全 文 ：2006年 5月
M ay 2006
色 谱
Chinese Journa l of Chrom atography
Vo.l 24 No. 3
275 ～ 278
收稿日期:2005-05-22
第一作者:刘振宇 ,男 ,博士 ,副教授 , E-m a il:cosm osliu@163. com.
通讯联系人:林奇英 ,女 ,教授 , E-m a il:linqiying@ fjau. edu. cn.
基金项目:福建省科委重大项目(2000H004, 2001Z127)资助.
孔石莼质体蓝素的柱色谱纯化及其 N-端氨基酸序列的分析测定
刘振宇1, 2 , 　吴祖建 1 , 　林奇英1 , 　谢联辉 1
(1.福建农林大学植物病毒研究所 , 福建 福州 350002;2.山东农业大学植物保护学院 , 山东 泰安 271018)
摘要:通过 DEAE-Sepharose Fast F low阴离子交换柱和 Sephadex G-75凝胶过滤柱分离纯化得到了孔石莼(U lva
pertusa)的质体蓝素。其步骤为:将孔石莼样品以 0. 02 mol /L磷酸盐缓冲液(pH 7.2)进行匀浆 , 然后离心去除沉
淀 , 将上清液用硫酸铵分级盐析获得饱和度为 40%～ 80%的盐析蛋白;通过 DEAE-Sepharose柱色谱 , 在含有 0 ～
1. 0mol /L NaC l的0. 01mol /L磷酸盐缓冲液线性梯度洗脱下 , 盐析蛋白有 3个主要的洗脱峰 ,然后在 Sephadex
G-75凝胶过滤色谱柱中进一步纯化。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示 ,该蛋白质被纯化
为单一条带。根据蛋白质电泳迁移率 ,纯化蛋白质的相对分子质量约为 10 000。该蛋白质不含糖。纯化的蛋白质
经电转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜后 ,以 Edm an降解法进行 N-端氨基酸序列测定 , 前 20个氨基酸残基序列为
AA IVKLGPDDGSLAFVPSKI。通过对相关蛋白质数据库的检索 ,发现该序列与 3种已报道的海藻的质体蓝素具有
较高的序列同源性 , 其同源性分别为 85%, 85%和 90%。据此 ,认为孔石莼的质体蓝素已获得纯化 ,其 N-端 20个氨
基酸残基与已报道的海藻质体蓝素的氨基酸残基有较大的同源性 ,也存在着一定的变异。
关键词:柱色谱;质体蓝素;孔石莼;纯化;N-端氨基酸序列
中图分类号:O658　　文献标识码:A　　文章编号:1000-8713(2006)03-0275-04　　栏目类别:研究论文
Purification of P lastocynin fromUlva pertusa by Column
Chromatography and Analysis of ItsN-Term inal
Am inoAcid Sequence
LIU Zhenyu
1, 2 , WU Zujian1 , LIN Q iy ing1 , XIE L ianhui1
(1. Institute of Plant Virology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002 , China;
2. College of Plant Protection , Shandong Agricultural University, Tai ’ an 271018, China)
Abstract:Protein plastocyanin from a green alga, U lva pertu sa , has been purified. Samples
were homogenized in 0.02 m ol /L phosphate buffer (pH 7.2) and then centrifuged to remove
debris and subjected to ammonium sulfate fractionation (40%- 80% saturation). Ion exchange
column chromatography w ith DEAE-Sepharose Fast F low and gel filtration column chromatog-
raphy w ith Sephadex G-75 were then employed for further purification of plastocyanin. Three
peaks, A, B and C, were eluted w ith 0. 01 mol /L phosphate buffer, contain ing a NaC l linear
gradient from 0 to 1.0mol /L at the flow rate of32mL /h through DEAE-Sepharose chromatog-
raphy. The protein fractions contain ing the plastocyanin were then purified further w ith Sephar-
dex G-75 column chrom atography. Sodium dodecyl su lfate-polyacry lam ide gel electrophores
(SDS-PAGE) is analysis indicates that the protein w as purified to homogeneity and its relative
molecularm ass is 10 000. N-term inal am ino acid sequencewas used to identify the protein. The
protein was transblotted to PVDF m embrane and N-term inal am ino acid sequence was per-
formed via Edman degradation w ith an autom ated am ino acid sequencer. The 20 N-term inal
am ino acid residues areAAIVKLGPDDGSLAFVPSKI, which share 85% homologyw ith the 20 N-
term inal am ino acid sequence ofU. prolifera andU. arasakii , and share 90% homology w ith
the ones ofU. pertu sa form erly reported.
K ey words:column chromatography;plastocynin;U lva pertu sa;purification;N-term inal am i-
no acid sequence
色 谱 第 24卷
　　质体蓝素 (plas tocyanin)是重要的金属酶 。在
包括蓝细菌 、绿藻和高等植物在内的能进行有氧光
合作用的广泛物种中 ,它扮演着从光合系统 Ⅱ传递
电子到光合系统 Ⅰ的重要作用。质体蓝素包含近
100个氨基酸残基的多肽链以及 Ⅰ型铜离子 (也称
铜蓝位点);该铜离子结合在多肽链的 4个氨基酸
残基(即 2个组氨酸残基 、1个半胱氨酸残基和 1个
甲硫氨酸残基[ 1 -3] )上 。鉴于质体蓝素的重要意义
和它复杂的分子结构 ,人们对其结构 、晶体几何学 、
活性位点 、铜结合特性等已有了较多的研究 [ 2 -5] 。
这些研究都基于对质体蓝素进行纯化的基础上 。就
藻类而言 ,研究者曾经从不同种类的藻类 (包括小
球藻(Chlorella fusca)、石莼 (Ulva arasakii)、浒苔
[ U. prolifera (Enterom orpha prolifera )]
等 [ 6 - 9] )中纯化了质体蓝素。孔石莼(Ulva pertu sa
K jellm)是属于绿藻门 (Chlorophyta )、石莼科 (U l-
vaceae)的一种绿藻 ,在世界范围内广泛分布 ,生物
量巨大 。为了深入了解质体蓝素的结构 、功能和其
编码基因 ,我们从孔石莼中纯化了质体蓝素 ,并对其
N-端氨基酸序列进行了分析测定 。
1　材料与方法
1. 1　材料与仪器
　　孔石莼鲜样采集自福建省莆田市南日岛海域 。
将其去除杂藻 、沙石及其他类生物 ,并以蒸馏水洗净
后存放于 - 70℃超低温冰箱中保存备用 。
　　阴离子交换介质 DEAE-Sepharose Fast F low、
凝胶过滤色谱介质 Sephadex G-75和透析袋 (截留
分子质量为 10 000)均为 Amersham Pharmacia
B iotech公司产品 。聚偏二氟乙烯 (PVDF)膜为
PALL公司的产品;低分子质量标准蛋白为上海生
化所产品;丙烯酰胺 、甲叉双丙烯酰胺 、三羟甲基氨
基甲烷 (T ris)、十二烷基硫酸钠 (SDS)等购于上海
生工生物工程技术有限公司。其他生化试剂为国产
分析纯或化学纯试剂 。
　　BSZ-100自动部分收集器和梯度混合器为上海
沪西仪器公司产品;Z型系列色谱柱购自上海精科
实业有限公司;恒流泵 (YZ1515)购自保定兰格恒流
泵有限公司;Ultrospec 2100 P ro分光光度计为
Amersham Pharmacia B iotech公司产品;高速离心
机 (J2-21)为 Beckman公司产品;电泳仪 (PAC30)
为 B io-Rad公司产品 。
1. 2　方法
1. 2. 1　样品浸提及硫酸铵分级盐析
　　将孔石莼样品用 0.02 mol /L磷酸盐缓冲液
(pH 7.2)在组织匀浆器中充分匀浆 ,放置于 4 ℃下
浸提 12 ～ 24 h。以 10 000 r /m in的速率在 4℃下冷
冻离心 20 m in,弃沉淀 ,上清液即为粗蛋白浸提液。
将固体硫酸铵加至粗蛋白浸提液中使其饱和度达
40%,于 4 ℃下过夜 ,同法离心 ,弃沉淀 ,取上清液。
在该上清液中再加入固体硫酸铵至饱和度达 80%,
于 4 ℃下过夜 ,同法离心 ,收集沉淀 ,以少量 0.01
mol /L磷酸盐缓冲液 (pH 7.2)溶解 ,用该缓冲液和
蒸馏水充分透析 ,至无 SO2 -4 ,即获得硫酸铵饱和度
为 40%～ 80%的盐析蛋白 。
1. 2. 2　阴离子交换色谱纯化
　　将 DEAE-Sepharose Fast F low离子交换色谱
柱(12 cm ×1.6 cm i.d., 20 mL柱床体积 )预先用
0.01 mol /L磷酸盐缓冲液 (pH 7.2)平衡。取 3mL
“1. 2. 1”节中得到的盐析蛋白上样 。先用 0.01
mol /L磷酸盐缓冲液 (pH 7.2)进行洗脱 ,至该洗脱
液在波长为 280 nm时的吸收值(OD280)﹤ 0.01;再
用含 0 ～ 1.0 mol /L NaCl溶液的 0.01 mol /L磷酸
盐缓冲液 (总体积为 200 mL)进行线性梯度洗脱
(洗脱液流速为 32 mL /h),每 2.7 mL洗脱液收集
为一管。测定每管的 OD280值。将呈现不同蛋白质
特征吸收峰的组分分别合并 ,充分透析 ,浓缩保存 。
1. 2. 3　凝胶过滤色谱纯化
　　将 “ 1. 2. 2”节中得到的蛋白质样品 5 mL上样
于已预先用 0.01 mol /L磷酸盐缓冲液(pH 7.2)平
衡的 Sephadex G-75凝胶过滤色谱柱(90 cm ×1.6
cm i.d., 180 mL柱床体积 )。以与 “ 1. 2. 2”节所述
同样的缓冲液进行洗脱 ,流速为 0.2mL /m in。收集
洗脱液 ,每管收集 2.7 mL。测定每管的 OD280值。
同 “ 1. 2. 2”节所述 ,将呈现不同蛋白质特征吸收峰
的组分分别合并 ,充分透析。
1. 2. 4　蛋白质纯度和相对分子质量的测定
　　蛋白质纯度和相对分子质量以 SDS-聚丙烯酰
胺凝胶电泳(PAGE)和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
(Native-PAGE)测定 ,方法参考文献 [ 10] 。浓缩胶
浓度 (以质量分数计 ,下同 )为 4%,分离胶浓度为
15%。用考马斯亮蓝 R-250染色 。
1. 2. 5　蛋白质含糖量的测定
　　纯化蛋白的含糖量以苯酚 /浓硫酸法测定 ,以葡
萄糖溶液为测定标准溶液[ 11] ;以 Schiff试剂染色观
察在 SDS-PAGE上的可能糖蛋白条带 [ 12] 。
1. 2. 6　蛋白质 N-端氨基酸序列的测定
　　纯化蛋白经 SDS-PAGE测定后 ,将电泳胶和
PVDF膜置于电转系统 (M ini T rans-Blot Cell
equipment, B io-Rad),蛋白质在 100 V条件下电转
1 h至 PVDF膜。将该 PVDF膜以 0.1%考马斯亮
蓝 R-250染色 ,然后用含 10%乙酸的 50%甲醇溶液
276
　第 3期 刘振宇 ,等:孔石莼质体蓝素的柱色谱纯化及其 N-端氨基酸序列的分析测定
脱色。切取目标条带 ,以苯异硫氰酸酯法 (即 Ed-
man降解法 )在 P rocise 491蛋白质测序仪上测序 ,
共测定 N-端 20个氨基酸残基序列。
2　结果与讨论
2. 1　阴离子交换色谱纯化
　　取 “1. 2. 1”节中获得的盐析蛋白样品 3 mL上
样于 DEAE-Sepharose Fast F low阴离子交换色谱
柱 。当用 0.01 mol /L磷酸盐缓冲液 (pH 7.2)洗脱
至第 25管时 , OD280已小于 0.01。经含 0 ～ 1.0
mol /L NaCl的 0.01mol /L磷酸盐缓冲液线性梯度
洗脱后 (洗脱曲线见图 1),蛋白质被分离为 A , B, C
共 3个显著的洗脱峰 。将峰 B下的各管组分合并 、
浓缩 、透析 、保存 ,记为 UPDFB,以供进一步进行凝
胶过滤色谱研究 。
图 1　硫酸铵饱和度为 40% ～ 80%的孔石莼盐析蛋白在
DEAE离子交换色谱柱上的洗脱曲线
F ig. 1　DEAE Sepharose ion exchange column chromato-
graph ic curve of proteins ofUlva pertusa salted ou t
w ith 40% to 80% saturation of(NH 4)2SO4
图 2　蛋白组分 UPDFB在 G-75凝胶过滤色谱柱上的洗脱曲线
Fig. 2　Sephadex G-75 gel-f iltration column
chromatograph ic curve ofUPDFB samp le
(the fraction B in Fig. 1)
2. 2　凝胶过滤色谱纯化
　　将蛋白质组分 UPDFB进行进一步纯化 ,在
Sephadex G-75色谱柱中 ,蛋白质被分为 D , E , F , G
和 H共 5个主要洗脱峰(见图 2)。峰 F和峰 G处
的蛋白质组分被合并 、浓缩 、透析 ,记为 GF和 GG。
2. 3　蛋白质的分子质量的测定和含糖量的分析
　　将 GF样品进行不连续 SDS-PAGE和 Native-
PAGE分析 ,结果显示 ,图 2中 F峰下的蛋白质组分
经 PAGE分析后只有一个条带 ,表明已得到电泳纯
的蛋白质 ,该蛋白质为单体蛋白质 。根据蛋白质在
SDS-PAGE的电泳迁移率 ,计算其相对分子质量约
为10 000(见图 3)。
　　Schiff试剂染色后的蛋白质电泳胶上没有特征
性的条带出现 ,显示该蛋白质不含糖;同样 ,以苯酚 /
浓硫酸法测定蛋白质糖含量 ,也未发现糖的存在 。
图 3　GF和 GG蛋白质的 SDS-PAGE测定
Fig. 3　SDS-PAGE pattern of proteins of GF andGG
M. low m olecularm ass protein markers;1. sampleGF (the
frac tion F in F ig. 2);2. sample GG (the fraction G in Fig. 2).
2. 4　N-端氨基酸序列
　　对电转印至 PVDF膜上的纯化蛋白 GF进行
N-端氨基酸序列测定 ,共测定了 20个氨基酸残基 ,
依次为:A laA laIleV alLysLeuG lyProAspAspG lySer-
LeuA laPheValP roSerLysIle。
　　在 SW ISS-PROT蛋白质数据库 [ 13] 中 ,将所测
得的 20个氨基酸序列进行同源性检索 ,检索结果发
现 , GF蛋白的 N-端 20个氨基酸残基序列与 3种海
藻的质体蓝素的前 20个氨基酸序列具有很高的同
源性 ,与 U. prolifera [ 7]和U. arasakii[ 8] N-端 20个
氨基酸序列的同源性达 85%,与 Shibata等 [ 2]测定
的 U. pertusa的质体蓝素 N-端 20个氨基酸序列的
同源性达 90%。与 Shibata等测定的氨基酸序列相
比 , GF的序列分别在 2位和 8位以 A la-2和 Pro-8
替换其 G ln-2和 G ly-8。U. arasakii的 Gln-2、Gly-8
和 A la-12在 GF中分别成为 A la-2、P ro-8和 Ser-12;
而 U. prolifera 的前 20个氨基酸序列中 , G ly-8、
A sn-18和 Asn-19在 GF中分别变为 Pro-8、Ser-18
和 Lys-19。然而 , GF的 N-端序列中的第 8位的氨
基酸残基为脯氨酸 (Pro-8),它和供比较的 3种海藻
质体蓝素氨基酸序列的第 8位氨基酸残基 (G ly-8)
均不同(见表 1)。鉴于所获得的 GF氨基酸序列与
277
色 谱 第 24卷
其他 3种源于海藻的质体蓝素氨基酸序列的同源
性 ,以及以上所测定的 GF的其他特征 ,认为 GF即
为从孔石莼纯化获得的质体蓝素。 GF的 N-端 20
个氨基酸残基中 ,有 2个氨基酸不同于 Shibata等
所得到的质体蓝素氨基酸序列 ,其同源性为 90%,这
可能是由于孔石莼的来源不同造成的 。
表 1　 4种海藻质体蓝素氨基酸残基序列的同源性
Tab le 1　The identity comparison of 4 algae am ino residues
Algae Sequence Identity /%Number
U lva pertusa AAIVKLGPDDGSLAFVPSKI 20
U lva pro li fera [ 7] AA IVKLGGDDGSLAFVPNN I 85 20
U lva arasakii [ 8] AQ IVKLGGDDGALAFVPSK I 85 20
U lva pertusa [ 2] AQ IVKLGGDDGSLAFVPSKI 90 20
3　讨论
　　已有前人采用不同的方法 ,从一些生物体 ,主要
是高等植物中获得了质体蓝素 。本研究经过两步柱
色谱法 ,获得了纯化的孔石莼质体蓝素 ,这是对其进
行深入研究的基础 。下一步 ,我们将开展对孔石莼
质体蓝素光学特性的观察 ,测定其氨基酸序列 ,研究
其电子传递动力学及其晶体结构等。本研究获得的
N-端氨基酸序列也为孔石莼质体蓝素的基因克隆
奠定了基础 。部分工作正在进行中。
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