全 文 ：药　物　生　物　技　术
Pharmaceut ical Biotechno logy 　2011 ,18(1):021 ～ 025
山葵愈伤组织培养及其风味物质的研究 ＊
张建佳 ,何凤发＊
(西南大学 农学与生物科技学院 ,重庆 北碚 400715)
摘　要　通过山葵愈伤组织的诱导培养 ,测定培养物中的风味物质 ,为通过组织培养的手段来生产药用成
分提供依据。选择山葵幼叶和叶柄作为外植体 ,以 MS 为基本培养基 , 配以不同浓度的激素进行愈伤组织的诱
导。选择继代几次以后的愈伤组织进行风味物质的测定。确定 MS+6-BA 1.0+NAA 3.0 为愈伤组织诱导的
最佳条件 ,致密型的愈伤组织经过细胞悬浮培养以后收获测定其异硫氰酸酯类含量明显高于松散型的愈伤组
织。用外植体诱导出山葵愈伤组织 ,确定了最佳诱导条件 ,并且对于细胞悬浮收获物的异硫氰酸酯类含量的测
定也得到了最佳值。
关键词　山葵;诱导;愈伤组织;异硫氰酸酯
中图分类号　S503.53　　　文献标志码　A　　　文章编号　1005-8915(2011)01-021-05
　　山葵(Eutrema wasabia (S ieb)Max im.),又
名山嵛菜 ,为十字花科山嵛菜属多年生草本植
物[ 1] ,原产日本 ,是一种名贵珍稀的香辛蔬菜 , 主
要在日本 、东南亚国家及港澳台地区消费 , 市场售
价极高 , 是一种很有发展前景的出口创汇蔬菜[ 2] 。
山葵因具有强烈刺激性的辛辣味和特殊的香辛味
而备受青睐。山葵植株体内所含特有的香辛味成
份主要为各种芥子油(即异硫氰酸 Iso thiocya-
nates)[ 3] 。在植物体被磨碎时 ,该物质在芥子苷酶
(Myrosinase)的作用下水解形成异硫氰酸酯类化
合物(Iso thiocyanate)[ 4] ,具有防腐 、抗癌 、抗感染 、
抑制血小板凝聚 、增进食欲 , 并能抑制真菌和微生
物生长[ 5] ,解除余毒 、发汗 、利尿 、镇痛 、清血 ,促进
淀粉性食物的消化 , 稳定肠胃中的维生素 C 、清除
消化道中的寄生虫等功效[ 6] 。山葵及其制品在国
内外市场上供不应求 。
在我国 , 山葵作为一种引种植物 ,研究主要集
中在其生长生态特征 、种苗快繁 、山葵黑心病及病
虫害的防治等[ 7] 。利用山葵幼叶作为外植体 ,形成
愈伤组织 ,再分化成完整植株是脱去病毒的主要途
径[ 8] 。因此本研究通过山葵愈伤组织的诱导培养 ,
并测定培养物中的风味物质 ,为通过组织培养的手
段来生产药用成分提供依据 。
1　材料和方法
1.1　材料
引进的日本山葵品种岛根三号 ,由四川天生绿
色产业有限公司提供。
1.2　方法
1.2.1　外植体的选择　选取生长快 、块茎大 、分蘖
少的山葵植株作母株。分别以山葵叶片 、叶柄为外
植体进行试验 。
1.2.2　取材和消毒　本实验初期发现外植体灭
菌比一般的组织培养要困难 ,因此 , 将外植体用
自来水洗净 ,用去污粉轻轻刷洗 ,用 75%酒精消
毒30 s ,然后放入 0.1% HgCl2(加 2 ～ 3 滴吐温
80)浸泡抽气灭菌 8 ～ 10 min , 再用无菌水冲洗
4 ～ 5次 。
1.2.3　初代愈伤组织诱导 　将山葵叶片剪成
5 mm×5 mm 、叶柄剪成 5 mm节段 ,以 MS 培养基
为基本培养基 ,附加不同激素浓度(表 1),3.0%蔗
糖 ,0.65%琼脂 ,pH6.0 ,高压灭菌 15 min。培养温
度为 15 ℃±1 ℃, 14 h/d 光照 , 平均光照强度
2 000 lx 。
21
＊ 收稿日期:2010-10-28　　　修回日期:2010-11-25
基金项目:国家星火计划项目(2002EA812002);重庆市科委应用基础项目(2003023)。
作者简介:张建佳 ,女 , 1985年生 ,四川富顺县人 ,西南大学硕士研究生 , 主要从事药用植物的生物技术 , E-mai l:zhangjianjia211@
163.com。
　 ＊ 通讯作者:何凤发 , 1964年生 ,男 ,四川达县人 ,西南大学农学与生物科技学院副教授。 E-mail:hefengfa@126.com。
Tab 1　Callus induction medium
Phy tohormons(mg/ L)
6-BA 2 , 4-D NAA
0.5 0.5 1.0 1.5 2.0 3.0 4.0 0.5 1.0 1.5 2.0 3.0 4.0
1.0 0.5 1.0 1.5 2.0 3.0 4.0 0.5 1.0 1.5 2.0 3.0 4.0
1.2.4　愈伤组织状态调控　选择四种类型的愈伤
组织(松散型 、致密型 、共存型 、水渍状)分别接种到
继代培养基上进行培养 ,每处理接种 10瓶 ,调查愈
伤组织生长情况 ,测定异硫氰酸酯含量 。
1.2.5　异硫氰酸酯含量的测定[ 4] 　精确称取样品
3 g ,放入 100mL 的磨口三角瓶中 ,然后加入 30 mL
60 ℃的热水 ,加塞置 60 ℃水浴中 30 min 。取出后
水冷至室温 ,准确加入六氢吡啶标准溶液25 mL ,加
塞放置 45min ,加溴甲酚绿—甲基红混合指示剂4滴 ,
用盐酸溶液滴定 ,当混合液由绿色变成淡红色时 ,即
为滴定终点 ,记录消耗掉的标准盐酸(0.05 mol/ L)体
积 ,按下式计算异硫氰酸脂的百分含量:
异硫氰酸酯(%)=9.915(M1V1 -M2 V2)/W
式中:M1 —六氢吡啶标准溶液的浓度 ,mol/ L
M2 —盐酸标准溶液的浓度 , mol/ L
V1 —六氢吡啶标准液的加入体积 ,mL
V2 —滴定时所消耗掉的盐酸标准溶液的体
积 ,mL
9.915—1 mol烯丙基异硫氰酸脂的重量 , g
W —取样量 , g
2　结果与分析
2.1　不同激素对山葵愈伤组织诱导的影响
将山葵叶片和叶柄分别接种到含有 0.5 mg/L
和 1.0 mg/ L 的 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)并含有
不同浓度 2 ,4-二氯苯氧乙酸(2 , 4-D)和萘乙酸
(NAA)的诱导培养基上后 , 一般 6 ～ 8 d 开始启
动。外植体切口边缘首先膨大 ,随后脱分化细胞进
行不断地分裂 ,从而形成愈伤组织 。
由表 2 ,表 3可以看出 ,在含有不同浓度的 6-
BA , 2 , 4-D和 NAA 的 MS 培养基上培养 ,叶片
和叶柄均能诱导出愈伤组织。在同样含有 6-BA
的前提下 ,加入 NAA的培养基的诱导效果明显优
于加入 2 ,4-D的培养基 。
Tab 2　Effect of differ ent ho rmones on blade callus induction
Phytoho rmones
(mg/L)
6-BA 2 ,4-D
Time
(d)
Callus
induction
rate(%)
Growth state
Phytoho rmones
(mg/L)
6-BA NAA
Time
(d)
Callus
induction
rate(%)
Growth state
0.5 0.5 8 20 　 Tawny , hard , a few 0.5 0.5 8 30　 Tawny , hard , medium
1.0 7 42.5 Pale yellow , hard , much 1.0 8 43　 G reen y ellow , hard , medium
1.5 7 46.8 Pale yellow , hard , medium 1.5 7 45.4 G reen y ellow , hard , medium
2.0 7 65 　 Light g reen , hard scattered ,
medium
2.0 7 67.5 Light green , hard scattered ,
medium
3.0 6 48 　 Tan , soft scattered hard , much 3.0 7 60　 Light green , hard scattered ,
medium
4.0 6 32 　 Tawny , soft , much 4.0 6 50.5 Yellow g reen , soft , a few
1.0 0.5 7 23.1 Yellow ash , scattered , a few 1.0 0.5 8 25　 Tawny , hard , much
1.0 6 41.7 Tawny , hard scattered , a few 1.0 8 33.3 Tawny , hard and soft , much
1.5 6 42.8 Dark yellow , hard scattered ,
a few
1.5 8 47.5 Tawny , hard and soft , much
2.0 6 45.4 Yellow , hard scattered , much 2.0 7 45.5 Green yellow , hard and soft , much
3.0 5 63.6 Stread , soft scattered hard , much 3.0 7 71　 Green yellow , hard and soft , much
4.0 6 27.3 Green yellow , soft scattered hard ,
much
4.0 7 57.5 G reen y ellow , soft , much
22 药 物 生 物 技 术 第 18 卷第 1 期　
Tab 3　Effect o f different hormones on petio les ca llus induction
Phytoho rmones
(mg/L)
6-BA 2 ,4-D
Time
(d)
Callus
induction
rate(%)
Growth state
Phytoho rmones
(mg/L)
6-BA NAA
Time
(d)
Callus
induction
rate(%)
Growth state
0.5 0.5 8 37.5 Brow n , soft scattered , medium 0.5 0.5 8 40　 Tawny , loose , much
1.0 7 45 　 Brow n , soft scattered , much 1.0 8 45　 Yellow , loose , much
1.5 7 52.5 Green yellow , soft scattered ,
much
1.5 7 60　 Stread , soft , much
2.0 7 80 　 Stread , water logging , much 2.0 7 65　 Stread , soft , much
3.0 6 75 　 Gray , waterlogging , medium 3.0 7 75　 Stread , waterlogging , medium
4.0 6 68 　 Light , green , waterlogging ,
medium
4.0 6 55　 White , waterlogging , a few
0.5 7 40 　 Brow n , hard scattered , much 0.5 8 37.5 Tawny , hard , much
1.0 6 47.5 Tawny , hard scattered , much 1.0 8 42.5 Tawny , hard and soft , much
1.0 1.5 6 57.5 Yellow , hard scattered , much 1.0 1.5 8 47.5 Tawny , hard and soft , much
2.0 6 62.5 Stread , soft scattered , medium 2.0 7 55　 G reen yellow , hard and soft ,
much
3.0 5 82.5 Green yellow , soft , medium 3.0 7 90　 G reen y ellow , hard and soft ,
much
4.0 6 72.5 Green yellow , soft , a few 4.0 7 77.5 G reen y ellow , soft , much
　　叶片与叶柄外植体接种在浓度为 0.5 和
1.0 mg/ L的 6 -BA 和不同浓度的 2 , 4 -D 以及
NAA上时 ,从表 2和表 3可以看出 ,随着 2 ,4-D浓
度的增加 ,外植体的出愈率逐渐提高。但是当 2 , 4
-D的浓度超过 2.0 ～ 3.0 mg/ L 以后 ,出愈率又随
之降低。而愈伤组织随着 2 ,4-D浓度的增加 ,由褐
黄色逐渐转变为浅绿色或者黄绿色 ,质地由低浓度
下的硬逐渐转变为软。综合比较试验的结果 ,可以
知道 ,对于诱导山葵叶片和叶柄愈伤组织的最适激
素浓度配比均为 MS+6-BA 1.0+NAA 3.0。
2.2　愈伤组织状态调控
在初代诱导愈伤组织时候的诱导培养基中
添加不同的生长调节剂 ,不仅仅是为了获得更高
的出愈率 ,也可以控制愈伤组织的质量 。但是仅
靠这一点是不够的 ,通过观察经过初代诱导形成
的愈伤组织形态学特点和细胞学特点 ,可以将其
分成三个类型 ,如表 4。这些愈伤组织生长不均
一 ,颜色或者质地也不太适合进行细胞悬浮培
养 。而将这些类型的愈伤组织在原有的诱导培
养基上继代并不能改变他们的形态。因此 ,对人
工培养的条件进行了一些改进 ,主要是对条件培
养基的成分加以调控 ,主要措施以及得到的成效
见表 5 。
Tab 4　Charac ter of the initial calli o f Eutrema wasabia
Type Appearance cha racter Cy tolog ical character
Ⅰ H oar , ex tremely soft w aterlog ging shape Long cells , ex tremely scattered shape o r long snake-
like cells , and almost no content , g rew very weak
Ⅱ Pale yellow o r reseda , loo se callus , the surface o r interi-
or with dense callus tissue mass
Round o r oval cells visible nuclei , content is no t
much , g rew more exuber ant
Ⅲ Ye llow o r g reen , the dense callus , the surface o r margin
with soft parts
Round o r o val cells , the content is rich , g row th
is no rmal
23张建佳等:山葵愈伤组织培养及其风味物质的研究
Tab 5　Measures and the result of callus regulation
Type Measure s Cha racter improvement Percentage
Ⅰ 2 , 4-D 1.0 ～ 5.0 Canno t change the o rig inal sta te 　0
ZT 0.05 +6 -BA 0.5 +NAA
0.1 , 3～ 4 generations
Initial doesnt change , the third genera tion in ca llus surface
loo se mass appear , g row th speed , g row th flush enhancement
36
ZT 0.2 , 2 ～ 3 gener ations F rom the second genera tion , the callus surface appear s buff
relax-model small g ranular cells , but ce ll g r ow th speed had
hyper thy ro idism trend
27
CH500 Cell wa te r content decrease , but g row th po tentia l is no t
str ong
11
Ⅱ or Ⅲ 2 , 4-D 1.0 ～ 5.0 Canno t change the o rig inal sta te 　0
ZT 0.05+6-BA 0.5 , 2 ～ 3 gen-
erations
Callus in unifo rm slightly dense state , g rowth
is no rmal
86
ZT 0.05+6-BA 0.5+CH500 ,
2～ 3 genera tions
Callus in good dispersion , yellow color , g row th is normal
94
　　对于这几类愈伤组织 ,仅仅改变 2 ,4-D 的浓
度 ,都不能改变原有状态 。灰白色水渍状的愈伤组
织 ,可以单独加入玉米素(ZT),或者是配以 6-BA
和 NAA等激素继代 3次左右 ,愈伤组织的状态可
以得到明显改善 。对于Ⅱ或Ⅲ类愈伤组织 ,单独加
入ZT 0.05+6-BA 0.5 ,或者配以水解酪蛋白
(CH500),继代 2到 3次以后 ,愈伤组织的状态也
能得到较好的改善。
2.3　异硫氰酸酯含量的测定结果
本试验对从叶片和叶柄外植体诱导而来的 ,不
同类型的愈伤组织分别进行了异硫氰酸酯含量的
测定 。测定结果从表 6可以得知 ,从叶片外植体诱
导而来的愈伤组织中 ,致密型与松散型进行比较 ,
不论是总生物量 ,异硫氰酸酯含量还是异硫氰酸酯
总产量都明显较高。而从叶柄外植体诱导而来的
愈伤组织中 ,也明显出现这种情况。并且 ,松散型
与水渍型相比较 ,在总生物量略低的情况下 ,异硫
　　
Tab 6　Accumulation of the ITCscontent in calli
Calli source
and trait
T otal
biomass
(g· DW)
ITCs
content
(%)
ITCs
yield
(mg)
Balde , lo ose 0.342 0.47 160.74
Blade , density 0.823 0.56 460.88
Petiole , wa te rlo gg ing 0.327 0.14 45.78
Petiole , lo ose 0.292 0.52 151.84
Petiole , density 0.691 0.68 469.88
氰酸酯含量和异硫氰酸酯总产量都显著的提高 。
另外 ,不论是从叶片还是叶柄外植体诱导 ,其松散
型和致密型的愈伤组织的这三种指标都没有明显
区别 。
3　讨　论
对于山葵初代愈伤组织的形态学和细胞学特
点进行了归纳总结 ,分成了三种类型 ,并且提出了
可行的办法对其进行试验 ,达到了改善这些类型愈
伤组织使其更加有利于细胞悬浮的目的。这对于
调整初代愈伤的形态 ,提高其生长势 ,得到更加分
散松软的继代愈伤组织 ,以及对于后期的细胞悬浮
试验 ,都有积极的意义。
从异硫氰酸酯含量的测定结果可以得知 ,虽然
松散型的愈伤组织更加有利于后期的细胞悬浮试
验 ,但是致密型的愈伤组织 ,不论是从叶片还是叶
柄外植体诱导而来 ,其总生物量 、异硫氰酸酯含量
和异硫氰酸酯总产量都明显高于松散型。
参 考 文 献
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中国农业通报 , 2000 , 16(2):45.
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食品研究与开发 , 2008 , 29(01):179.
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cyanates in food p reservat ion [ J] .Food Techno logy , 1995 ,
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添加剂 , 2007 ,(05):49.
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[ J] .西昌农业高等专科学校学报 , 2003 , 17(02):76.
Study on the Callus and CellsSuspension Culture on Eutrema Wasabia
and the Flavor Components
ZHANG Jian-jia , HE Feng-fa＊
(School of A gronomy and B iotechnolog y , Southwest Universi ty , Chongqing 400716 , China)
Abstract　The callus of Wasabia was cultured in induction medium , and the flavo r components w ere
measured in the culture.It w ill provide the basis for the product ion of pharmaceutical components.The
explants , the spi re and petio les we re cul tured in the M S with dif ferent concentrat ions of hormones for
callus induction.The f lavors of cul ture we re measured af ter subculture callus.The best recipe of the
culture medium was:MS+6-BA 1.0 mg/mL +NAA 3.0mg/mL .Iso thiocyanatescontent w as signifi-
cantly highe r by cell suspension cul ture in compact type of callus than that in loo se callus.The results
show ed that the best recipe of the cul ture medium was concluded by inducing the explants , and the best
value of iso thiocyanates content in the cell suspension has also been determined.
Key words　Eutrema wasabia , Induction , Isothiocyanates
·信　　息 ·
2011-08　HPV16型 L2N120E7E6融合蛋白 、基因 、制备方法及用途　本发明涉及一种在大肠杆菌中高效表达的人乳
头瘤病毒 16 型 L2N120E7E6 重组蛋白的密码子优化基因 ,将其插入原核表达载体 pET9a ,优化基因获得高效表达 , 表达水
平占全菌的 50%,表达蛋白经纯化后免疫小鼠 ,实验结果表明该蛋白与未经优化基因表达的蛋白具有相同的免疫原性 , 可
诱发特异性的 IFN-γ的释放 , 肿瘤生长抑制动物实验表明蛋白免疫对肿瘤的生长有明显抑制作用 , 其中 90%小鼠肿瘤细胞
生长完全抑制。该优化基因建立的 L2N120E7E6 重组蛋白原核高效表达系统能用于 HPV16 感染和相关宫颈癌的预防和
治疗疫苗的中试生产及新药研发。
2011-09　工程树突细胞及其在癌症治疗中的应用　本发明属于治疗学领域。更具体地说 ,本发明提供了制备体外
工程树突细胞的方法 ,该细胞在存在活化配体的条件下受基因表达调节系统的控制可以条件性地表达白细胞介素-12
(IL-12), 及其在动物(其中包括人)体内用于治疗目的的应用。
2011-10　一种新的大肠杆菌分裂功能相关的甲基转移酶　本发明公开了一种新的大肠杆菌分裂功能相关的甲基转
移酶。本发明通过生物信息学序列比对和结构预测的方法推测位于大肠杆菌染色体 2分钟区域的与细胞分裂密切相关的
活跃表达基因簇-dcw cluste r上的 yabC 基因表达的蛋白 YabC 是调节细胞分裂过程的甲基转移酶 , 并采用基于重组 S-
腺苷-L-高半胱氨酸核苷酶和重组 S-核糖基高半胱氨酸酶的酶偶联分析检测技术 , 通过 YabC 蛋白与大肠杆菌分裂异
常的丝状菌体细胞裂解液以及甲基供体 S-腺苷甲硫氨酸孵育 , 成功地检测到了甲基转移后生成的共同产物 S -腺苷-L
-高半胱氨酸 ,从而证明了 YabC 蛋白催化甲基转移的功能以及细胞分裂的关联特性。
25张建佳等:山葵愈伤组织培养及其风味物质的研究