全 文 ：文章编号:1005-4014(2005)02-0119-04　
新月菱形藻遗传重组标记的选择
魏秋红 ,李　强 ,张苓花
(大连轻工业学院 生物与食品工程学院 , 辽宁 大连　116034)
关键词:抗生素;新月菱形藻;标记
摘要:为了选择抗生素 G418 作为新月菱形藻的遗传重组标记 , 分别研究 G418 对新月菱形藻生长
的最小抑制浓度 , 以及 G418 对携有质粒载体 pBI121 的遗传重组受体新月菱形藻的最大抗性浓
度。结果表明:25μg/m L G418 能完全抑制新月菱形藻在液体培养基中的生长;50μg/ mL G418 能
完全抑制新月菱形藻在固体培养基上长出藻落;而 G418 对携有质粒载体 pBI121 的遗传重组受体
新月菱形藻的最大抗性浓度在液体培养基和固体培养基中均是400μg/ mL 。
中图分类号:Q949.273;Q943.2　　　文献标识码:A
Selection of genetic recombinant marker for Nitzschia closterium
WEI Qiu-hong , LI Qiang , ZHANG Ling-hua
(School of Biological & Foodstuff Engineering , Dalian Institute of Light Industry , Dalian 116034 , China)
Key words:antibiotic;Nitzschia closterium ;marker
Abstract:Aimed at selecting the antibio tic G418 as the genetic recombinant marker fo r Nitzschia closteri-
um , the minimum inhibitory concentration of G418 to Nitzschia closterium and the maximum resistant
concentration of G418 to Nitzschia closterium containing PBI121 were studied respectively.It is concluded
as follows:25μg/mL G418 is capable of completely inhibiting the g row th of Nitzschia closterium in liquid
medium ;50μg/mL G418 , completely inhibiting the grow th of Nitzschia closterium on solid medium;the
maximum resistant concentration of G418 to Nitzschia closterium containing PBI121 is 400μg/mL ei ther
in liquid or on solid medium.
　　　　在藻类分子生物学研究中 ,对蓝藻 、绿藻和红藻
的研究较多 ,也较为深入[ 1～ 3] ,而硅藻生物学的研究
起步较晚 , 20世纪 90年代才开始有关于转基因硅
藻方面的研究报道。1995年Dunahay 等人[ 4]首次构
建了两个可增值 、能稳定遗传的硅藻转化子 。他们
利用隐形小环藻的 acc1 基因(编码乙酰 CoA 羧化
酶)的启动子和终止区 ,将 E .coli的 NPTⅡ(新霉素
磷酸转移酶)基因重组到质粒载体中 ,用基因枪将质
粒导入隐形小环藻(Cyclotella cryptica)和腐生舟形
藻(Navicula saprophila)中 ,得到稳定遗传表达新霉
素磷酸转移酶的转化子。这两种基因工程藻株都能
在含新霉素类似物 G418的培养基上生长。同年 ,
Smith等人[ 5]用电穿孔法将带有外源基因的质粒导
入中肋骨条藻(Skeletonema costatum),发现在转化
24 h后 β-葡糖苷酸酶或荧光素酶的活性增加了 3
倍 ,但不能稳定遗传。1996年 ,Apt等[ 6]又报道用三
角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的启动子和
终止序列将抗青黄霉素基因导入三角褐指藻 ,并得
到稳定表达。硅藻作为外源基因表达系统有独特的
优势 ,硅藻自身不含毒蛋白;生长只需要阳光 、空气
和无机盐 ,节约成本;另外硅藻富含多种生物活性物
质 ,如多糖 、高不饱和脂肪酸 、β-胡萝卜素等 ,有望增
强一些多肽药物的抗肿瘤作用 ,而且人们早就食用
海带 、紫菜等藻类 ,所以对藻类药物比较容易接受。
新月菱形藻(Nitzschia closterium)是单细胞藻类
中硅藻门的一类 ,壳面中央膨大 ,两端细长 ,向同方
向弯曲成弓形 ,细胞宽 2 ～ 3μm ,长 12 ～ 23μm ,色素
体黄褐色 ,两片 ,位于细胞中央的细胞核两侧[ 7] 。为
了选择抗生素 G418为新月菱形藻的遗传重组标记 ,
分别研究G418对新月菱形藻生长的最小抑制浓度 ,
以及G418对携有质粒载体 pBI121的遗传重组受体
新月菱形藻的最大抗性浓度。pBI121携带有 NPT-
第 24 卷第 2 期
2 0 0 5 年 6 月
　　　 　　　　　大 连 轻 工 业 学 院 学 报　　　　 　　　　
Journal of Dalian Institute of Light Industry
Vol.24 , No.2
Jun.2 0 0 5
收稿日期:2005-03-10
作者简介:魏秋红(1976 ～ ), 女 ,硕士研究生.
Ⅱ基因 ,它可以催化氨基糖苷类抗生素(如新霉素 、卡
那霉素 、庆大霉素 、G418)磷酸化 ,使用该基因转化植
物 ,可以赋予转化细胞抗 Km、庆大霉素 、G418的能
力。G418是通过抑制转座子 Tn 601 , Tn 5的基因对
细菌 ,酵母菌 ,高等植物 ,哺乳动物等细胞产生毒素 ,
目前被应用于转基因真核生物如哺乳动物细胞 、酵
母和藻的转基因筛选[ 8] 。
1　材料和方法
1.1　实验材料
1.1.1　藻种及载体
新月菱形藻(Nitzschia closterium C3)、质粒载体
pBI121 ,均由张苓花教授提供 。
1.1.2　抗生素
G418购自Sigma公司 ,G418母液的配制参照文献[ 9] 。
1.1.3　实验仪器与设备
LN-101电击仪由TAKARA 公司提供。HPG-80B光
照培养箱购自哈尔滨东联电子技术开发有限公司。
1.1.4　实验试剂
渗透液:0.2mol/ L的甘露醇 ,0.2mol/L的山梨醇。
电击缓冲液:0.5 mol/L 的 NaCl ,0.005 mol/ L
的 KCl ,0.005mol/ LCaCl2 ,0.02 mol/L 的HEPES ,
0.2 mol/L 的甘露醇 ,0.2 mol/L 的山梨醇 ,pH7.2 。
1.2　实验方法
1.2.1　新月菱形藻的培养方法
海水中加入千分之一的营养盐[ 10]即为藻液体
培养基。其中海水取自黑石礁 ,经滤纸二次过滤后
高压蒸汽灭菌备用。5倍和 10倍稀释藻液体培养
基是用蒸馏水将海水分别稀释 5倍和 10倍 ,灭菌
后加入千分之一的营养盐 。固体培养基的配方是
在液体培养基中加入 1%琼脂。
培养条件:采用光照培养箱培养藻细胞 ,参数
设置为:温度(18±1)℃,光强 3 000 lx ,光暗周期
L∶D=14 h∶10 h。为了防止藻细胞粘附瓶壁 ,培养
过程中每天两次手动摇晃藻液 。
1.2.2　G418对新月菱形藻最小抑制浓度的确定
1.2.2.1　液体培养基中 G418对新月菱形藻最小
抑制浓度的测定
采用3种不同的培养基来培养新月菱形藻 ,即藻
液体培养基、5倍稀释藻液体培养基和 10倍稀释藻液
体培养基作为实验的培养基。取培养 5 d 的藻液
20mL ,调细胞密度为 1×105 ～ 1×106个/mL。然后分
加到15个 25mL的玻璃试管中 ,其中3管不加抗生素用
作对照 ,另外 12管分别加入 4个浓度梯度的 G418
(G418所设的浓度梯度均是10 、25 、50和100μg/mL),每
个浓度梯度设 3个重复。每天定时采用KB-K-25血球
计数板计数 ,每次计3个数 ,取其平均值。
1.2.2.2　固体培养中 G418对新月菱形藻最小抑
制浓度的测定
制作 15 个平板 ,其中 3个不加抗生素用作对
照 ,另外 12 个分别加入 4 个浓度梯度的 G418
(G418所设的浓度梯度如 1.2.2.1),每个浓度梯
度设 3个重复 ,并摇匀 。然后收集经液体培养 5 d
的藻细胞 ,调细胞密度为 1×107 ～ 1×108 个/mL。
待平板充分凝固后 ,吸取 0.4 mL 混合好的藻细胞
分别涂布于 15 个平板的固体培养基表面 ,倒置于
光照培养箱中培养 ,每周观察藻的生长情况。
1.2.3　遗传重组受体新月菱形藻对 G418的最大
抗性浓度的确定
1.2.3.1　pBI121电击转化入新月菱形藻中
取培养 5 d的新月菱形藻培养液 1.5 mL ,90 g
离心 10 min ,收集藻体 ,用渗透溶液处理 1 ～ 2 h ,
90 g离心 10 min , 收集藻体 ,用电击缓冲液调至细
胞密度为 1×107 ～ 1×108 个/mL。再加入终浓度
为10μg/mL的 pBI121和 25μg/mL 的鲑精 DNA ,
充分混合均匀 , 在冰上放置 5 ～ 10 min。然后取
0.9 mL混合好的藻细胞放入电击杯中 ,用电击仪
电击 ,参数设置为2.5 kV ,11.5μF。电击结束后立
刻加入 1 mL 10倍稀释藻液体培养基 。
1.2.3.2　固体培养基中遗传重组受体新月菱形藻
对G418最大抗性浓度的测定
电击后的混合液连续光照培养 18 ～ 24 h后离心 ,
沉淀悬于10倍稀释藻液体培养基中 ,调节细胞密度为
1×107 ～ 1×108 个/mL。然后取 0.4 mL 分别涂于含
50、100 、200、300 、400和500μg/mL G418的10倍稀释藻
固体培养基上 ,倒置培养 ,每个浓度梯度设3个重复。
1.2.3.3　液体培养基中遗传重组受体新月菱形藻
对G418的最大抗性浓度
挑取 1.2.3.2中在固体培养基上形成的藻落
于 10 倍稀释藻液体培养基中 ,培养 5 d 后 ,依照
1.2.2.1的方法操作 。所选用的培养基为 10倍稀
释藻液体培养基;G418 所设的浓度梯度为 50 、
100 、200 、300 、400和 500μg/mL。
2　结果与讨论
2.1　G418对新月菱形藻最小抑制浓度的确定
2.1.1　液体培养基中 G418对新月菱形藻的最小
抑制浓度
按照方法 1.2.2.1研究在液体培养基中 G418对
新月菱形藻的最小抑制浓度 ,结果见图1。
120　　　　　　　　　　　大　连　轻　工　业　学　院　学　报 　　　　　　　　　　　第 24卷
　　图 1　3种不同培养基中G418对新月菱
形藻生长的影响
　　由图 1可见 ,在藻液体培养基和 5倍稀释藻液
体培养基中 ,4个实验浓度的 G418都不能抑制新
月菱形藻的生长;而在 10倍稀释藻液体培养基中 ,
25μg/mL 的 G418 能完全抑制新月菱形藻的生
长 ,因此在 10倍稀释藻液体培养基中 , G418对新
月菱形藻的最小抑制浓度是 25μg/mL。据 Duna-
hay 等人[ 5]研究报道 , G418 对硅藻的抑制作用随
着培养基中盐度的降低而增加 ,但是培养基中无机
离子浓度过低将影响藻的生长 ,因此本实验选择了
藻液体培养基 、5 倍稀释藻液体培养基和 10倍稀
释藻液体培养基作为确定 G418 对新月菱形藻最
小抑制浓度的实验培养基 。
2.1.2　固体培养基中 G418对新月菱形藻的最小
抑制浓度
依据 2.1.1的实验结果 ,本实验选择 10倍稀
释藻固体培养基作为研究在固体培养基中 G418
对新月菱形藻最小抑制浓度的培养基。依照
2.2.2.2的方法操作 ,结果见表 1。由表 1可见 ,随
着 G418 浓度的增加 ,新月菱形藻藻落数目减少 ,
经过3周培养 ,在含有50μg/mL G418的固体培养
基上 ,没有藻落形成 ,甚至培养 5周 ,也没有藻落形
成 。因此 ,50μg/mL G418是新月菱形藻在固体培
养基中的最小抑制浓度。
2.2　遗传重组受体新月菱形藻对 G418的最大抗
性浓度
2.2.1　固体培养基中遗传重组受体新月菱形藻对
G418的最大抗性浓度
按照方法 1.2.3.2 研究固体培养基中遗传重
组受体新月菱形藻对 G418 的最大抗性浓度 ,结果
见表 2 。由表 2 可见 , 3周后在涂有 50 、100 、200 、
300 、400μg/mL G418的固体培养基上均形成了藻
表 1　固体培养基中 G418对新月菱形藻藻落形成的影响
G418浓度梯度/μg/mL 藻落数目/个
1 2 3
平均值
0 2.50×107 2.57×107 2.61×107 2.56×107
10 6.10×106 6.30×106 6.50×106 6.30×106
25 225 239 254 236
50 无 无 无 无
100 无 无 无 无
表 2　固体培养基中G418对遗传重组受体新月菱形藻藻落形成的影响
G418浓度梯度/μg/mL 藻落数目/个
1 2 3
平均值
50 21 23 26 23
100 19 20 23 21
200 18 16 14 16
300 13 10 9 11
400 7 6 5 6
500 无 无 无 无
121第 2期　　　　　　　　　　　　　魏秋红等:新月菱形藻遗传重组标记的选择　　　　　　　　　　　　　
落 ,但是在涂有 500μg/mL G418 的固体培养基
上没有藻落形成 。因此 , 通过电击法能够将
pBI121质粒 DNA 转入新月菱形藻中 ,在固体培
养基中遗传重组受体新月菱形藻对 G418 的最大
抗性浓度是 400μg/mL。
2.2.2　液体培养基中遗传重组受体新月菱形藻
对 G418的最大抗性浓度
按照方法 1.2.3.3研究液体培养基中遗传重
组受体新月菱形藻对 G418 的最大抗性浓度 ,结
果见图 2。从图 2可见 ,随着 G418浓度梯度的增
加 ,新月菱形藻的细胞数目减少 ,当 G418 的浓度
达到 500μg/mL 时 ,遗传重组受体新月菱形藻的
生长被完全抑制 。因此液体培养基中遗传重组受
体新月菱形藻对 G418 的最大抗性浓度是
400μg/mL 。
　图 2　液体培养基中 G418 对遗传重组受
体新月菱形藻生长的影响
3　结　　论
本论文研究了 G418对新月菱形藻生长的最
小抑制浓度和携有质粒载体 pBI121的遗传重组
受体新月菱形藻对 G418 的最大抗性浓度 。实验
结果表明 ,在 10倍稀释藻液体培养基中 ,G418对
新月菱形藻的最小抑制浓度为 25 μg/mL ,而在
10倍稀释藻固体培养基中 G418对新月菱形藻的
最小抑制浓度为 50 μg/mL 。通过电击法能够将
pBI121质粒 DNA 转入新月菱形藻中 ,遗传重组
受体新月菱形藻对 G418的最大抗性浓度在固体
培养基和液体培养基中均为 400μg/mL。基于以
上实验结果 ,在以 pBI121为载体 ,以新月菱形藻
为受体的遗传转化体系中 ,可以用 G418作为重
组子筛选的标记 ,使用浓度范围在 10倍稀释藻液
体培养基中为 25 ～ 400μg/mL ,在 10倍稀释藻固
体培养基中为 50 ～ 400μg/mL。
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