全 文 ：文章编号:1000-0615(2007)03-0311-06
收稿日期:2006-05-29
资助项目:农业部“八五”青年基金资助项目(渔 85-93-青 05)
作者简介:李丹彤(1965-),女 ,辽宁营口人 ,副教授 ,硕士 ,从事生物化学研究。 Tel:0411-84762887, E-mail:lidantong@dlfu.edu.cn
绒线藻凝集素的分离纯化及生物活性
李丹彤1 , 　张泽虎1 , 　赵元凤1 , 　钟　莉1 , 　张泽宇1 , 　王冬梅2 , 　李　伟3
(1.大连水产学院农业部海洋水产增养殖学与生物技术重点开放实验室 ,辽宁 大连　116023;
2.大连医科大学基础医学院 , 辽宁 大连　116027;
3.大连水产学院食品工程系 , 辽宁 大连　116023)
摘要:将海洋红藻-绒线藻(Dasya villosa)经磷酸盐缓冲液抽提 , 20%～ 75%硫酸铵分级沉淀 ,
Sephadex G-200分子筛层析 ,得到绒线藻凝集素(DVL)。用 Sephadex G-200分子筛层析测得其
分子量为 547 ku。该凝集素凝集兔红细胞的作用不被 D-果糖 、D-半乳糖 、葡萄糖 、蔗糖 、甘露
聚糖 、γ-球蛋白所抑制 ,仅被牛甲状腺球蛋白所抑制 ,最小抑制浓度为 96.88 mg·L-1 。2价金
属离子Ca2+、Mg2+及 EDTA对该凝集素凝集活性没有影响 。其凝集活性在 25 ～ 80 ℃保持不
变为 28 ,90 ～ 100 ℃加热 30 min ,活力为 27 ,仍保留 50%的活性 ,说明其具有较强的耐热性 。经
t-检验 ,注射腹水型肝癌H22肿瘤细胞小鼠在DVL为低(65 mg·kg-1)、中(130 mg·kg-1)高(260
mg·kg-1)剂量时:肝指数 、脾指数与生理盐水对照组的均无显著差异;抑瘤率分别为 21%、
27%、40%,DVL的低 、中剂量下抑瘤率与生理盐水对照组的均无显著差异;在高剂量下 DVL
具有显著的抑制肿瘤细胞生长的作用(P <0.05)。
关键词:绒线藻;凝集素;牛甲状腺球蛋白;抗肿瘤作用
中图分类号:Q 949.29;Q 513+.2　　　文献标识码:A
Isolation and purification of lectin from Dasya villosa
and biological activity of DVL
LI Dan-tong1 ,ZHANG Ze-hu1 ,ZHAO Yuan-feng1 ,ZHONG Li1 ,ZHANG Ze-yu1 ,WANG Dong-mei2 ,LI Wei3
(1.Key Laboratory of Mariculture and Biotechnology Certificated by the Ministry of Agriculture ,
Dalian Fisheries University , Dalian　116023 , China ;
2.Basic Medical College , Dalian Medical University , Dalian　116027 , China;
3.Department of Food Processing , Dalian Fisheries University , Dalian　116023 , China)
Abstract:Dasya villosa lectin (DVL)was purified from marine red algae Dasya villosa by extraction with
phosphate buffered saline(PBS), followed by 20%-75%ammonium sulphate fractionation and molecular sieve
chromatography on Sephadex G-200.Molecular mass of DVL was estimated as 547 ku by Sephadex G-200.Its
hemagglutinating activity of rabbit erythrocyte could not be inhibited by D-galactose , glucose , sucrose , mannan ,
γ-globulin(human), but it could be inhibited by bovine-thyroglobulin with minimum inhibitory concentration at
96.88 mg·L-1.The lectin reaction independent on the presence of EDTA , divalent cations Ca2+ and Mg2+.
The hemagglutinating activity of lectin was 28 , which remained stable at 25-80 ℃.Moreover , the DVL was
　第 31卷第 3 期
2007 年 5月　 　　　　　　　　 　　
水　产　学　报
JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA
　　　　　　 　　　　　Vol.31 , No.3　
May , 2007　
heat-stable , with 50% activity when treated at 90-100 ℃ for 30 min.The anti-tumor activity of the DVL was
determined by using ascitic-type hepatic carcinoma H22 tumor in mouse.No significant differences of hepatic and
spleen exponents of mice were observed by t-test between the control group injected with 0.9% NaCl and
experimental groups injected with DVL at doses of 65 mg·kg-1 , 130 mg·kg-1 and 260mg·kg-1 , respectively.
The rates of tumor inhibition of three experimental groups were 21%, 27% and 40%, respectively.The
260 mg·kg-1 experimental group showed marked inhibition for tumor formation(P <0.05), however , the 65
mg·kg-1 and 130 mg·kg-1 experimental groups did not show significant differences for tumor inhibition in
comparison with control group(t-test).
Key words:Dasya villosa;lectin;bovine-thyroglobulin;anti-tumor activity
　　凝集素(lectin)是一类具有糖专一性 ,可促使
细胞凝集的蛋白质或糖蛋白。发现凝集素已有百
余年 ,但直到 20世纪 40 年代才开始为人们所关
注。早期人们对凝集素的研究集中在陆生植物 ,
自60年代后期 ,人们对不同海域的海藻凝集素进
行筛选[ 1-3] ,发现多种海藻中存在凝集素 ,并发现
褐藻凝集素凝集细胞现象只是多酚凝集血细胞的
一种假凝集现象[ 4] 。之后人们对红藻 、绿藻中的
多种凝集素进行分离纯化 、结构性质[ 5-7] 、生理功
能的研究 ,发现其具有凝集细胞 ,参与原生质体形
成[ 8] ,抑制肿瘤细胞增殖[ 9] ,激活淋巴细胞[ 9-10] ,
抑制血小板凝集[ 11]等多种功能的生物活性 ,为海
藻凝集素的开发利用奠定理论基础 。
　　国内对海藻凝集素的研究始于 20世纪 80年
代 ,最早殷丽明等[ 12]对青岛地区海藻凝集素进行
了筛选 , 90 年代我们对大连沿海绿藻(孔石
莼)[ 13] 、红藻(角叉菜)[ 14] 凝集素进行分离纯化 ,
并对褐藻(裙带菜 、海带)凝集素进行了初步研究 ,
郑怡等[ 15]对红藻(脆江蓠)等凝集素进行研究。
目前在国内外尚未见到有关绒线藻凝集素(Dasya
villosa lectin)的报道 。我们首次对 DVL 进行初步
分离纯化 ,并对其分子量等理化性质及抗肿瘤活
性进行了研究 ,以期为海洋药物的开发及海洋经
济动物病害防治开拓一条新途径。
1　材料与方法
1.1　材料
　　绒线藻(Dasya villosa)于 2002年 4月 16日采
自大连小平岛海域 ,兔 、昆明种小鼠均由大连医科
大学实验动物中心提供。腹水型肝癌 H22肿瘤细
胞 、丝裂霉素均由大连医科大学提供 。Sephadex
G-200(Pharmacia 进口分装), 蓝葡聚糖(blue
dextran 2000)(上海泊奥生物科技有限公司),牛甲
状腺球蛋白(Sigma 出品), γ-球蛋白(人)(Serva
出品), 酵母甘露聚糖(Sigma 出品),牛血清白蛋
白(上海浦江生物化学研究所),胰蛋白酶(上海化
学试剂公司), 生理盐水(大连德泽制药有限公
司),氯化钠为国产优级纯 ,其它均为国产分析纯
或生化试剂。
1.2　方法
　　DVL的分离纯化　　海藻采回后立即用过
滤海水洗净 ,用纱布及滤纸吸去水分 ,用剪刀剪成
小块分装到干净的塑料袋中 ,放入-20 ℃冰箱中
冷冻 ,然后再置于冷冻干燥机中冻干 ,将干藻用研
钵研磨成粉末(25.68 g),从中称取 12.50 g藻粉
按1∶40 比例加入 0.15 mol·L-1 NaCl 的 PBS
(0.015 mol·L-1 Na2HPO4-NaH2PO4 , pH 7.2)500
mL。在 4 ℃浸泡 16 h ,并间歇搅拌 ,离心(4 ℃, 4
500 r·min-1 ,60 min),取上清液即为粗提液。
　　在冰水浴条件下向粗提液中加入研磨好的固
体硫酸铵达 20%饱和度 ,边加边缓慢搅拌 ,然后
过夜(4 ℃)。经离心(同上),弃沉淀取上清。在
冰水浴条件下向上清液中加入研磨的固体硫酸铵
至75%饱和度 ,过夜(4 ℃),再离心(同上),弃上
清 ,收集沉淀溶于适量蒸馏水中 ,对蒸馏水透析至
无SO2-4 ,冻干 0.5 mL ,再留 1 mL测蛋白含量 ,其
余部分再对 PBS 充分透析(12 h),得 27.5 mL透
析液 。
　　取透析后样品 2.5 mL(含蛋白 73 mg)上柱 ,
层析柱为 1.6×70.0 cm ,洗脱液为含 0.02%叠氮
化钠的生理盐水 ,流速18 mL·h-1 ,每管 3 mL。洗
脱至 A280 nm<0.02 ,经 280 nm紫外测定 ,并检测
各管活性 ,收集活性高的部分 ,合并 、透析 、冻干备
用。
1.3　DVL生物活性的测定
　　蛋白含量的测定[ 16] 　　以 A280表示 ,以牛血
312 水　产　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　31卷
清白蛋白作对照 。
　　血凝活性的测定:　　参照文献[ 13] 。
　　分子量的测定[ 17] 　　采用 Sephadex G-200
分子筛凝胶过滤法。层析柱为 1.6×70.0 cm ,洗
脱液为含 0.02%叠氮化钠的生理盐水 , 流速 18
mL·h-1 ,每管 3 mL。
　　糖抑制试验　　参照文献[ 14] 。
　　热稳定性试验　　将 3.1 g·L-1 DVL粗提
液 ,并分成若干份 ,每份 1 mL ,分别在 25 ～ 100 ℃
的不同条件下温育 ,于 10 min ,30 min不同时间取
样 ,冷却后测定血凝活力 。
　　EDTA、二价金属离子对凝集活性的影响　　
在96孔 V型血凝板中 ,加入 40 μL EDTA、CaCl2、
MgCl2溶液 ,用生理盐水进行倍比稀释 ,然后加入
能凝集兔红细胞的最小浓度的凝集素 ,静置 15
min(室温),再加入 40 μL 1%兔红细胞振匀 ,静置
2 h ,观察 EDTA及二价金属离子抑制兔红细胞凝
集的最小浓度。
　　DVL对肿瘤细胞生长的抑制效应　　取昆
明种小鼠 ,体重 22 ～ 24 g ,雌雄各半 ,实验当天于
小鼠右腋皮下注射腹水型肝癌 H22肿瘤细胞 ,细
胞浓度2×106mL-1 ,每天 0.2 mL。第 7天肿瘤长
到米粒大小 ,将小鼠随即分为 5组 ,丝裂霉素组
(0.44 mg·kg-1)、DVL 低剂量组(65 mg·kg-1)、
DVL中剂量组(130 mg·kg-1)、DVL 高剂量组
(260 mg·kg-1)、生理盐水对照组 ,每天注射一次 ,
小鼠于接种3周后称重 ,处死后 ,称取肿瘤 、肝脏 、
脾脏重量 ,计算肝指数 、脾指数 、抑瘤率 。
2　结果
2.1　DVL的分离纯化
　　DVL的纯化分为两个步骤:(1)冷冻干燥 ,
PBS浸泡 ,离心得玫瑰红色粗提液;(2)20%～
75%硫酸铵分级得到紫色硫酸铵分级液;(3)
Sephadex G-200分子筛凝胶层析得到 1个蛋白峰 ,
2个活力峰(图 1),纯化结果见表 1。
图 1　DVL在 Sephadex G-200柱上的凝胶层析图
Fig.1　Gel filtration of DVL on Sephadex G-200
柱:1.6×70 cm;流速:18 mL·h-1;每管 3 mL
column:1.6×70 cm;flowing rate:18 mL·h-1;tube 3 mL
2.2　DVL的分子量
　　DVL 的 20%～ 75%硫酸铵分级液经过
Sephadex G-200分子筛层析 ,得到 1个蛋白峰 , 2
个活力峰(图 1),用胰蛋白酶(MW 24 ku),牛血清
白蛋白(MW 67 ku),γ-球蛋白(MW 165 ku)为标
准绘制标准曲线(图 2),根据绒线藻最大活力峰
的有效分配系数(Kav)求得分子量为 547 ku。
2.3　糖抑制实验
　　DVL凝集素浓度为 96.91 mg·L-1 ,用兔红细
胞进行糖抑制实验 ,结果显示 ,绒线藻凝集素不被
所测试的单糖 、二糖 、聚糖及部分糖蛋白所抑制 ,
仅被牛甲状腺球蛋白所抑制 ,最小抑制浓度为
96.88 mg·L-1(表 2)。
2.4　热稳定性
　　DVL 在 80 ℃加热 30 min 活力不变 , 但在
90 ～ 100 ℃活力下降50%, 说明DVL对热有较高
的稳定性(表 3)。
表 1　绒线藻凝集素的纯化
Tab.1　Purification of the lectin from Dasya villosa
实验步骤
fractionation
总蛋白(mg)
total protein
血凝活力(μg)
hemagglutinating act ivity
总活力(U)
total activity
比活力(U·mg-1)
specific activity
纯化倍数
purification fole
回收率(%)
yield
crude extract 9675.9 3.88 2.5×106 257.73 1 100
20%～ 75%(NH4)2SO4 858.98 1.16 7.48×105 862.10 3 30
SephadexG-200 90.63 0.40 2.27×105 2500.00 10 9
3133期　　　　　　　　　　　　李丹彤 ,等:绒线藻凝集素的分离纯化及生物活性
图 2　DVL在 Sephadex G-200 上分子量的测定
Fig.2　Molecular weight determination of the DVL on
Sephadex G-200
1.胰蛋白酶(MW 24 ku);2.牛血清白蛋白(MW 67 ku);3.γ-球
蛋白(人)(MW 165 ku);4.绒线藻凝集素
1.trypsin;2.bovine serum albumin;3.γ-globul in;4.DVL
表 2　糖和糖蛋白对 DVL血凝活性的抑制作用
Tab.2　Inhibition of hemagglutinating activity of
DVL by sugars and glycoproteins
糖&糖蛋白
sugars&
glycoproteins
起始浓度
intial
concentration
最小抑制浓度
minimum inhibitory
concentration
D-半乳糖
D-Galactose 500 mmol·L-1 -
D-果糖
D-Fructose 10 mmol·L-1 -
葡萄糖
glucose 10 mmol·L-1 -
蔗糖
sucrose 10 mmol·L-1 -
甘露聚糖
mannan
46.5 mg·L-1 -
γ-球蛋白γ-globulin 80 mg·L-1 -
牛甲状腺球蛋白
bovine
thyroglobulin
24.8 mg·L-1 96.88 mg·L-1
　　注:“ -”表示无抑制作用
　　Notes:“ -” indicate absence of inhibition
表 3　绒线藻凝集素的热稳定性
Tab.3　Heat stability of the DVL
温度(℃)
temperature
25 30 35 40 50 60 70 80 90 100
血凝活性
hemagglutination activity 2
8 28 28 28 28 28 28 28 27 27
2.5　EDTA及金属离子对 DVL凝集活性的影响
　　DVL 凝集素浓度为 96.91 mg·L-1 ,用浓度为
100 mmol·L-1的 EDTA 、CaCl2 、MgCl2 ,做抑制实
验 ,结果 DVL 对兔红细胞的凝集活性保持不变 ,
并未发生凝集抑制现象(表 4)。
表 4　EDTA及金属离子对 DVL血凝活性的抑制作用
Tab.4　Inhibition of hemagglutinating activity of
the DVL by EDTA and metal ions
试剂
reagent
起始浓度(mmol·L-1)
intial concentrat ion
相对活性(%)
relat ive act ivity
EDTA 100 100
CaCl2 100 100
MgCl2 100 100
2.6　DVL对肿瘤细胞生长的抑制效应
　　经 t-检验 ,注射腹水型肝癌 H22肿瘤细胞小鼠
在 DVL为低(65 mg·kg-1)、中(130 mg·kg-1)、高
(260 mg·kg-1)剂量时:肝指数 、脾指数与生理盐
水对照组的均无显著差异;抑瘤率分别为 21%、
27%、40%,DVL 的低 、中剂量下抑瘤率与生理盐
水对照组的均无显著差异;在高剂量下 DVL 具有
显著的抑制肿瘤细胞生长的作用(P <0.05)(表
5)。
表 5　DVL对小鼠肝癌 H22肿瘤抑制作用及对肝 、脾指数的影响
Tab.5　The inhibition of DVL for ascitic-type hepatic carcinoma H22 tumor and effects of
DVL on hepatic , spleen exponents of mice
组别
groups
样本数
sample
剂量(mg·kg-1)
dose
体重(g)
body weight
瘤重(g)
tumor weight
脾指数(0.1 mg·g-1)
spleen exponent
肝指数(0.1 mg·g-1)
hepatic exponent
抑瘤率(%)
inhibitory rate
0.9%NaCl 12 - 22.93±2.39 2.17±1.19 93.48±27.04 592.38±118.17
丝裂霉素
mitomycin
14 0.44 23.00±2.66 0.81±0.38＊＊ 60.14±13.68 590.05±40.70 63
DVL 13 65 24.50±2.44 1.71±0.66 112.12±27.89 643.81±108.37 21
8 130 24.38±3.07 1.58±0.55 107.51±25.95 594.22±64.75 27
12 260 24.92±2.23 1.30±0.78＊ 107.04±28.41 596.95±102.91 40
　　＊＊ P< 0.01 vs 0.9%NaCl;＊P< 0.05 vs 0.9%NaCl
314 水　产　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　31卷
3　讨论
　　绒线藻凝集素(DVL)粗提液经硫酸铵分级 ,
Sephadex G-200凝胶层析进行纯化 ,以 0.9%NaCl
洗脱得到 1个蛋白峰值 ,经血凝活性检测得到 2
个活力峰。用 Sephadex G-200凝胶层析只是纯化
过程其中的一步 ,要得到纯化的绒线藻凝集素尚
需进一步实验。
　　凝集素分子量的测定采用 Sephadex G-200分
子筛层析测得DVL的分子量为 547 ku ,这与普遍
认为海藻凝集素的分子量较低不同 ,在已报道的
海藻凝集素分子量较高者中 ,有仙菜目的花凋毛
藻(Griffithsia flosculosa)凝集素 , 其分子量为 300
ku ,羽毛翼藻(Ptilota Plumosa)凝集素 ,其分子量为
170 ku
[ 18] 。 Kakita 等 从英 国江蓠 (Gracilarica
verrucosa)中提取出一种分子量为 480 ku的大分子
凝集素[ 19] ,DVL是迄今为止发现的分子量最大的
海藻凝集素。
　　经糖抑制实验证明 ,DVL不被所测试的单糖
抑制 ,说明该凝集素不识别这些单糖:D-半乳糖 、
D-果糖 、葡萄糖 ,这与几乎所有的海藻凝集素均不
被D-葡萄糖 、D-半乳糖等单糖抑制一致[ 18] 。DVL
不被蔗糖抑制 ,说明其不识别 Glc(α1→※β2)Fru。
DVL不被酵母甘露聚糖 、人的γ　-球蛋白抑制 ,而
被牛甲状腺球蛋白抑制 ,从这三种物质的糖链结
构分析:牛甲状腺球蛋白糖链中只有 Manα(1-4)
Man这一结构 ,在酵母甘露聚糖 、人的γ-球蛋白的
糖链中都没有 ,因此推测该凝集素所识别的特定
糖苷键可能为Manα(1-4)Man。这与孔石莼[ 13] 、角
叉菜[ 14]凝集素的糖抑制结果一致。
　　豆科植物凝集素需要有 2价金属离子的存在
才显示活性[ 18] ,无脊椎动物凝集素在进行凝集过
程中 ,常需要一些二价金属离子的参与[ 20] 。1994
年堀贯治报道[ 18]海藻凝集素 ,除 Ptilota 属 2 种海
藻凝集素外 , 均不显示对金属离子的需求性 。
1998年 Sampaio[ 5] 、Benevides[ 21]报道的石莼 、迪尤
对枝藻(Enantiocladia duperreyi)显示对金属离子的
依赖性。同大多数海藻凝集素一样 ,EDTA 及 2价
金属离子 Ca2+ 、Mg2+对 DVL的活性无影响 。
　　DVL在 25 ～ 80 ℃血凝活力不变 ,在 90 ～ 100
℃血凝活力有所下降 ,血凝活力保留 50%,说明具
有较高的热稳定性 ,这与江蓠在100 ℃加热30min
活力不变[ 19]研究基本一致 。而与迪尤对枝藻中
提取的凝集素在 70 ℃加热 10 min活力完全丧失
的结果[ 21]不同。相比较而言 ,江蓠凝集素的糖含
量占 98.5%,迪尤对枝藻凝集素的糖含量占 6.
5%,推测可能是迪尤对枝藻凝集素中的蛋白质在
受热情况下空间构象发生改变掩盖了糖链的活性
位点 ,使其失去活性 ,因此推测 DVL 中糖含量较
高 。
　　很多海藻凝集素表现出各种各样的生物活
性 。同样 ,DVL的剂量为 260 mg·kg-1时 ,对小鼠
肝癌 H22肿瘤具有显著的抑制作用 ,但 DVL在所
测的剂量下对肝指数 、脾指数都无显著影响 ,推测
DVL的免疫增强剂作用不明显。至于 DVL的抑
瘤作用与它对小鼠自身免疫系统生物反应调节作
用的关系 ,有待进一步研究 。
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Purification and partial characterisation of the lectin from
the marine red alga Enantiocladia duperreyi (C.Agardh)
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316 水　产　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　31卷