全 文 ：第 41卷　第 1期 河 南 农 业 大 学 学 报 Vo .l 41　No. 1
2007年　　 2月 Journa l ofHenanA gricu lturalUnivers ity Feb. 　 2007
收稿日期:2006 - 10 - 02
基金项目:河北唐山市科技局硕博基金资助项目(02813031A - 4)
作者简介:李艳梅(1972 -),女 ,河南虞城人 ,讲师 ,硕士 ,主要从事植物病虫害防治研究;通讯作者:李小六.
文章编号:1000 - 2340(2007)01 -0085 - 05
大花蕙兰根腐病病原菌的分离与鉴定
李艳梅 ,李小六 ,陈 超 ,李慧云
(唐山师范学院生物科学技术系 ,河北 唐山 063000)
摘要:从唐山地区采集大花蕙兰根腐病病株样品 50份 , 按照柯赫氏法则对其进行了病原物的分离 、纯化 、致病性
测定及菌株鉴定. 结果表明 ,发病部位分离物中有 2类病原菌 , 为镰孢属(F usarium spp. )和枝顶孢属(Acremoni-
um link =Cephalosporium corda). 但主要优势菌群为镰孢属. 分离物经致病性测定和复合接种试验发现 ,茄病镰
刀菌(F. solan i)及尖孢镰刀菌(F. oxysporum)致病性最强 , 接种后发病株率达 85%以上 , 木贼镰刀菌(Fusarium
equiseti)、串珠镰孢中间变种(F. m on iliform e var. interm edium N eish e t Legge tl)和占枝顶孢霉 (A. strictum G am s. )
致病性弱 , 潜伏期长 ,接种发病率为 5% ～ 18%.占枝顶孢霉与茄病镰刀菌和尖孢镰刀菌混合接种后的发病率均
高于单独接种的发病率 .证实大花蕙兰根腐病是以茄病镰刀菌及尖孢镰刀菌为主要病原菌 ,并由木贼镰刀菌 、串
珠镰孢中间变种和占枝顶孢霉复合侵染导致的一种病害.
关键词:大花蕙兰;根腐病;分离;鉴定;镰孢属;顶孢属
中图分类号:S 43　　　　文献标识码:A
Isolation and Identification of the Pathogens Causing RootRot
D isease ofCymbid ium hybrida
LIYan-mei, LIX iao-liu , CHEN Chao, LIHui-yun
(Department o f B iological Science and Technology, Tangshan Norma lC ollege, Tang shan , 063000, Ch ina)
Abstract:Fifty samp les o f roo t ro t diseasedCymbid ium hybrida were co llec ted from house of Tangshan
during 2004. Pa thogenicity of fungal iso lates obtained from these samp les w ere tested by ve rifia l stand-
ard means of the Koch’ s Postu lation. Tw o kinds of pathogens iso lated a t the same timew e reFusarium
spp. andCepha losporium corda. The results show ed that the isola te sm ainly belonged toFusarium spp.
Infection analysis ind ica ted thatF. solani andF. oxysporum had the strongest v irulence w ith a d iseased
seedlings rate ofmo re than 85%, whereas pathogenicity rate o fF. equ iseti, F. moniliforme var. interme-
d ium N eish et Legge tl and A. strictum Gam s. ranged from 5% to 18%. W hen A. strictum Gams. w as
co inoculated w ithF. solan i andF. oxysporum , the diseased induces ofm ixed inocu lationsw ere all high-
er than those of their ind iv idua l infec tion. Our results revealed tha tF. solan i andF. oxy sporum were the
ma jo r pathogens o f roo t ro t disease o fCymbidium hybrida , whereasF. equiseti, F. moniliforme var. in-
termedium Ne ish e t Leggetl and A. strictum G ams. on ly played an accessory roles in the complex infec-
tion.
Key words:Cymbidium hybrida;roo t rot d isease;iso lation;iden tification;Fusarium;Cepha losporium
　　大花蕙兰 (Cymbid ium hybrida)根腐病是大花
蕙兰毁灭性病害之一 ,在大花蕙兰植株的任何生长
期都容易感染 ,给大花蕙兰的栽培工作造成极大的
损失 [ 1] .国内对大花蕙兰根腐病的研究报道认为 ,
引起大花蕙兰根腐病的主要病原菌是立枯丝核菌
(Rh izoctonia solani)[ 2] .因根腐病的病因较为复杂 ,
DOI牶牨牥牣牨牰牬牬牭牤j牣cnki牣牨牥牥牥牠牪牫牬牥牣牪牥牥牱牣牥牨牣牥牪牥
86　 河　南　农　业　大　学　学　报 第 41卷
各种作物的根腐病往往由多种病菌混合侵染所造
成 ,不同地区或同一地区不同年份因生态条件不
同 ,其优势菌种类都有可能不尽相同 [ 3] . 对唐山地
区采集的 50种病株进行了分离纯化与鉴定 ,以确
定唐山地区根腐病的主要致病菌.
1　材料与方法
1. 1　材料
大花蕙兰根腐病病株取自唐山市西郊苗圃大
花蕙兰生产基地.
1. 2　病原菌的分离 、纯化
取具有大花蕙兰根腐病典型症状的病根 ,在病
健交界处切取 3 cm长的一段 ,清水洗净表面杂物 ,
置一小烧杯中;用体积分数为 75%酒精擦洗表面
消毒 ,然后用无菌水换洗 4次;再用无菌解剖刀切
去材料的两端 ,切成 5 mm长的一段. 每个病根切
成 3段 , 在无菌条件下接种在 PDA 平板上. 置
28 ℃下培养.待长出菌落后 ,立即移入另一平板上
(含适量的链霉素溶液 ,抑制细菌生长 ). 将不同组
织上分离出的菌落进行单孢纯化.将获得的菌株按
不同类型编号 ,转管 ,保存于 4℃冰箱中.
1. 3　生物学特性鉴定
纯化后的菌株在 PDA、马丁氏 、查氏培养基上
培养 ,观察培养性状. 采用山东农业大学姜广正教
授推荐的玻片培养法[ 4] ,观察菌丝形态 、产孢细胞
和产孢方式 、孢子形态等.并用数码显微镜进行拍
照.参照陆家云的鉴定方法[ 5] ,比较各种孢子的形
态特征.
1. 4　大花蕙兰组培苗的栽培
将大花蕙兰组培苗从培养瓶中取出 ,在无菌水
中洗净根部 ,用灭菌水苔包裹根系栽进 5 cm的营
养钵中 ,保湿培养 15 d,备用.
1. 5　回接试验
采用针刺法 (用灭菌针刺伤根部表皮 1 ～ 2
mm ,滴加适量孢子悬液 )和石英砂磨损法接种到健
康无病的大花蕙兰根部 , 在空气相对湿度 55% ～
65%, 25 ～ 28℃下培养.接种后 4 d开始观察.每天
观察 1次 ,并记录根部发病情况. 表现症状后约 5
～ 10 d剪下部分病根再作分离培养 ,进一步确定
菌株是否为致病菌. 在健康的大花蕙兰植株根部 ,
分别采用针刺法和石英砂磨损法接上无菌水作为
空白对照.
1. 6　病原物复合侵染试验
选有致病性的不同分离菌混合 ,制成混合孢子
悬浮液 ,进行接种.
2　结果与分析
2. 1　分离结果
采集发病症状明显的病株 50株 ,其中 46株分
离到病菌 ,分离率为 92%.有 56%的病株同时分离
到镰刀菌和头孢霉两类真菌. 而有 89%的病株能
分离出镰刀菌. 分别选取典型菌株进行种的鉴定.
镰刀菌菌株为 4株 ,分别为尖孢镰刀菌 、串珠镰孢
中间变种 、茄病镰刀菌 、木贼镰刀菌;头孢霉菌株 1
株 ,为占枝顶孢霉.
2. 2　镰刀菌的生物学特性鉴定
2. 2. 1　培养性状　分别在 PDA、马丁氏 、查氏培
养基上培养镰刀菌 ,观察培养性状 ,进一步鉴定到
种.结果表明 ,在 PDA和查氏培养基上的培养性状
区别不大(略). 在马丁氏培养基上区别明显 ,产生
菌核及粘孢团的时间不同 (表 1).
2. 2. 2　形态特征观察　镰刀菌的形态特征比较结
果见表 2.
表 1　镰刀菌在马丁氏培养基上的培养性状比较
Tab le 1　Compar ison grow th cond itions of4 k inds ofFusarium onM art in m ed ium
菌株编码
S train code
培养天数 /d Cu ltu re tim e
5 9 14 20
H 001 - 2 -A
菌落绒状 , 白色 , 菌落中央略显紫色.反面菌落中心呈暗紫色 菌落长大 , 无明显的变化 出现黄色或绿色的菌核 反面菌落中心变为黑色. 菌落中央聚集黄色粘孢团和黑色菌核
H017 - 3 - B
菌落绒状 ,紫色 ,菌丝生长整齐 ,反面也呈紫色 菌丝生长旺盛 无菌核出现 菌丝生长旺盛 , 正反面都为紫色. 仍无菌核出现.无或有极少的桔黄色粘孢团产生
H023 - 3 -C
菌落薄绒状 ,浅紫色 , 有白色气生菌丝区.反面菌落中央呈土色
白色气生菌丝生长旺盛 , 菌丝较高且稠密
出现极少的黄色或绿色的菌核
反面菌落中心变为褐色. 白色气生菌丝变为乳黄色 ,干燥.有少量桔黄色粘孢团产生
H 043 - 2 -D
菌落绒状 , 粉色. 反面菌落中央显紫色 菌丝中出现浅驼色菌丝
有许多桔黄色粘孢团产生.出现黄色或绿色的菌核
反面菌落中央变为紫红色 ,浅驼色菌丝上有许多土色小颗粒 ,成粉末状
第 1期 李艳梅等:大花蕙兰根腐病病原菌的分离与鉴定 87　
表 2　镰刀菌的形态特征比较
Tab le 2　Compar ison ofm orphologica l characters of 4 k inds ofFusarium
菌株编码
S train code
小型分生孢子 大型分生孢子
形状
Shap e
分隔 /个
C om partm ent
大小 /μm
S izes
形状
Sh ape
分隔 /个
Com partm ent
大小 /μm
S izes
厚垣孢子
Ch lam ydos
pores
产孢细胞
Conidiogenous
cell
H 001 - 2 -A
卵形或长
圆筒形 0或 1
5. 2～ 7. 3×
1. 5～ 3. 6 镰刀形 3～ 5
23. 1 ～ 51. 3×
2. 6 ～ 5. 1
多 ,球形 ,间生
或顶生 短 ,单瓶梗 ,少分枝
H017 - 3 - B
纺锤形或
椭圆形 0或 1
4. 0～ 7. 5
×1. 9～ 3. 5 镰刀形 3～ 6
18. 3 ～ 49. 2
×2. 3 ～ 3. 9 球形 多芽生
H023 - 3 -C
卵行或
长圆形 0或 1
4. 9～ 10. 4×
1. 04～ 4. 16 马特型 3～ 5
15. 6 ～ 36. 4
×4. 16 ～ 5. 2
球形 , 单生或
双生
长筒形 , 单瓶梗 , 少
分枝
H 043 - 2 -D 长圆形 0或 1 4. 16～ 8. 32×
1. 8～ 3. 7
纺锤或
镰刀形 4～ 6
18. 9 ～ 49
×3. 7 ～ 5. 1
间生 ,成串
或呈结节状 单瓶梗 ,少分枝
2. 2. 3　鉴定结果　根据镰刀菌典型菌株的培养性
状及形态特征 (图 1),对照《植物病原真菌学》[ 5]
和《The Genus fusarium》[ 6]进行鉴定 ,结果表明 , 4
个菌株为镰孢属 (Fusarium spp. )中的 4个种:
H001 - 2 -A菌株为尖孢镰刀菌 (Fusarium oxyspo-
rum), H017 -3 - B菌株为串珠镰孢中间变种 (F.
moniliforme var. intermed ium Neish et Leggetl) ,
H023 - 3 - C 菌株为茄病镰刀菌 (Fusarium sola-
ni), H043 - 2 -D菌株为木贼镰刀菌 (Fusarium eq-
uiseti).
2. 3　头孢霉生物学特性鉴定
2. 3. 1　培养性状　H048 - 2 - E菌株生长较慢 ,
在 PDA平板上 25℃培养 5 d,菌落直径为 16mm.
菌落正圆形 ,湿润如细菌菌落. 缺乏气生菌丝 ,仅边
缘可见白色致密的菌丝. 菌落色泽初为白色 ,后为
淡粉色 (查氏培养基上 )或橙红色 (PDA培养基
上 ).
2. 3. 2　形态特征　占枝顶孢霉的形态特征见图
2. 从图 2可看出 ,菌丝无色 ,近直角分枝 ,分枝处稍
溢缩. 具隔膜 ,但先端菌丝不分隔 ,成熟菌丝分隔明
显.盛产厚垣孢子.分生孢子梗简单 ,短 ,无色 ,不分
隔 ,从气生菌丝上长出 ,单生 ,有时可见二叉状偶见
三叉状分枝. 轮状着生 ,基部稍粗 ,上部渐细 ,呈瓶
状结构.内壁芽生瓶梗式产孢. 分生孢子从瓶状小
梗顶端单个循序产生 ,后推至侧边 ,靠粘液把它们
粘在一起 ,遇水即散开.所以分生孢子常在产孢细
胞顶端形成粘质的孢子球 ,内含 3 ～ 40个孢子.分
生孢子无色 ,透明 ,椭圆形或短棒状 ,大小为 2. 5 ～
6. 3μm ×1. 5 ～ 3. 6μm.
2. 3. 3　鉴定结果　根据 H048 - 2 - E菌株的培养
性状及形态特征 ,该病原菌鉴定为占枝顶孢霉 (A.
strictum G am s. ).
2. 4　回接试验结果
病原菌回接试验结果表明 (表 3,图 3),接种
10 d后 ,在幼苗的根部病斑呈水浸状 ,透明 ,由乳
白色 (正常根部颜色 )变为浅黄褐色 ,后呈褐色 ,甚
至黑色 ,然后 ,根尖开始腐烂 、扭曲 、萎缩 ,变干 ,后
期病部组织破碎 ,仅留下表皮和丝状维管束. 用手
轻捏表皮剥落 ,留下维管束.病株地上部初期症状
不明显 ,慢慢的腐烂可发展到假鳞茎 ,最终发展到
叶片.此时从外部可见明显的一圈褐腐区 ,环绕植
株基部引起幼苗死亡.不同种的镰刀菌可使大花蕙
兰不同程度发病 ,但都呈典型根腐病状. 从病株再
分离的病原物形态与回接前的分离菌相同.尖孢镰
刀菌株发病最早 、最重 , 10 d时根部发病 50%, 20 d
时地上部发病 50%, 55 d地上部和地下部均发病
100%, 死株率达 66. 67%. 发病率高 , 且稳定在
91%左右. 茄病镰刀菌株发病晚些 , 13 d时根部发
病 50%, 25 d时地上部发病 50%, 死株率达
56. 27%.发病率稳定在 85%左右. 接种串珠镰孢
中间变种和木贼镰刀菌的植株发病率较低 ,且发病
不稳定 ,平均发病率分别为 5. 5%和 9. 4%.单独回
接占枝顶孢霉的植株发病最晚 , 20 d时根部才开
始出现症状 , 45 d是地上部发病 50%. 发病率在
18%左右. 按照各病原物不同组合复合接种大花蕙
兰幼苗后 ,植株的发病率均高于镰刀菌和占枝顶孢
霉分别单独接种的发病率 ,而且潜伏期显著缩短 ,
接种后约 6 d开始表现症状 , 16 d左右就达到发病
高峰.认为尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌为大花蕙兰根
腐病优势病原菌 ,其它 3种分离物为次要病原菌.
88　 河　南　农　业　大　学　学　报 第 41卷
　　A1, A2, A3分别为尖孢镰刀菌的大 、小型分生孢子和厚垣孢子;B1, B2, B3分别为串珠镰孢中间变种的大 、小型分生孢
子和厚垣孢子;C1, C2, C3分别为茄病镰刀菌的大 、小型分生孢子和厚垣孢子;D1, D2, D3分别为木贼镰刀菌的大 、小型分生
孢子和厚垣孢子(A2为 ×40物镜下拍摄 ,其它为 ×100油镜下拍摄).
Them acroconidia and m ic rocon idal, chlam ydo spores ofF. oxy sporum;The m acro conidia and m icroconida l, ch lamydospo re s o f
F. m oniliforme var. intermed ium Ne ish e t Legge tl;Them acroconidia and m icroconida l, ch lamydospores o fF. solani;Them acrocon idia
and m icroconidal, chlamydospores ofF. equiseti(A2 Objective lens ×40, o thers Ob jec tive lens ×100).
图 1　大花蕙兰根腐病 4种分离真菌的大 、小型分生孢子和厚垣孢子
F ig. 1　Themacrocon id ia andm icrocon idal, ch lamydospores of5 pathogen ic fungi of the C. hybrida root rot d isease
1.孢子着生状态;2. 分生孢子梗的形态;3.厚垣孢子(为 ×100油镜下拍摄)
1. Conidia g row th condition;2. Shape o f con idiophore;3. Chlam ydo spo res(Ob jec tive lens ×100)
图 2　占枝顶孢霉的形态特征
F ig. 2　M orpho logical character s ofA. strictum Gam s
第 1期 李艳梅等:大花蕙兰根腐病病原菌的分离与鉴定 89　
表 3　回接试验结果
Tab le 3　Re inocu lation resu lt
菌株
S train
回接株数
Reinocu lative
p lant
每株接种根数
Inocu lation
num ber
发病时间
Infect ive
tim e
再分离样本数 /个
S amp les of
reisolation
再分离得菌数 /个
S train s of
reiso lation
分离率 /%
Rate of
reisolation
尖孢镰刀菌 10 3 发病最早 30 尖孢镰刀菌 100
镰刀菌 茄病镰刀菌 10 3 发病较早 30 茄病镰刀菌 100
Fu sarium 木贼镰刀菌 10 3 很少发病 30 木贼镰刀菌 100
串珠镰孢中间变种 10 3 几乎不发病 30 串珠镰孢中间变种 100
占枝顶孢霉
A. strictum Gam s. 10 3 发病很晚 30 占枝顶孢霉 100
混合
Com p lex
尖孢镰刀菌与占枝顶孢霉 7 3 发病期提前 21 尖孢镰刀菌与占枝顶孢霉 100
茄病镰刀菌与占枝顶孢霉 7 3 发病期提前 21 茄病镰刀菌与占枝顶孢霉 100
CK 5 3 不发病 15 无 0
图 3　回接植株发病早(1)、中(2)、晚(3)期的症状
F ig. 3　Prophase, m etaphase, anaphase in fective symptom of reinocu lated p lants repect ively
3　小结与讨论
1)通过对大花蕙兰根腐病病原菌的培养特性
和形态特征的观察及其致病性检测 ,发现大花蕙兰
根腐病的优势病原菌 , 为茄病镰刀菌和尖孢镰刀
菌.而在分离病原菌过程中 ,常可同时分离到木贼
镰刀菌 、串珠镰孢中间变种和占枝顶孢霉 ,尤其是
在发病后期较为常见.推测可能是由于侵染性较强
的茄病镰刀菌及尖孢镰刀菌引起初期侵染 ,造成大
花蕙兰根局部损伤或在与寄主的相互作用中 ,干扰
了寄主细胞的代谢 ,导致植物生物能量的改变及代
谢失控 ,降低了寄主的抗病能力或产生了对病原菌
侵入具有诱导作用的化学分泌物等可能的因素 ,为
木贼镰刀菌 、串珠镰孢中间变种和占枝顶孢霉等菌
的入侵创造了合适的条件 ,待后者侵入繁殖后 ,加
速了根腐病的危害进程 ,所以试验过程中表现为发
病潜伏期缩短 , 16 d即可达到发病高峰期.这种混
合致病机制有待进一步研究.
2)本 试 验的 镰 刀 菌鉴 定 综 合 采用 了
BOOTH
[ 6]和 NELSON[ 7]系统 ,将产胞细胞的形态 ,
小型分生孢子的有无 、形状及其着生方式 ,大型分
生孢子的形态及其分隔数目作为种的主要鉴别性
状 ,而其它培养性状 ,如分生孢子的长度及宽度等
不稳定性状作为分种的参考依据. 有资料报道 [ 8] ,
研究鉴定镰刀菌时 ,根据 PSA培养基上不同的培
养性状 ,作为种的主要鉴别依据. 而本试验尝试在
马丁氏培养基上培养 ,结果发现培养性状有很大的
区别 ,认为也可作为鉴定的参考依据.
参考文献:
[ 1] 　吴连星. 大花蕙兰生产中常见病虫害及其防治措施
[ J] .亚热带植物科学 , 2001, 30(3):50 - 53.
[ 2] 　吕佩珂. 中国花卉病虫原色图鉴 [ M ] . 北京:蓝天出
版社 , 2001.
[ 3] 　孙文姬 ,简桂良 , 刘秀兰 ,等. 山东菏泽地区牡丹根腐
病病原真菌的分离鉴定 [ J] . 植物病理学报 , 1999, 29
(2):177 - 180.
[ 4] 　林清洪 ,陈昭炫. 厚朴苗根腐病的病原菌鉴定 [ J] . 植
物病理学报 , 1994, 24(4):311 -312.
[ 5] 　陆家云. 植物病原真菌学 [M ] . 北京:中国农业出版
社 , 2001.
[ 6] 　BOOTH C. The Genus Fusarium[M ] . N ew Surrey, Eng-
land:CM I, 1971.
[ 7] 　NELSON P E, TOUSSOUN T A, MARASASW F O. Fu-
sa rium species, an Illustrated M anunal fo r Identifica tion
[M ] . Un ive rsity Park, Pennsy lvana:Pennsy lvana S tate
Un ive rsity P ress, 1983.
[ 8] 　王国珍 ,鲁占魁. 宁夏枸杞根腐病病原的研究 [ J] . 微
生物学通报 , 1994, 21(6):330 -332.
(责任编辑:丁　丽 )