全 文 ：第 37 卷 增刊 中 国 海 洋 大 学 学 报
0 0 7 2年 7 月 CI A LN I UVE R S I T YO FC I HN A
3 7 ( S
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.
J u l
l
1 5 9一 16 6
0 20 7
甘紫菜细胞色素 。 6基因 Pe tJ 克隆与序列分析 ’
王孟强, 茅云翔一 , 李 杰, 张 蕾, 刘 玮, 庄的绮
(中国海洋大学海洋生命学院 , 山东 青岛 26 60 03 )
摘 要 : 以野生甘紫菜为材料 , 采用同源克隆技术获得了细胞色素 。 6 基因娜 J 的全长序列 , 由此推导出相应的氨基酸序
列 , 并与部分藻类的同源基因进行了相似性和同源性分析 。 结果表明 : 由核昔酸序列推导的氨基酸序列中 , 包含 10 个碱性氨
基酸残基 , 13 个酸性氨基酸残基 , 46 个疏水性氨基酸残基和 27 个极性氨基酸残基 。 甘紫菜 ( oP r p h笋a ,。 er 。 jK el m )洲 J基
因编码区核昔酸序列和蛋白序列与条斑紫菜的相似性最高 ( 9 . 0% , 9 0 % ) , 其次是 oP r hP 少’a p o rP o aer ( 8 . 5 % , 92 . 7 % ) 。
而与其他藻类中的同源序列相似性较低 。 利用该基因在甘紫菜和条斑紫菜的差异位点可以开发用于 区别这两种紫菜的分子
标记 。 该基因的系统发生结果与内共生学说一致 ,可能是内共生学说在分子水平上的 1 个体现 。
关钮词 : 甘紫菜 ; 细胞色素 。 6 ; eP tJ ; 序列特征
中图法分类号 : Q 9 43 . 2 文献标识码 : A 文章编号 : 16 72 一 5 174 ( 20 0 7 ) 0 4 n 一 159 一 08
细胞色素 。 6 , 又称细胞色素 。 5 3 , 是由 加tJ 基因编
码的 1种可溶金属蛋白 , 属于 I 类 。 型细胞色素 , 作为
细胞色素 坑 f 复合体到光合系统 I ( P S I )的电子传递
中间体而起作用〔` 〕。 这种亚铁血红素蛋白在细菌 、 线
粒体以及藻类中起高等植物中质体蓝素的作用 z[] 。 对
莱茵衣藻 ( hC l a m州o m o n a : er i n 入a心 t i i )的研究表明 ,
细胞色素 。 6 和粪叶琳氧化酶 ( co p or 卯 r p h y r i n眼 e n o x i -
da s e )的表达都受到铜离子的调控 , 并且在 m R N A 水平
上有一致的变化趋势 , 二者的表达可能由同一代谢机
制控制 [3 ] 。
在多数真核藻类 , 如蓝载藻 ( 〔沙王刀刃劝俐 扣m凌浓之 )
中 , 细胞色素 。 6 为核基因编码 , 细胞质中合成 ,成熟的蛋
白要三次穿过生物膜 , 最终定位在其作用位点— 类囊体膜上 [’1 。 而在红藻特别是紫菜属中 ,娜 J则由质体基
因组编码 , 但尚未见到关于该蛋白合成位置与作用位点
的相关研究 51[ 。 细胞色素 。 6 和质体蓝素的编码基因不
同 ,但是功能和空间结构极为类似 e1[ , 对于这两者的研
究 ,将有助于理解高等植物选择质体蓝素替代细胞色素
c 6 的原因以及光合作用机理的进化 2[] 。
甘紫菜 ( oP rP hyar t en e ar jK e nm )是 1 种生长于潮
间带的大型海藻 , 属于红藻门 ( R hod 叩 h yt a ) 、 原红藻纲
( p or t
o f lo r id e o p h y e e a e )
、 红毛菜目 ( B a n g i a l e s ) 、 红毛菜科
(B
a n g i a e e a e )
、 紫菜属 (凡动入卿 ) , 主要 生长于我国辽
宁 、 山东 、 浙江 、福建以及 日本 、 韩国等地沿岸 。 我国藻
类学家曾经以甘紫菜为研究材料深入研究了紫菜属的
生活史川 、 生殖方式 8[] 和遗传特性 [9 ] , 大大推动了海藻
遗传学的发展 [’ ” 〕。 在条斑紫菜的人工栽培深入发展
之前 , 甘紫菜曾经是主要的紫菜栽培品种 。 但随着条
斑紫菜大规模人工栽培的开展和环境的恶化 , 甘紫菜
野生种质资源 日趋减少 。 据报道 , 在 日本甘紫菜已经
被列为濒危物种 〔川 。 目前 , 甘紫菜分子生物学研究十
分薄弱 , 公共核酸数据库 ( G en ban k) 中登录的甘紫菜基
因序列仅有 5 条 , 主要 包括 : 55 : R N A [’ 2 ] , s s u [’ 3 ] ,
t叻 2 {` 4 ] , 户户t 4 [ `5 ]以及咖 A 和 。加 B 〔’ 6 ]等 。
目前 , 在紫菜属中已克隆了条斑紫菜和 oP rP h y ar
uP rP
u
ear 的 eP tJ 基因 , 但尚未见到相关论文发表 。 本
研究以野生甘紫菜为材料 , 采用同源克隆技 J 术克隆
了甘紫菜的细胞色素 。 6 基因 (加 tJ ) , 并对其序列特征
进行了相关分析 , 以期了解甘紫菜基因的序列特点 , 并
获得更多的分子遗传信息。
1 材料与方法
1
.
1 藻体采集与培养
甘紫菜叶状体于 20( 巧年 3 月采集于青岛太平角潮间
带 (3 6 ’ 0 . 01 ` N , 120 ’ 2 . 卯 ` )E ,采集后置于 PE S 培养基中
暂养 , 培养温度 6 一 8 ℃ ,光照强度 32 拜r 幻 l . m 一 2 · s 一 ` ,光照
周期 12L : 12D 。
1
.
2 试剂与仪器
保真 D N A 聚合酶 B le n d T a q 、 d N T P s M i x t u r e 购自
T 0 Y 0 B( ) 公司 , 克隆载体 p M D 一 1 8 T 、 凝胶 回收试剂盒
, 基金项目 : 国家高技术研究发展计划项目 ( 20 2 A A 6 2 s i 2 0 , 2 0() 4 A A 6 2 s o 9 o . 2 o o 6 o l l o A 4 o l 3 , Z o o 6 A A l o从 23 )资助
收稿日期 : 2 0 0 7 一 0 2一 0 8 ;修订日期 : 2 0 0 7 一 0 5一2 1
作者简介 : 王孟强 ( 19 82 一 ) . 男 . 硕士生 。 忘m司 : w 肚心m曰堪 q i a n g @ g m ial . 。 om
, . 通讯作者 : E 一m a i l : y x m ao @ o u 。 . e d u . c n ; T e l : + 脚 . 532. 82 0 3 18 1 7 ; aF x : + 8 6一 5 32 一 8 2 0 3 2 0 1 7
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中 国 海 洋 大 学 学 报 2 0 0 7 年
D N A Fr a g me n tCl
e a n in gK it购自T AK R A A公司 , 蛋白
酶 K , R N A 酶 A 为 is g m a 分装 。 T isr Base , ED T A 和
SD S 购自 O x 0 ID 公司 , 其他试剂均为国产分析纯 。 使
用 T h emr o E l e e t or n 公司生产的 P x ZT M P C R 仪进行
P C R 扩增 , 使用 A m e r s h a m P h a rm a e i a 公司生产的紫外
可见分光光度计进行 D N A 定量 , 使用 A B I公司生产的
3 730 自动测序仪进行序列测定。
1 3 甘紫菜 D N A 制备
采用 wa it e : 等的方法 ( `7〕, 经改进后提取藻体 D N人
取健康藻体 , 除去表面附着物 , 用灭菌海水洗测干净 , 用吸
水纸吸干表面 , 用铝箔包好置于液氮中冷冻20 而 n , 加液
氮研磨至粉状 ,转移至 EP 管中 ;加入 1 . 0 lnI J 裂解提取缓
冲液 ( 1田 n 价d / L , D is 一 1`Kl ,印 佃d / L E[ 丁IA ,翎 川叮d / L
N以〕 , 2 % 5 0 5 , 0 . 2 m g · m l一 ’ 蛋白酶 K ) , 涡旋 1 m i n ;
置于 37 ℃摇床中 , 120 r/ 而 n ,振荡40 而川 4 ℃ , 14 《X叉) g ,
离心 20 m in ;取上清至新 E P 管中 , 加入 R N A 酶 A 至
终浓度为 20 拌g · m 一 ’ ; 3 7 ℃温浴 30 m i n , 冰浴 3 0 m i n ,
4 ℃ , 14 00 0 9 , 离心 2 0 m i n ;取上清至新 E P 管中 , 加入
等体积酚 : 氯仿 ( l : 1 )抽提 ; 4 ℃ , 14 00 0 9 , 离心 1 0 m i n ;
取上 清至 新的 E P 管中 , 加入等体积氯仿抽提 ;4 ℃ ,
14 姗 g ,离心 10 而川取上清至新的 EP 管中, 加入 0 . 7 倍体
积 一为 ℃预冷的异丙醇 , 温和地颠倒混匀 ; 一 为 ℃静置过
夜 ; 4 ℃ , 14 叮 ) g ,离心 40 ha n ,弃上清 ;用 1 rnI J 一加 ℃预冷
的为%乙醇洗 2 次 , 每次4 ℃ , 14 姗 g , 离心 10 ~ ;晾干 , 加
入刃 沁无菌水溶解, 一加 ℃备用。
1
.
4 甘紫菜 加 tJ 墓因的克隆
利用已知的红藻 州 J 基因及其上下游序列中的保
守区设计引物 。 正向引物为 5 ` T CC Y A口〔流O m A[ GA C -
G户3 ` , 反向引物为 5’ T AC WRG A K A气气叼戊消LA GT 3` (Y =
习 C , W = 习 T , R 二 习。 , K 二 G/ T ) 。 P CR 体系为 5 0 拌L
包含 5 拌L 10 X p CR 缓 冲 液 , 2 . 5
~
口L 晒或 12 ,
0
.
2 n们均 l / L d N T p s , 正反 向引物各 10 p阳 I , 模版 D N A
l o gn
,
D N A 聚合酶 I U , 加超纯水至 50 沁。 P C R 循环
参数为 : 94 ℃ 预变性 8 m i ;n 94 ℃变性 1 m in , 52 ℃ 复
性 1 m i n , 7 2 ℃延伸 1 m i n , 3 2 个循环 ; 7 2 ℃温育 5 m i n 。
P C R 产物用 D N A 片段凝胶回收试剂盒 回收 , 连接至
pM D
一
1 ST 载体 , 使用热激法转化至大肠杆菌 D H a5 , 使
用蓝白斑法筛选重组子 , 使用通用引物 M 13 做 P C R 扩
增检测阳性克隆 , 确认插入片断长度与预期相符后测
序。
1
.
5 序列分析
使用 v ec 段er n 软件去除载体序列 , 使用 B las tN 、
lB as t x 和 (狠 Ff i n de : 等软件确定开放阅读框 , 使用 v ec otr
N T I A dva cen 1 0
.
3
.
0
,
I
~
琅 e ne 7 . 0 . 0 、 D N A玉刃 15 6 . 0 . 1 2 2
和 B iol 记 it 7 . 0 . 5 等软件进行序列特征分析 , 使用
S侧叭丑T 5 . 0 和 T M p阁 等软件分析信号肤和跨膜区 , 使
用 P A U甲 4 . Ob lo 和 州田G A 3 . 1进行系统发生分析。
2 结果
2
.
1 甘紫菜 D N A 制备及 介tJ 基因克隆
本研究得到的甘紫菜 DN A 经电泳检测条带清晰 (见
图 l) , 经分光光度计检测 , (刃腼 / (溉加 = 1 . 91 士 0 . 08 ,
(犯鲡 / (犯腼 = 1 . 89 士0 . 12 , 可以满足下一步 PCR 的要求 ,
但产率较低约为 75 喇 gtn (D NA/ 材料鲜重 )。
P C R 反应经过 4 8 , 50 , 52 , 54 和 56 ℃不同的复性
温度测试 , 在 52 ℃条件下能够得到清晰的单一扩增产
物条带 , 因此本研究采用 52 ℃作为扩增娜 J 基因的复
性温度 , 甘紫菜 D N A 经 P C R 扩增后可得到约 950 b p
的片段 (见图 2) 。
图 1
F ig
甘紫菜 DN A 电泳
D N A e x t ar e t io n
图 2 CP R 产物电泳
F i g
.
2 P C R p r ed
u e t o f
f or m 尸 . ten e r a 娜 J f or m P . ze n e ar
2
.
2 甘紫菜 钾 tJ 基因序列分析
P C R 产物经测序 , 去除载体后 获得 964 b p 的序
列 , 序列分析显示 : 1一 41 8 b p 为 sP b V 基因部分序列 (见
图 3 ) , 4 19 一 9 6 4 b p 为 加 t J 基因序列 , 包括 5 ’ U T R 完整
序 flJ z 7 0 b p 、 3 ’ U T R 部分序 fIJ 2 2 b p 以及 1 个 3 3 3 b p
的完整开放阅读框 , 该阅读框编码 1 10 个氨基酸的细
胞色素 。 6 蛋白 , 基因中未发现 内含子 。 该基因序列已
经提交至 G e n B a n k , 登录号为 E F 1 7 6 13 3 。
甘紫菜 加 tJ 基因序列的开放阅读框以 u U G 为起
始密码子 , 以 U A A 为终止密码子 (见图 3 ) 。 在推导的
氨基酸序列中 , 包含 10 个碱性氨基酸残基 、 13 个酸性
氨基酸残基 、 4 6 个疏水性氨基酸残基和 27 个极性氨基
增刊 王孟强 , 等 : 甘紫菜细胞色素 。 6 基因娜 J 克隆与序列分析
酸残基 , 疏水氨基酸占较大比例 。 预测分子量 1 1 . 9 15 52
kD
, 等电点 ( IP ) 4 . 8 36 。 N 端具有一段信号肤序列 : 1-
2 5
,
M队K K F Svi J F T V] 阳FVF IG F AQ IA F A (见 图 3 )
。 由
SM叭丑 T 和 T M p edr 软件分析 , 推测该多肤有 1 个跨膜
区 : 5一 2 6 , F S v L FT v下S FvF IG F AQ IAF A A (见图 3)
, 这 暗
示在甘紫菜中成熟的细胞色素 。 6 很可能也定位在类囊
体膜上 。
图 3 甘紫菜 洲 J基因核昔酸以及推导得到的氨基酸序列
F ig
.
3 D N A s e q u ecn
e a n d d ed
u e
ed
a m i on
a e id s四 u e n e e s o f 钾r j g e n e f or m P . e n e ar
(方框 :引物 , 小写 : sbP V部分序列 , 斜体 :信号肤 , 下划线 :跨膜区 , 双下划线 : 突变的 iH dn m位点 )
( D
: p r i m e r : ol w e r e a s e : p sb V ; i t山。 : s ig n al p e p t id e ; u n d e r li n e : 。 or s m e m b r a n e ; do u ble u n d e r li n e : H in d m m u t a s e )
2
.
3 甘紫菜 加 tJ 墓因密码子使用
根据所克隆的甘紫菜 eP tJ 基因序列 , 分析其密码
子使用情况 : A A T 、 G A T 和 G C T 的使用频率最高 , 分
别为 8 次 、 8 次和 7 次 , 而编码 L eu 的 C T C , 编码 lG y 的
G G G
, 编码 Il e 的 A T C , 编码 lA a 的 G C G , 编码 T y : 的
T A c
, 编码 iH s 的 C A c , 编码 lG n 的以G , 编码 sA p 的
G A C
, 编码 lG u 的 G A G , 编码 C y s 的 T G C , 编码 P or 的
C C C
,
C C G
, 编码 T h r 的 A C A , A C G , 编码 V a l 的 G T C ,
G T G
,编码 se : 的 T CC , T e G , A G e , 编码 A r g 的 C G T ,
C G C
,
C G A
,
C G G
,
A G G 等 24 种密码子在该序列中没
有出现 (见表 1 ) 。
2
.
4 甘紫菜娜 J基因序列相似性 、 同源性与系统发生分析
利用 〔记司氏川 k 中收录的 10 条真核藻类 浏 J 基因同
源序列进行相似性分析 , 发现 浏 J 基因的编码区核昔酸
序列相似性为 3 . 8% 一 9 . 0% , 氨基酸序列相似性为
29
.
5 % 一 9 . 0 % 。 甘紫菜 娜 J 基因编码区的核昔酸序列
和蛋白序列与条斑紫菜的相似性最高 ( 9 . 0% , 9 . 0 % ) , 其
次是 p . UP rP “ 、 ( 8 . 5% , 92 . 7% ) , 而与其它藻类的相似
性较低 (见表 2) 。 甘紫菜与条斑紫菜的 州 J 基因的蛋白
序列只有 1个氨基酸残基的差异 。 在核昔酸序列中 ,编码
区有 3 个碱基的差异 , 相似性为 9 . 0% ; 5`七Tl , R 有 4 个碱
基的差异 , 相似性为 97 . 6% ;而在获得的 3’ 1了1, R 部分序列
中 , 有 2 个碱基的差异 ,相似性仅为 如 . 9 % (见图 4) 。
采用 eG n B an k 中已收录的 15 条 eP tJ 基因序列与
本研究所克隆序列 (见表 3) , 采用 3 种方式重建了 eP tJ
基因的系统发生树 , 其中最大似然法 ( M L ) 自举值为
1 0 0
, 最大简约法 ( M P )和邻接法 ( N J ) 自举值为 1 0 0 0 , 3
种方法所得系统发生树基本一致 , 并且与各个物种的
系统发生关系基本一致 。 由系统发生分析可知 , 甘紫
菜的 eP tJ 基因首先与条斑紫菜聚类 ( 9 % M L , 10 0 %
M p
,
10 % NJ )
, 其次是 尸 . uP rP “二 ( 91 % M L , 10 %
M P
,
10 0 % NJ ) (见图 5 )。
1 6 2 中 国 海 洋 大 学 学 报 2 0 0 7年
表 l甘萦菜州J 基因的密码子使用
T
a b le IG 记o n u sa g e of 洲 J f ro m P . t en era
密码子 氨基酸 次数 密码子 氨基酸 次数 密码子 氨基酸 次数 密码子 氨基酸 次数
N u mb e r N u mb e r N u mb e r
( 又妇o n A min o a e id o 记o n A min o a e i d Q月o n A mi no a e id C《 x」o n A i n ino a
o f t i mes of t i mes o f t i mes
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GTCATCAG
衰 2 甘萦菜娜 J墓因与部分同源序列相似性 (右上为核普酸 , 左下为氮荃酸 )
T a b le 2 S im ila ir t ies o f 州 J n u e leo t id e a e id s eq u e n e es f r o m a lg a e ( a bo v e d ia即 n a l : n u e l eo t id e , b e lo w d ia即 n a l : a m ino a e id )
物种 Sp ce ie s 10
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.
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.
33 8 0
.
4 37 0
.
44 0 0
.
4 6 2
增刊 王孟强 , 等 :甘紫菜细胞色素 。 6 基因 州 J 克隆与序列分析
表 3 用于盆建系统发生树的洲 J 序列信息
T
a b l e 3 T h e se q u e n e es i n e lu d e d in t h e p hy l眼 e n t i e a n a ly s is
登录号 物种 基因类型 登录号 物种 基因类型
A c
.
N
O
. 印 e e ies G e n e t yP e cA . N o . 即 e e i e s G e n e t y P e
村 0 02 36 1 A 刀 a b a e n a s P . P C7C 119 蓝藻基因 材 27 17 43 (加 n o Ph o ar 加 r口法理 “ 核编码
A Y 72 83 86 〔如 n ot hce sP . A T C C5 1 142 蓝藻基因 A Y 1918 6 7 hP a 伐d a e咧 u m t r i co r n 二 t u m 核编码
A F 0 20 30 6 旦尹卫“ 入
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0 04 79 9 (巧` n 边i o s c h y OZ n m e or al e 质体编码CN
L 2 52 52 枷雀无“ 笋it 、 sP .
蓝藻基因
蓝藻基因 0 0 1840 叹卯 n心 i u m ca lda r i u m 质体编码
A卫旧52 59 7 hT er m o勺用优入~
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n u s 蓝藻基因 E F 176 13 3 oP r Ph笋a t e n e ar 质体编码
A且 ) 780 86 hC a e t“ e or s g ar c i li s 核编码 N C 0 00 92 5 oP r Ph笋叨 P u rP “ are 质体编码
AB旧780 8 5 hC le rel 伍物伽 irs 核编码 A月 ) 0 67 15 oP r P h笋 a 岁 z o e n is 质体编码
、吞
中 国 海 洋 大 学 学 报 2 0 07 年
图 5 藻类洲 J基因系统发生分析
F i g
.
5 P hy l吧e n e tie an al邓 is of 洲 Jfrm o16 s e p cies f oal , e
M L树为基础 . 节点上的数字 . 依次是 M L、 M P和 NJ 树的 b汉此 t o p值 , 低于
% 的以 , 表示 B昭 e d o n M I J t r e e , t he n u m悦 rs on t he n 记es ar 。 腼 t s t ar p
v al u e s of M L
,
M P an d N J t re
. , in d ica t es
a v al u e les
r ha n 50 % )
体现 。
3
.
2 甘紫菜 钾 tJ 荃因的应用价值
甘紫菜与条斑紫菜在形态 、 生活史和分子特性上
都极为相似 , 一般通过 叶状体性成熟后精子囊器在藻
体上的分布加以区分 , 或者通过分裂式区分 : 条斑紫菜
为子 4A 氏 q (也有子凡氏 sC )和早戊氏 4C , 甘紫菜为于
扣氏 4C 和早凡场 q , 但这些方法只有在藻体性成熟时
才能应用 , 且不能区别丝状体 , 有较大的局限性 [23] 。
随着同功酶技术的广泛应用 , 对条斑紫菜 、 列紫菜和甘
紫菜等位基因酶研究表明以 ) T 、 e D H 、 P GM 、 “ P D H 、
AD H 和 A K 具有多态性并且 P O D 和 G O T 可作为区分
甘紫菜和条斑紫菜两个物种的遗传标记 〔2 3 ] 。 随着分
子标记技术的发展 , 基于 oS ut h er n 杂交的限制性片段
长度多态性 ( R F L )P 技术及基于 PC R 的随机扩增片段
长度多态性 ( R A P D )技术相继用于条斑紫菜和甘紫菜
的区别〔2 4一26 ] , 这些方法本质上是利用这两个物种基因
组中的差异位点开发分子标记 。
3 讨论
3
.
1 甘紫菜 eP tJ 基因的特性和系统发生
目前普遍认为 , 藻类的不同门类是通过两级内共
生演化而来的 , 红藻来源于初级内共生 , 是具有线粒体
和过氧化物体的需氧吞噬原生生物摄取原始蓝藻细胞
的结果 , 因此 , 其质体基因的特点与核基因不同 , 而 与
蓝藻类似 [ “` ] 。 在甘紫菜 加 tJ 基因序列中, 起始密码子
为 T T G 而非 A T G , 且在此处 1、 T G 编码 M et 而非 L eu ,
这种现象在蓝藻 、 细菌 、线粒体和其他质体基因组中都
有报道 [ ’ 9· 2 0 ]。 对条斑紫菜 [川和坛紫菜〔2 2 ]E s T 序列的
研究表明 , 紫菜基因组的 G C 含量高达 6 0 % 左右 , 密码
子第三位的 G C 含量更高达 73 %到 79 % 。 甘紫菜 加 tJ
基因序列编码区的 G C 含量仅为 3 . 3 % , 密码子的第
三位核昔酸碱基有 58 个 T , 36 个 A , 9 个 C 和 8 个 G,
A T 使用的比率高达 8 4 . 6 8% , G C 使用的比率仅为
1 5
.
3 2 %
,与紫菜基 因组的 G C 含量相距甚远 , 这些特
点都表明了质体基因组的相对独立性 。
利用 3 种不同算法构建了基本一致的州 J基因系
统发生树 , 结果表明所有 钾 tJ 基 因可以划分为两大类
群 : 由质体编码的 钾 tJ 基因和蓝藻的 加 tJ 基 因亲缘关
系较近 , 聚为 1 个分支 , 而由核编码的 加 tJ 基因则聚为
另一个分支 (见图 5 ) 。 这 暗示 了 钾 tJ 基因的进 化过
程 : 由蓝藻基 因通过初级内共生转变为低等藻类的质
体基因 , 再通过质体与细胞核之间的基 因转移成为高
等藻类的核基 因 , 最终在高等植物中被质体蓝素基因
取代。 这一结果可能是内共生学说在分子水平的 1 个
图 6 CP R 产物酶切电泳图
F ig
.
6 E le e t r o p h oer
t o g r a m fo r e nz y
l l l e d i g es t io n
( tP
一
1 : 甘紫菜 P c R 产物 , tP 一 2 : 甘紫菜 cP R 产物酶切 ,
P y
一
1 :条斑紫菜 CP R 产物 , P y 一 2 : 条斑紫菜 cP R 产物醉切 ,
电泳参数 : 1%琼脂糖凝胶 , 1 x T EA 缓冲液 , 电压 4 . 25 v c/ 叭
电泳 7 5 m i n ; PC R p耐 u亡t io n o f 尸 . te ~ , P t
一
2 : e nz y m e
d ig es toln
o f P
.
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,
yP
一
l : P C R p r记 cu t ion o f
P
.
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,
P y
一
2 : e nz ” m e d lg es t lon o f P
. 岁僻 ” s泛5 .
1 % g e lose
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,
1 x T A五 bu fe r . 4
.
2 5 V / e m
,
7 5 m in )
利用甘紫菜和条斑紫菜 加 tJ 基因的差 异位点 , 结
合 P C R 和酶切技术可以开发用于甘紫菜与条斑紫菜
区别的生物分子标记 : 经过软件筛查 , 发现 1 个在甘紫
菜 加 tJ 基因中突变而在条斑紫菜 加 : J 基因中正常的
H i n d m酶切位点 (见图 4) , 如果利用本研究所用的引
物 , 分别扩增甘紫菜和条斑紫菜的对应序列 , 使用 iH dn
增刊 王孟强 , 等 :甘紫菜细胞色素 。 6 基因娜 J 克隆与序列分析 16 5
班酶切 , 则电泳后 , 条斑紫菜应为 2 条带 , 而甘紫菜应
为 1条带 , 这可以作为 1 种区别甘紫菜与条斑紫菜的
生物分子标记 。 实验结果与预期相符 , 证明这是 1 种
切实可行的方法 (见图 6 ) 。
致谢 : 本研 究在软件使 用方 面得 到 了中国海洋大
学教育部海水养殖重点实验 室原生动物研 究室的部文
波博士和苗苗博士的帮助 , 特此致谢 。
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e i f i e g or w t h
r a t e o f t h e b e s t e r d e e r e a s e d w it h t h e i n e r e a s e o f s a l i n i t y
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S im il a r t r e n d s w e r e o b s e vr
e d i n fo d
e o n -
s u m p t io n a n d e o n v e r s i o n e f f i e i e n e y
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T h e lo d
e o n v e r s i o n e f f ie ie n e y w a s 6
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0 7 一 1 8 . 1 9 % . W i t h t h e i n e r e a s e o f
s a l i n i t y
,
t h e p r o t e i n e o n t e n t i n t h e f is h bo d y w
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w h i le t h e l i p id a n d e n e r g y e o n t e n t s w e r e d e e r e a s e d
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T h e p la s m a o s m o la l i t y a n d a e t iv it y o f t h e 9 111 N a
十
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十 一
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T h e e n e r g y b u d g e t o f t h e b e s t e r s h o w e d t h a t t h e e n e r g y a s im i la t e d f or m f o d d
e e r e a s e d w it h in e r e a s in g s a l i n i
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w h i le t h a t s P e n t i n m e t a bo li
s m i n e er a s e d w i t h i n e r e a s i n g s a li n i t y
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T h e r e s u l t s i n d i e a t e d t h a t t h e b e s t e r w a s
s u i t a b l e f o r e u l t u r e i n f r e s h w a t e r o r lo w s a l in i t y w a t e r
, a n d i t m a y b e d i f f ie u l t t o b e s t o e k e d i n n a t u r a l s e a w a t e r
w i t h s a li n i t y h ig h e r t h a n 2 5 p p t
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b e s t e r ; s a l i n i t y ; g or w t h ; p l
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十
/ K
十 一
A T P a s e ; b io e h e m i e a l co m p o s i t io n ;
e n e r g y b u d g e t
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