全 文 ：145
响应面法优化百香果醋的发酵条件
霍丹群1，蒋 兰1，王 霜2，杨 平1，3，马璐璐2，徐 勇1，3，侯长军1
(1.重庆大学生物工程学院，重庆 400044;
2.重庆大学弘深学院，重庆 400044;
3.国家固态酿造工程技术研究中心，泸州老窖股份有限公司，四川泸州 646000)
摘 要:研究并优化了百香果醋的酿造工艺。在单因素实验的基础上，通过正交实验得到酒精发酵阶段的最佳工艺参
数:发酵温度 30℃，糖度 14%，接种量 0.15%。并采用响应面法(RSM)得到醋酸发酵阶段的最佳工艺参数:发酵温度
32.5℃，初始酒精度 6%，接种量 11%，在此条件下进行实验，发酵果醋酸度达到 4.54%。发酵得到的果醋具有百香果
特有的香味，酸爽柔和。
关键词:百香果，果醋，响应面法
Optimization of fermentation conditions for Passiflora edulis vinegar
by response surface methodology
HUO Dan－qun1，JIANG Lan1，WANG Shuang2，YANG Ping1，3，MA Lu－ lu2，XU Yong1，3，HOU Chang－jun1
(1.Bioengineering College of Chongqing University，Chongqing 400044，China;
2.Hongshen College of Chongqing University，Chongqing 400044，China;
3.National Engineering Research Center of Solid－State Brewing，Luzhoulaojiao Group Co.，Ltd.，Luzhou 646000，China)
Abstract:The production processing of Passiflora edulis vinegar was studied.Based on single experiments，the
optimal parameters of alcohol fermentation were confermed through orthogonal experiment as follows:fermentation
temperature at 30℃，14g /100mL sugar，0.15% inoculation quantity.The response surface methodology(RSM)was
employed to study the optimal parameter of acetic fermentation，the optimal parameters as follows:fermentation
temperature at 32.5℃，6% of initial alcohol content，11% inoculation quantity.Under these conditions，the acidity of
Passiflora edulis vinegar was 4.54% .The fermentation fruit vinegar had a peculiar smell of Passiflora，with adequate
sweet and acidity.
Key words:Passiflora edulis;fruit vinegar;response surface methodology(RSM)
中图分类号:TS255.47 文献标识码:A 文 章 编 号:1002－0306(2013)01－0145－05
收稿日期:2012－07－23
作者简介:霍丹群(1965－) ，女，教授，研究方向:生物大分子、植物、微
生物代谢与资源开发。
基金项目:国家自然科学基金(81102132) ;四川省科技支撑计划
(2010NZ0093) ;酿酒生物技术及应用四川省重点实验室开
放基金(NJ201103)。
百香果又称西番莲、巴西果、鸡蛋果，是西番莲
科(Passifloraceae)多年生木质藤本植物果实的通称，
因其果汁可散发出菠萝、香蕉等多种水果的浓郁香
味，故得名百香果。它是世界上已知最香的水果之
一，被国内外誉为“果汁之王”［1－2］。国内外大量实验
研究表明，百香果还具有抗炎、抗焦虑、降血脂、降血
压等多种保健功能［3－8］。随着人们生活水平的提高
和保健意识的增强，果醋越来越受到人们的关注。
一方面，果醋营养丰富，并有很好的食疗功效，能够
辅助治疗糖尿病和高血压，还有美容、减肥效果［9－12］;
另一方面，果醋酿造技术的发展，为缓解鲜果滞销和
果品资源的加工利用提供了一条有效的解决途径。
本研究以重庆区域种植的百香果为原料，对果醋酿
制工艺条件进行优化，以期为百香果醋的酿制提供
依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
百香果 市售;安琪葡萄酒用高活性干酵母
安琪酵母公司;醋酸菌 实验室保藏;果胶酶、氢氧
化钠、酵母膏、碳酸钙、亚硫酸钠 重庆博艺化学试
剂有限公司。
手持糖度计 天津镜象仪器公司;酒精浓度计
河北武强仪表厂;恒温培养箱 上海森信实验仪
器有限公司生产;恒温水浴锅 上海浦东荣丰科学
仪器有限公司;PHS－3C 精密 pH 计 上海精密科学
仪器有限公司;立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医
疗器械厂。
1.2 实验方法
1.2.1 工艺流程 百香果→清洗榨汁→粗滤→澄清→调
糖度→酒精发酵→醋酸发酵→过滤→果醋配制→果醋饮料
成品［13］。
DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2013.01.059
146
1.2.2 操作要点
1.2.2.1 选果、洗净 选取新鲜、柔软适中、基本成熟
的果实，剔除霉烂、病虫害果子后，用清水清洗
3～4次。
1.2.2.2 榨汁、果胶酶处理 将清洗后的百香果榨汁
后，加入果胶酶处理。4000 活力单位的液体果胶酶
用量为 0.05%，温度为 40℃左右，处理后所得果汁较
澄清透明。
1.2.2.3 调整糖度 为了使酿成的酒质量好，并促使
发酵顺利进行，澄清后的原汁需根据果汁成分及成
品要求调整糖度和酸度。
1.2.2.4 菌种活化 酵母菌种子培养:将 2.5g安琪酵
母用含 5%的蔗糖溶液 50mL 活化 30min，待有大量
小气泡产生即可;醋酸菌种子培养:将冻藏醋酸菌种
子接种到含 25mL种子培养基的 250mL锥形瓶中，温
度 33℃，150r /min培养 24h，作为一级种子，按 5%的
体积比将一级种子接种到种子培养基中，33℃，
150r /min培养 24h，作为二级种子。
1.2.2.5 酒精发酵 将果胶酶处理后的果汁 90℃杀
菌 10min，然后接入一定量的经活化的酵母培养液，
在密闭容器中进行，温度保持在 28～32℃，发酵时间
4d，当酒精含量为 6.0% vol 以上，转入醋酸发酵。发
酵过程中应经常检查发酵液的温度、糖、酸及酒精含
量等。
1.2.2.6 醋酸发酵 接入一定量的醋酸菌于酒精发
酵醪中，发酵温度 30～33℃。发酵时要不时搅拌或通
入空气，并每天检查发酵醪醋酸含量，发酵时间
为 7d。
1.2.2.7 后处理 发酵完毕的果醋经粗滤，在醋液中
加入适量的蔗糖等进行口味调和，制成百香果醋。
1.2.3 酒精发酵工艺条件的确定
1.2.3.1 酒精发酵工艺条件的单因素确定 250mL
锥形瓶按装瓶量 80%装瓶发酵，每个实验组重复 3
次，对酒精发酵的条件进行探索:温度(26、28、30、
32、34℃，固定糖度 14%，接种量 0.1%)、最初糖度
(8%、10%、12%、14%、16%，固定温度 30℃，接种量
0.1%)、接 种 量 (0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、
0.25%，固定温度 30℃，糖度 14%)。
1.2.3.2 酒精发酵条件优化 根据单因素实验结果，
依据正交实验原理对酒精发酵过程中的温度、糖度、
接种量三个工艺参数进行优化。采用 4 因素 3 水平
L9(3
4)的正交表进行实验设计，最后一列作为缺省
项，每个因素选择 3 个水平。
表 1 酒精发酵正交实验因素水平表
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment
for optimizing the alcohol fermentation
水平
因素
A温度(℃) B糖度(%) C接种量(%)
1 28 12 0.10
2 30 14 0.15
3 32 16 0.20
1.2.4 醋酸发酵工艺条件的确定
1.2.4.1 醋酸发酵工艺条件的单因素确定 因醋酸
菌为好氧菌，在 250mL 锥形瓶进行实验时按装瓶量
30%装瓶发酵，每个实验组重复 3 次，对醋酸发酵的
条件进行探索:温度(28、30、32、34、36℃，固定发酵
酒精度 6%，接种量 11%) ;初始酒精度(5%、6%、
7%、8%、9%，固定温度 30℃，接种量 11%) ;接种量
(5%、8%、11%、14%、17%，固定发酵温度 30℃，酒
精度 6%)。
1.2.4.2 醋酸发酵条件优化 在单因素实验基础上，
根据 Box－Behnken 中心组合实验设计原理，进行响
应面分析方法对醋酸发酵三个因素进行优化。
表 2 中心组合实验设计因素与水平表
Table 2 Factors and levels in the central composite design
因素
水平
－ 1 0 1
x1 初始温度(℃) 30 32 34
x2 初始酒精度(%) 5 6 7
x3 接种量(%) 8 11 14
1.2.5 测定方法 酒精测定:酒精计法;总糖测定:
糖度计法;总酸测定［14］:酸碱滴定法，以醋酸计;pH
测定:精密 pH计法;微生物检测:稀释平板计数法。
2 结果与讨论
2.1 酒精发酵工艺条件优化
2.1.1 不同温度对酒精发酵的影响 发酵温度分别
是 26、28、30、32、34℃，糖度 14%，酵母菌接种量
0.1%，发酵结束测定酒精度，实验结果如图 1 所示。
图 1 不同温度对酒精发酵的影响
Fig.1 Effect of different temperature
on alcoholic fermentation
从图 1 可知，随着温度的升高，发酵后酒精度呈
先上升后下降的趋势。当温度为 30℃左右时，酒精
度最高。因为在一定范围内，微生物随着温度的升
高，繁殖速度加快，但是当发酵温度过高时会使酵母
代谢过于旺盛，造成酵母提前老化，妨碍色、香、风味
的形成，还易造成杂菌滋生，不利于发酵实验的顺利
进行。故选取 30℃作为发酵过程的最适温度。
2.1.2 不同糖度对酒精发酵的影响 发酵糖度分别
是 8%、10%、12%、14%、16%，温度 30℃，接种量
0.1%，发酵结束测定酒精度，实验结果如图 2 所示。
从图 2 可知，糖度在 8% ～14%之间，发酵产生的
酒精度呈上升趋势，随后呈下降趋势。糖度高时产
生的酒精度也相对较高，但糖度过高却会抑制酵母
菌的生长，导致酒精度降低，故实验选取 14%作为发
酵初始糖度。
2.1.3 不同接种量对酒精发酵的影响 接种量分别
为 0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%，发酵温度
30℃，糖度 14%。发酵结束测定酒精度，实验结果如
147
图 3 所示。
图 2 不同糖度对酒精发酵的影响
Fig.2 Effect of different sugar degree
on alcoholic fermentation
图 3 不同接种量对酒精发酵的影响
Fig.3 Effect of different inoculation
on alcoholic fermentation
从图 3 可知，酵母接种量过少，酒精发酵就会缓
慢，生产周期相应延长。但接种量过大，发酵液里的
营养物质主要用于菌体的繁殖，造成酒精度降低。
综合考虑，选取 0.15%作为酒精发酵的接种量。
2.1.4 酒精发酵正交优化 以单因素实验中获得的
最适条件为基础，进行正交实验，考察温度、糖度、接
种量对酒精发酵的影响，以酒精度为评价指标，所得
结果如表 3。
表 3 酒精发酵 L9(3
4)条件正交实验结果
Table 3 Results and analysis of orthogonal experiment
for the alcohol fermentation
实验号 A B C 酒精度(%)
1 1 1 1 4.2
2 1 2 2 5.3
3 1 3 3 4.6
4 2 1 2 5.7
5 2 2 3 6.0
6 2 3 1 5.5
7 3 1 3 4.4
8 3 2 1 4.7
9 3 3 2 4.3
k1 4.700 4.767 4.800
k2 5.733 5.333 5.100
k3 4.467 4.800 5.000
R 1.266 0.566 0.300
根据表 3 的正交实验结果，由极差值 R 可以看
出影响醋酸发酵的因素 A ＞ B ＞ C，即酒精发酵温度
＞糖度 ＞接种量。对正交结果进行方差分析，结果
如表 4 所示，FA ＞ F0. 05(2，2) ，FB ＜ F0. 05(2，2) ，FC ＜
F0. 05(2，2) ，说明温度对酒精发酵差异显著，而糖度、
接种量差异均不显著。结合 R值和方差分析结果综
合考虑，得出以下结论:优化方案为 A2B2C2，即发酵
温度 30℃，糖度 14%，接种量 0.15%，按照最优实验
条件进行发酵，最后酒精度为 6.2%。
表 4 酒精发酵正交实验结果的方差分析
Table 4 Analysis of variance in orthogonal experiment
of alcohol fermentation
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性
A 2.727 2 31.345 19.000 *
B 0.607 2 6.977 19.000
C 0.140 2 1.609 19.000
误差 0.090 2
注:＊＊表示差异极显著(p ＜ 0.01) ，* 表示差异显著(p ＜
0.05)。
2.2 醋酸发酵工艺条件优化
2.2.1 温度对酸度发酵的影响 发酵温度分别是
28、30、32、34、36℃，发酵酒精度 6%，接种量 11%，发
酵结束测定酸度，实验结果如图 4 所示。
图 4 不同温度对醋酸发酵的影响
Fig.4 Effect of different temperature
on acetic acid fermentation
从图 4 可知，温度在 28～32℃之间，发酵产生的
酸度呈上升趋势;于 32～36℃时，呈下降趋势。当温
度为 32℃左右时，酸度最高。当温度过低时，醋酸菌
生长缓慢，产酸较低，但是温度过高，会造成菌体老
化加快，因此确定醋酸发酵的最适温度为 32℃。
2.2.2 酒精度对酸度发酵的影响 发酵初始酒精度
分别是 5%、6%、7%、8%、9%，温度 30℃，接种量
11%，发酵结束测定酸度，实验结果如图 5 所示。
图 5 不同酒精度对醋酸发酵的影响
Fig.5 Effect of different alcohol degree
on acetic acid fermentation
从图 5 可知，随着酒精度的升高，发酵产生的酸
度呈先上升后缓慢下降的趋势。当酒精度数为 6%
左右时，产酸量最大。当酒精度继续升高时，醋酸产
量反而降低，因为在发酵初期，过高的酒精度，渗透
压较高，这样会抑制醋酸菌的生长代谢，造成产酸下
148
降。故确定醋酸发酵的最适酒精度为 6%。
2.2.3 接种量对酸度发酵的影响 发酵接种量分别
是 5%、8%、11%、14%、17%，发酵温度 30℃，酒精度
6%，发酵结束测定酸度，实验结果如图 6 所示。
图 6 不同接种量对醋酸发酵的影响
Fig.6 Effect of different inoculation
on acetic acid fermentation
从图 6 可知，当接种量为 11%左右时，酸度最
高。接种量大时菌体浓度高，发酵速率较快，但当接
种量超过一定范围时，发酵体系中的营养物质会被
在醋酸菌消耗，造成产酸量降低。综合考虑，选取
11%作为醋酸发酵过程所需的接种量。
2.2.4 响应面优化结果与数据分析
2.2.4.1 模型方程的建立与显著性检验 醋酸发酵
的响应面分析依据 Box－Bebnken中心法则设计了 15
组实验，包括 3 组中心点重复实验，结果如表 5 所示。
利用 Design Expert 软件对表 5 的实验数据进行
二次多项回归拟合，获得酸度(Y)对自变量温度
(x1)、酒精度(x2)、接种量(x3)的多元回归方程:
Y = 4.51 + 0.22x1 －0.046x2 － 0.030x3 － 0.062x1x2 －
0.040x1x3－0.055x2x3－0.38x1
2－0.26x2
2－0.23x3
2
表 5 Box－Behnken中心组合设计方案及实验结果
Table 5 Box－Behnken Experiments design
and the results of these experiments
实验号 x1 x2 x3 酸度(%)
1 － 1 0 1 3.71
2 1 0 － 1 4.17
3 0 0 0 4.51
4 0 － 1 1 4.11
5 － 1 0 － 1 3.69
6 0 1 － 1 4.04
7 1 － 1 0 4.19
8 0 0 0 4.49
9 1 0 1 4.03
10 0 1 1 3.87
11 0 － 1 － 1 4.06
12 － 1 － 1 0 3.59
13 1 1 0 4.01
14 0 0 0 4.53
15 － 1 1 0 3.66
对得出的回归方程进行方差分析，结果如表 6
所示。由表 6 可知:模型 p ＜ 0.01(p ＜ 0.0001) ，说明
本实验所选用的二次多项模型具有高度的显著性。
失拟项 p ＞ 0.05(p = 0.1808) ，失拟项不显著。模型的
决定系数 R2 = 0.9951，表明酸度的实测值与预测值
之间具有很好的拟合度。因此，该模型拟合程度较
好，可以用此模型来分析和预测果醋工艺。在总的
作用因素中 x1、x1
2、x2
2、x3
2 差异极显著，x2、x1x2、x2x3
差异显著，x3、x1x3 差异不显著。因此，可以用此模型
对果醋工艺进行分析研究。
表 6 方差分析表
Table 6 Variance analysis
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 p值
模型 1.31 9 0.1500 113.25 ＜ 0.0001
x1 0.3800 1 0.3800 297.91 ＜ 0.0001
x2 0.0170 1 0.0170 13.32 0.0148
x3 0.0072 1 0.0072 5.60 0.0642
x1 x2 0.0160 1 0.0160 12.16 0.0175
x1 x3 0.0064 1 0.0064 4.98 0.0760
x2 x3 0.0120 1 0.0120 9.42 0.0278
x1
2 0.5400 1 0.5400 423.15 ＜ 0.0001
x2
2 0.2600 1 0.2600 199.88 ＜ 0.0001
x3
2 0.1900 1 0.1900 147.09 ＜ 0.0001
残差 0.006425 5 0.001285
失拟项 0.005625 3 0.001875 4.69
0.1808
(不显著)
误差项 0.0008 2 0.0004
总和 1.32 14
R2 = 0.9951 R2adj = 0.9863
2.2.4.2 响应面分析 利用 Design Expert 软件对数
据进行二次多元回归拟合，所得到的二次回归方程
的响应面图如图 7～图 9 所示，发酵温度、初始酒精
度、接种量及其交互作用对响应值的影响可以从图
中直观地反映出来，并确定各个因素的最佳水平。
等高线形状可以反映交互作用大小，当为椭圆形时，
表示交互作用显著，而圆形则表示交互作用不显著。
图 7 中，接种量固定在零水平时，酸度随着温度和酒
精度的升高而增加，达到最大值后开始降低，其等高
线呈椭圆形，说明两者交互作用显著。图 8 中，酒精
度固定在零水平时，酸度随着温度和接种量的升高
而增加，达到最大值后呈下降趋势，从等高线可知温
度与接种量的交互作用不显著。图 9 中，温度固定
在零水平时，酸度随着酒精度和接种量的升高而增
加，之后呈下降趋势，坡度较缓，从等高线可知其交
互作用为显著。
2.2.4.3 最佳条件的确定及验证实验 通过该回归
方程求解优化后的最佳工艺参数为:温度 32.74℃，酒
精度 5.78%、接种量 10.97%，此条件下酸度可达
4.55%。由于要考虑实际生产，选择优化后条件为:
温度 32.5℃，酒精度 6%、接种量 11%。并且在此条
件下进行验证实验，酸度达到 4.54%。因此采用响
应面分析方法优化得到的工艺参数较可靠。
2.3 产品质量指标
2.3.1 感官指标 色泽呈淡黄色;酸味柔和，具有百
香果特有的香味;基本澄清，有微量沉淀。
2.3.2 理化指标 总酸(以醋酸计)≥4g /100mL，总
糖含量≥1g /100mL。
2.3.3 微生物指标 根据《中华人民共和国酿造食
醋的国家标准》，微生物指标应符合《中华人民共和
国食醋卫生国家标准》，大肠菌群≤3 个 /100mL，致
病菌(肠道菌)未检出。
149
图 7 温度和酒精度交互影响酸度的曲面图
Fig.7 Response surface showing the interactive effects
of temperature and alcohol degree on acetic acid fermentation
图 8 温度和接种量交互影响酸度的曲面图
Fig.8 Response surface showing the interactive effects
of temperature and inoculation on acetic acid fermentation
图 9 酒精度和接种量交互影响酸度的曲面图
Fig.9 Response surface showing the interactive effects
of alcohol degree and inoculation on acetic acid fermentation
3 结论
本文通过正交实验确定了百香果醋酿造过程中
酒精发酵的最佳工艺参数:发酵温度 30℃，糖度
14%，接种量 0.15%，发酵后的酒精度可达 6.2%。在
酒精发酵的基础上，利用响应面分析法建立了醋酸
发酵中发酵温度、初始酒精度、接种量对百香果醋含
量间的回归模型，模型的决定系数 R2 = 0.9951，表明
该模型拟合程度较好，可以用此模型来分析和预测
果醋工艺。醋酸发酵的最佳工艺参数:温度 32.5℃，
酒精度 6%、接种量 11%，在此条件下进行实验，发酵
果醋酸度达到 4.54%。
利用百香果酿制的果醋香味浓郁，含有丰富的
维生素及各种人体需要的物质，随着人们生活水平
的提高，市场对于果醋的需求量越来越大，百香果果
醋将具有很好的开发前景。
参考文献
［1］王莹，刘忠和，康万利，等 .百香果中矿物元素分析［J］.食
品科学，2009，30(22) :328－330.
［2］杨锋，黄永春，何仁，等 .百香果加工适性的测定及提高其
出汁率的研究［J］.食品研究与开发，2008，29(5) :82－85.
［3］Dhawan K，Dhawan S，Sharma A.Passiflora:a review update
［J］.Journal of Ethnopharmacology，2004，94(1) :1－23.
［4］Singh B，Singh D，Goel R K，et al. Dual protective effect of
Passiflora incarnata in epilepsy and associated postictal depression
［J］.Journal of Ethnopharmacology，2012，139(1) :273－279.
［5］Gupta R K，Kumar D，Kumar A，et al.Antidiabetic activity of
Passiflora incarnata Linn in streptozotocin － induced diabetes in
mice［J］.Journal of Ethnopharmacology，2012，139(3) :801－806.
［6］Ana C S，Andrade A，Brito S，et al.Effects of compounds from
Passiflora edulis Sims f. flavicarpa juice on blood coagulation and
on proteolytic enzymes［J］. Protein and Peptide Letters，2012，19
(5) :501－508.
［7］Maricelma S，Sandra M B，Débora C D.Effects of Passiflora
edulis(Yellow Passion)on serum lipids and oxidative stress status
of wistar rats［J］. Journal of Medicinal Food，2012，15(1) :
78－82.
［8］Zeraik M L，Yariwake J H.Quantification of isoorientin and
total flavonoids in Passiflora edulis fruit pulp by HPLC－UV/DAD
［J］.Microchemical Journal，2010，96(6) :86－91.
［9］罗威，罗立新 .荔枝保健果醋酿造工艺研究［J］.食品工业
科技，2010，31(4) :176－178.
［10］王春霞，王敏，鲁梅芳，等 .新一代健康饮品－果醋［J］.食
品工业科技，2002，23(4) :78－79.
［11］徐辉艳，濮智颖，王汉屏，等 .桑葚果醋发酵工艺条件的
研究［J］.食品工业科技，2009，30(2) :164－165.
［12］刘月梅，白卫东，鲁周民，等 .柿果醋醋酸发酵工艺参数
优化研究［J］.农业工程学报，2008，24(4) :257－260.
［13］李树玲 .酿酒制醋技术与实例［M］.北京:化学工业出版
社，2006:228－229.
［14］谢音 .食品分析［M］.北京:科学技术文献出版社，2006:
52－66.
权威·核心·领先·实用·全面