药物研究所引进，山东医学科学院药物研究所药理室低温冻存
保种，复苏后传 5、6、7代的细胞悬液。
1.1.3 试剂及仪器 新生牛血清（Gibco）；兔抗小鼠 PCNA抗体、
兔抗小鼠 VEGF抗体（北京中山生物技术有限公司）；DAB显
色试剂盒、SP染色试剂盒（北京中山生物技术有限公司）；注射
用环磷酰胺（0.2g/瓶，批号：07080421，江苏恒瑞医药股份有限
公司）；LEICA RM2135切片机（德国）；ZMN-7803型自动组织
包埋机（常州华利电子公司）；生物图像分析系统（江苏捷达科
技公司）；OLYMPUS-BX50 显微镜（OLYMPUS）；Simple PCI
图像分析系统（v5.2，Compix Inc）。
1.2 方法
1.2.1 LET的制备 将凹顶藻干品粉碎后过筛，甲醇及乙醇反复
浸泡，浸泡过程中搅拌，尽可能使样品中有效成分溶出，经过
滤、减压蒸发浓缩得浸膏；蒸馏水溶解、乙酸乙酯萃取得有机
相，有机相减压蒸发得凹顶藻提取物 LET。准确称取适量 LET，
以甲醇定容，4℃、3000 r/min离心 5 min，取上清液进入 HPLC
分析[5,6]，测得其总萜含量为 63.3%。用大豆色拉油作溶剂溶解
LET。
1.2.2 动物模型的建立 50 只昆明小鼠购进后适应性喂养 1
周，随机分为 5组，每组 10只。每只小鼠于左前肢腋窝皮下接
种 0.2 mL浓度为 2×106/mL的 H22瘤细胞悬液。24 h后，根据
小鼠体重进行干预。模型组 A：每天给予大豆色拉油 0.5 mL灌
胃；LET组（B、C、D）：分别为 LET低、中、高剂量干预组，分别
给予大豆色拉油稀释的 LET灌胃，剂量为 25、50、100 mg/kg·
d-1，灌胃容积为 0.5 mL；环磷酰胺（CTX）组 E：给予 CTX 40
mg/kg·d-1灌胃；各组均连续给药 2 w。
1.2.3 样品采集 末次给药 24 h后，将小鼠称重，处死。无菌条
件下解剖小鼠，取肝脏并完整剥离出肿瘤，准确称重，计算抑瘤
率。抑瘤率（%）=（对照组平均瘤质量 -给药组平均瘤质量）/对
照组平均瘤质量×100 %。
1.2.4 免疫组织化学法检测 VEGF、PCNA的表达 取上述新鲜
肿瘤组织常规做石蜡切片，进行免疫组化检查，即按 SP试剂盒
说明染色，采用 DAB显色，用中性树胶封固，镜检，分析肿瘤细
胞中 VEGF、PCNA的表达。采用 Simple PCI图像分析系统，每
组切片随机选取 5张，光镜下（40倍）每张切片按系统抽样法
随机取 10个视野；对所测定组织的背底进行光密度值（OD）测
定，定出标准作为参考值；通过手动选择阳性细胞及阳性区域，
计算机数据自动统计系统计算出所测细胞平均光密度值。其中
VEGF阳性细胞以胞质内出现棕黄色颗粒状染色为判定标准，
PCNA阳性细胞以胞核染色呈棕黄色为判定标准，胞浆无着
色。光密度值越大，表明 VEGF、PCNA阳性表达越强。
1.2.5 统计学分析 采用 SPSS 11.5统计软件进行单因素方差分
析，两两比较采用 Q检验。检验水准 α= 0.05，p<0.05有统计学
意义。
2 结果
2.1 实验小鼠的一般状态及成瘤情况
LET组小鼠活动基本正常，精神状态良好，皮毛基本光洁，
肿瘤生长潜伏期（TT）3 d，肿瘤生长缓慢；CTX 组小鼠活动正
常，精神状态良好，优于 LET组，与空白组无明显差异，TT为 4
d，肿瘤生长较 LET组慢；模型组小鼠活动减少且消瘦，肿瘤肿
至脖子、下巴，出现张口呼吸，精神萎靡、毛色不清洁，TT为 2
d，肿瘤生长最快。所有小鼠接种后 16 d全部处死，成瘤率 100
%。
2.2 LET对肿瘤质量的影响
LET各剂量组肿瘤平均质量均低于模型组，差异有统计学
意义（P<0.05），可见 LET对肿瘤生长有一定抑制作用；其中高
剂量组（100 mg/kg）的抑瘤率高达 41.4 %，平均瘤质量与模型
组有极显著差别（P<0.05），见表 1。CTX组抑瘤率高于 LET高
剂量组，但差别无统计学意义。
2.3 免疫组织化学法观察瘤组织中 VEGF、PCNA的表达
模型组肿瘤细胞大小不等，异型性明显，核分裂相多见，
VEGF阳性细胞（胞质内有大小不等的棕黄色特异性颗粒）明
显，色泽较深；LET高剂量组和 CTX组肿瘤细胞分化程度较
高，异型性低，核分裂相少见，VEGF阳性细胞明显少于模型
组，仅出现微弱表达(图)。LET高剂量组、CTX组胞核染色呈棕
黄色的细胞明显少于模型组，即 PCNA阳性细胞数明显低于模
型组，色泽较浅(图 2)。
OD值测量表明，LET 中高剂量组及 CTX 组 VEGF阳性
表达明显少于模型组（P<0.05），且 LET高剂量组阳性表达少于
其低、中剂量组（P<0.05），其中 LET高剂量组 VEGF的表达虽
高于 CTX组，但此差异无显著性。LET各剂量组 PCNA阳性表
达较模型组均明显降低（P<0.05），且 LET高剂量组阳性表达少
于其低中剂量组（P<0.05），但高于 CTX组，差异有显著性（P<0.
05）。（表 2）
Group tumor weight(g)
Tumor inhibition rate
(%)
Control group(n=9) 2.68±0.86 -
LET low-dose group(n=9) 1.94±0.52 a 27.5
LET mid-dose group(n=8) 1.74±0.65 a 34.9
LET high-dose group(n=7) 1.56±0.44 a 41.4
CTX group (n=8) 1.24±0.51 a 53.9
Note：a P<0.05 compared with model group
表 1 LET对 H22小鼠肿瘤质量的抑制作用(x±s)
Tab. 1 The effect of LET on tumor growth in H22 mice(x±s)
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3 讨论
肝癌是典型的富血管肿瘤，其生长依赖新生的血管提供营
养和排泄代谢产物，抑制血管形成意义重大。VEGF是最重要
的促血管生成因子，能通过其受体 KDR/Flk-1有效激活胞外信
号调节激酶（ERK)，从而刺激内皮细胞 DNA合成[7]，也能够通
过 PI-3K通路激活抗凋亡激酶 Akt/PKB而发挥抗凋亡作用[8]，
从而发挥促进血管内皮细胞增殖、刺激体内新血管生成和增加
血管通透性，维持血管正常状态和结构的完整性等生物学作
用，故 VEGF是肿瘤微血管生成和侵袭转移中的关键因素。组
织相对缺氧引起 VEGF的表达增加，Hirohashi等[9]发现，VEGF
高表达有利于原发性肝癌的复发、侵袭和转移，并与肝癌的临
床病理特征密切相关。本实验 LET能抑制肿瘤增殖，且有效抑
制肿瘤细胞 VEGF的表达，因此可能是其通过抗血管生成发挥
作用。
增殖细胞核抗原 PCNA是反映细胞增殖状态的特异性核
抗原，是 DNA聚合酶的一种辅助蛋白，对 DNA的调节起着重
要作用，PCNA的量增多，DNA合成量也增多。因此其在细胞
核内阳性表达的高低与细胞增殖活性密切相关，是一种准确、
简便、直观研究评价细胞增殖状态的重要指标[10]。本实验 LET
各剂量组 PCNA表达明显低于模型组，表明肿瘤生长受到抑
制。另外，VEGF升高，促使肿瘤新生血管增多，进而肿瘤细胞
增生，加速分裂，导致肿瘤细胞增殖活性提高，即 PCNA升高。
表明 PCNA、VEGF在肝肿瘤发生过程中起协同作用[11]。LET对
PCNA、VEGF的表达均有抑制作用，故能较好发挥抗肿瘤的作
用。
贺娟等[12,13]研究发现 LET可增强体内的抗氧化能力，使自
由基对脂质的氧化作用减弱。因萜类是具有异戊二烯骨架的化
图 1 免疫组化显示 VEGF的表达（×200）
Fig. 1 The expression of VEGF by immunohistochemistry (×200)
注：A模型组，B LET高剂量组，C CTX组
Note: A Model group, B LET high-dose group, C CTX group
图 2 免疫组化显示 PCNA的表达（×200）
注：A模型组，B LET高剂量组，C CTX组
Fig. 2 The expression of VEGF by immunohistochemistry(×200)
Note: A Model group, B LET high-dose group, C CTX group
Note：a P<0.05 compared with model group，b P<0.05 compared with
high-dose group
Group VEGF（OD） PCNA（OD）
Model group(n=9) 0.228±0.034 0.215±0.023
LET low-dose group(n=9) 0.213±0.018b 0.196±0.013ab
LET mid-dose group(n=8) 0.208±0.017ab 0.185±0.014ab
LET high-dose group(n=7) 0.194±0.025a 0.110±0.022a
CTX group(n=8) 0.187±0.026a 0.091±0.017ab
表 2 LET对 H22小鼠肿瘤组织中 VEGF和 PCNA表达的 OD值影响
(x±s)
Tab. 2 The effect of LET on the OD value of VEGF and PCNA expression
in H22mice (x±s)
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合物，含丰富的烯键，化学性质活泼，易发生加成反应，具有较
强的还原性，能保护细胞膜和线粒体膜中的不饱和脂肪酸不被
氧化。梁惠等[14]通过对 LET抑瘤机制的研究发现 LET可提高
机体的免疫功能，诱导 S180细胞凋亡和阻断该细胞于 G0/G1
生长期有关，从而明显抑制小鼠 S180移植瘤的生长。本课题组
前期工作表明 LET还具有良好的抗炎和抑菌作用。
综上所述，LET具有抑制小鼠 H22肿瘤组织生长和肿瘤血
管生成的作用，从三列凹顶藻中分离得到的凹顶藻萜类化合物
是一种具有代表性的海洋天然活性物质，值得进一步开发应用
和深入研究。
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