全 文 ：海萝凝集素的分离纯化及性质
宋玉娟1 ,崔铁军2 ,李丹彤2 ,刘　扬2
(1.中国药品生物制品检定所 生化药室 ,北京 100050;2.大连水产学院 养殖系 , 辽宁 大连 116023)
摘要:海萝(Gloiopeltis furcata)经 PBS 缓冲液抽提 、硫酸铵分级 、DEAE-52 纤维素离子交换层析和 SephadexG-200 分子
筛层析 ,从中纯化出海萝凝集素(GFL), 在 PAGE 和等电聚焦电泳上各显示单一蛋白染色带 , 其等电点为 9.0。 用
SephadexG-200 分子筛层析测得其相对分子质量为 8 318。海萝凝集素除对人血型红细胞无凝集活性外 ,对单胞藻及兔 、
鲤 、鲫的红细胞均表现出一定程度的凝集活性 ,对兔红细胞的凝集活性最强 ,且不被已测试的 D-果糖 、D-半乳糖 、葡萄
糖 、蔗糖 、乳糖所抑制 , 而被 D-甘露糖 、牛甲状腺球蛋白 、鸡卵白蛋白 、γ-球蛋抑制。该凝集素在 pH 4.0～ 10.2 均有活
性 , 而在 pH 6.5～ 9.1 时活性较高。该凝集素在 90 ℃加热 1 h , 活力并未减弱 ,说明这种凝集素具有很强的耐热性 。
关键词:海萝;凝集素;纯化;理化性质
中图分类号:Q946.1　　文献标识码:A　　文章编号:1005-8737-(2005)02-0167-06
收稿日期:2004-05-24;修订日期:2004-08-26.
基金项目:农业部 85-青年基金资助项目(渔 85-93-青 05).
作者简介:宋玉娟(1970-),女 ,硕士 ,从事生化药的检测与研究工作.E-mail:lcx@isc.org.cn
　　凝集素是非免疫起源的蛋白质或糖蛋白 ,它不
仅具有凝集细胞 、抑制肿瘤细胞增殖 、激活淋巴细
胞 、抑制血小板凝集等多种生物活性 ,而且还可能参
与了生物体内胚胎发育和机体代谢的调控等重要的
生理和病理过程[ 1] 。
陆生生物凝集素已被大量纯化并在生物化学和
生物医学等方面得到了广泛而深入的研究和应用 。
海洋生物凝集素的生物活性绝不比陆生生物凝集素
逊色 ,尤其是海藻凝集素 ,它广泛分布于各种海藻
中[ 2] ,但是 ,由于其分离纯化困难以及原料采集受
地理条件所限制 ,从 20世纪 70年代才开始对它们
进行研究 。到 1994年为止 ,仅有 10种绿藻和 13种
红藻的凝集素被分离纯化[ 3] ,并且 ,其中从 5种海藻
得到的只是部分纯化制品 ,作为商品出售的凝集素
仅见 2种[ 4] 。其比较生物化学及更深层的研究 ,如
糖链顺序和构造的研究[ 2]尚属空白。
经笔者筛选 ,大连海域的红藻海萝(Gloiopelt is
f urcata)具有极高的生物凝集活性 ,且国内外尚未
见对其分离纯化的报道。本研究对其进行分离纯化
及性质分析 ,以期对海藻凝集素的分离提纯方法作
一些探索性研究 ,为海洋药物开发及海产经济动物
病害防治开拓出一条新的途径 。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　样品　海萝(Gloiopeltis f urcata)采于大连
市小平岛 ,兔子购于大连医科大学实验动物中心 ,
鲤 、鲫鱼购于大连市长兴市场 ,单胞藻取自大连水产
学院海养楼藻种间 ,A 、B 、O 、AB 型人血液由本校健
康学生提供。
1.1.2　试剂　SephadexG-200(Phamacia)、蓝葡聚
糖(Blue Dex tran 2000 ,上海伯奥生物科技有限公
司),DEAE-纤维素(DEAE-52 ,What man进口分
装)、核糖核酸酶(Pharmacia)、γ-球蛋白(human ,
Serva)、Ampholine(pH 3.5 ～ 10.0)等其他等电聚焦
用品均采用 LKB成套产品 ,牛血清白蛋白(上海浦
江生物化学研究所)、卵清蛋白(上海生化所东风技
术公司)、生理盐水(锦州制药一厂),其他试剂均为
国产分析纯或生化试剂 。
1.2　方法
1.2.1　海萝凝集素的分离纯化
(1)样品的采集和粗提液的制备　海藻采回后
立即用过滤海水洗净 ,用纱布及滤纸吸干表面水分 ,
分装到干净的塑料袋中 ,放入冰箱中冷冻 ,然后再置
于冷冻干燥机中冻干 ,将干藻用样品磨磨粉 ,称取藻
第 12 卷第 2 期
2 0 0 5 年 3 月
　　　　　中 国 水 产 科 学
Journal of Fishery Sciences of China
Vol.12 No.2
March 2005
粉 20.00 g 加入 400 mL PBS缓冲液中 ,间歇搅拌过
夜(4 ℃),离心(4 ℃,5 000 r/min , 55min),得到的上
清液即为粗提液 。
(2)硫酸铵分级和透析　硫酸铵分级参考赵永
芳的方法[ 5] 。冰水浴条件下 ,在粗提液的低饱和度
(30%)和高饱和度(85%)(NH 4)2SO4两侧分别做分
级实验 ,选低饱和度梯度中上清活力最强的饱和度
(35%)和高饱和度梯度中上清活力最弱的饱和度
(85%),然后在冰水浴条件下 ,向粗提液中加入研磨
好的固体硫酸铵至 35%饱和度 ,搅拌过夜(4 ℃),离
心(4 ℃,5 000 r/min ,55 min),弃沉淀取上清。在冰水
浴条件下将研磨好的固体硫酸铵加入上清中至 85%
饱和度 ,搅拌过夜(4 ℃),离心(4 ℃, 5 000 r/min ,
55 min)。透析参考文献[ 6] ,收集沉淀于透析袋中 ,
对蒸馏水透析至无 SO42-为止(10%的 BaCl2检验),
然后将样品进行冷冻干燥 。
(3)DEAE -离子交换层析 　取透析后样品
100.0mg ,用2.0mL 0.01mol/L的Na2HPO4溶解 ,上
DEAE-纤维素柱(1.6 cm ×30 cm),上样后先用
0.01 mol/L的 Na2HPO4平衡一个柱体积 ,然后用 NaCl
浓度为 0.1 mol/ L 的 pH 由 8.0(0.01 mol/L 的 Na2
HPO4)到 4.0(0.5mol/ L的NaH2PO4)的连续 pH 梯度
洗脱。流速为 30 mL/h ,3mL/ tube ,部分收集器收集 ,
751型分光光度计测 A280 ,洗脱至 A280<0.01。检测
每管的凝集活性 ,将有活力峰进行收集合并。
(4)Sephadex-G200 分子筛凝胶层析进行分离
提纯及相对分子质量测定[ 7] 　层析柱为 1.6 cm×
30 cm ,洗脱液为含 10%叠氮化钠的生理盐水 ,流速
20 mL/h , 3 mL/ tube ,样品为经过浓缩的离子交换
层析得到的活力峰。
1.2.2　聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测　参照
瑞典 LKB公司多用电泳仪操作手册进行 。胶浓度
7.5%,胶缓冲液 pH 为 8.9 ,预电泳 50 mA 、30 min ,
前电泳 20 mA 、10 min ,电泳 40 mA ,3 h ,然后用三氯
乙酸固定 ,考马斯亮蓝 R250染色 ,用冰醋酸-乙醇
脱色 ,放入保存液(乙醇冰醋酸 、冰醋酸 、甘油 、双蒸
水的体积比为 3∶1∶1∶5),最后制成干板保存。
1.2.3　蛋白质含量测定[ 8] 　采用 A 280 ,以牛血清
白蛋白作对照 。
1.2.4　凝集活性的测定　参考李丹彤 、崔铁军的方
法[ 9] 。测定凝集素对其他类型血细胞和单胞藻的
凝集活性的方法同上 ,可借助显微镜和血球计数板
进行定量 。
1.2.5　等电聚焦电泳测定等电点　等电聚焦电泳
按瑞典 LKB 公司多用电泳仪操作手册进行 。Am-
pholine的 pH 范围为 3.5 ～ 10.0 ,胶浓度为 4.8%,
胶厚度为 0.5 mm ,采用表面电极测胶板 pH 。
1.2.6　糖抑制实验和蛋白抑制实验　参照李丹彤 、
崔铁军等的方法[ 9] 。
1.2.7　pH 对血凝活力的影响 　参考 Ahmed 和
Chatterjee的方法[ 10]配制 pH 4.0 ～ 10.2 的系列缓
冲液 ,测定不同 pH条件下的血凝活力。
pH 4.00 ～ 6.00 时采用 0.015 mol/ L 的柠
檬酸-Na2HPO4缓冲液 , pH 6.50 ～ 7.50 时采用
0.015 mol/L的磷酸盐缓冲液 , pH 8.00 ～ 9.00时采
用 0.015 mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液 , pH 9.51 ～
10.14时采用 0.015 mol/L 的 Na2CO3 -NaHCO3缓
冲液 。
1.2.8　热稳定性实验　将浓度为1.0 mg/mL 凝集
素分级后样品分成若干份 ,分别在 20 ～ 90 ℃的不同
条件下温育10min 、20min 、60min ,取样 ,冷却 ,与空
白做对照 ,测定血凝活性 。
2　结果
2.1　海萝凝集素的分离纯化
(1)冷冻干燥 ,PBS 抽提 ,离心 。结果见表 1。
表 1　海萝凝集素的纯化结果
Tab.1　Purif ication of lectin from Gloiopeltis furcata
成　分
Fraction
总体积/mL
Total volume
总蛋白/mg
Total prot ion
最小活力体积/μL
Hemagglutinating
总活力/ U
Total activity
比活力/(U·mg -1)
Specific activity
纯化倍数
Puri fication t imes
活力回收率/ %
Yield
粗提液 C rude Ext ract 400　 2 733.88 10 4.00×104 14.63 1 100
35%(NH4)2SO 4 391　 1 811.60 16 2.44×104 13.47 1 61
85%(NH4)2SO ＊4 667　 667.00 20 3.33×104 49.93 3 83
离子交换层析
Ion-exchange chromatography 　3.0 　63.27 40/ 29 3.84×104 606.92 41 96
分子筛凝胶过滤 Gel fi ltrat ion 15.0 　27.83 40/ 25 1.20×104 431.19 29 30
　＊　透析干燥后配成 1 mg/mL 的溶液.
1 mg/mL dialysed and dried sample.
168　 中 国 水 产 科 学 第 12 卷
　　(2)硫酸铵分级及透析 ,选低饱和度梯度中上清
活力最强的饱和度 35%和高饱和度梯度中上清活
力最弱的饱和度 85%。有关数据见表 1。
(3)DEAE -纤维素层析 ,得到一个蛋白峰 ,只
有蛋白峰之后的 58管有活性 ,结果见表 1和图 1。
图 1　DEAE-纤维素离子交换层析
Fig.1　Ion-exchange chromato graphy of lectin from Gloiopeltis furcata and from Gloiopeltis furcata
　　(4)SephadexG -200 分子筛层析得一个蛋白
峰 ,为活力峰 ,结果见表 1。合并有活性部分 ,透析 ,
冷冻干燥得白色样品 。在 PAGE 上显示一条蛋白
质染色带 ,结果见图 2 。
图 2　聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
Fig.2　Polyacrylamide gel electrophoresis pattern
a.(NH4)2SO4 f ract ionation;b.Purified GFL
2.2　海萝凝集素的理化性质
2.2.1　海萝凝集素的相对分子质量　海萝凝集素
经SephadexG -200 分子筛层析 ,得到一个活性峰。
以核糖核酸酶(ribonuclease)(13 700),卵清蛋白(Egg
albumin)(45 000), 牛血清白蛋白(bovine serumalbu-
min)(67 000), γ-球蛋白(gamma-globulin)(165 000)
为标准绘制标准曲线(图 3)。根据海萝凝集素最大
活力峰位的 Kav值求得相对分子质量为8 318。
图 3　SephadexG-200 测定相对分子质量的结果
Fig.3　Molecular weight determination of the Gloiopeltis
furcata lectin on sephadexG-200
2.2.2　海萝凝集素的等电点　纯化后的海萝凝集
素用等电聚焦的方法得到单一蛋白染色带 ,其等电
点为 9.0(图 4)。
2.2.3　海萝凝集素的血凝活性及单胞藻的凝集活
性　用人的A 、B 、O 、AB 4种血型红细胞及鲤(com-
mon carp)、鲫(crucian carp)、兔(rabbit)红细胞进行
血凝活性实验 , 用新月菱形藻(Nitzschia closteri-
um)、亚心形扁藻(Platymonas subcordi formis)、叉
鞭金藻(Dicrateria)和小球藻(Chlorel la spp.)做单
胞藻凝集活性实验 ,结果见表 2。
2.2.4　海萝凝集素的热稳定性　海萝凝集素的耐
热性较高 ,从 20 ～ 90 ℃活性保持稳定 。
2.2.5　海萝凝集素的糖抑制实验和蛋白抑制实
第 2 期 宋玉娟等:海萝凝集素的分离纯化及性质 169　
验　用兔红细胞进行糖抑制实验 ,结果显示海萝凝
集素只被甘露糖抑制 ,最小抑制浓度为 0.5 mol/ L。
以等量生理盐水代替凝集素作为对照 ,结果发现甘
露糖和红细胞发生凝集 ,蔗糖使红细胞沉降速度变
慢 ,但最终下沉在血凝板 V 型孔底部形成明显红
点。实验所用 3种蛋白在一定浓度下均表现出抑制
作用 ,但浓度升高到一定程度则表现出促凝现象 ,结
果见表 3。
2.2.6　pH对海萝凝集素的血凝活力的影响　海
萝分级透析后的干粉制成 1.0 mg/mL 的溶液 ,在
pH 4.0 ～ 10.2缓冲系统中室温静置 2 h ,用兔红细
胞测定其血凝活力 。像大多数海藻凝集素一样 ,海
萝凝集素在宽的 pH 范围内表现出凝集活力 ,在 pH
6.5 ～ 9.1范围内保持稳定 ,结果见表 4 。
图 4　等电聚焦电泳结果
Fig.4 　Isoelectrofocusing electrophoretic pattern of puri-
fied GFL
表 2　海萝凝集素的血凝活性及单胞藻凝集活性
Tab.2　Hemagglutinating activity of Gloiopeltis furcata lectin
项　目
Item
兔
Rabbit
鲤
Common
carp
鲫
Crucian
carp
人血型 Human
A B O AB
菱形藻
Nitzschia
closterium
扁　　藻
Platymonas
subcordiformis
叉鞭金藻
Dicrateria
小球藻
Chlorella spp.
凝集活性
Hemagglutinating
activity
23 22 22 20 20 20 20 21 21 21 21
表 3　蛋白对海萝凝集素凝集活性的抑制
Tab.3　Inhibition of hemagglutinating activity of Gloiopeltis furcata lectin by proteins mg/ mL
项　　目
I tem
牛甲状腺球蛋白
Bovine thg roglobulin
鸡卵白蛋白
Egg albumin
γ-球蛋白
Gamma-globulin
最小抑制浓度 Minimum inhibitory concentration 15.20 1.56 0.45
最小促凝浓度 Minimum concentration 61.00 6.25 3.63
表 4　海萝凝集素的 pH稳定性
Tab.4　pH stability of Gloiopeltis furcata lectin
pH 4.0 4.5 5.0 5.6 6.0 6.5 6.9 7.2 7.5 8.0 8.6 9.1 9.6 10.2
血凝活力
Hemagglutinating
activity
21 21 21 21 21 22 22 22 22 22 22 22 21 21
3　讨论
实验采用海藻凝集素分离提纯的经典方法 ,即
纤维素离子交换层析和 Sephadex 分子筛层析相结
合的方法 , DEAE-52 纤维素离子交换层析实验发
现 ,海萝对 NaCl 提供的离子强度改变反应明显 。
经过对洗脱液 pH 梯度和 NaCl浓度的反复调整 ,本
实验得到了较好的纯化效果 ,即只有一管有活力。
海萝经过上述两步层析后 ,在(NH4)2SO4分级的基
础上纯化了 41 倍 ,其中 DEAE-52离子交换层析的
活力回收率高达 96%。经以上两步纯化得到了较
纯的凝集素制品 ,该制品经 PAGE 及等电聚焦均显
170　 中 国 水 产 科 学 第 12 卷
示一条蛋白染色带。但上述方法的缺点是两步层析
使凝集素有较多的损失。
用SephadexG-200分子筛层析测得海萝凝集素
的相对分子质量为 8 318与文献[ 2-3]关于海藻凝
集素的相对分子质量较小(4.2 ～ 43 kD)的报道相符
合。已报道的海藻凝集素最低的相对分子质量为
3.5 kD[ 11] ,这与陆生植物凝集素的相对分子质量多
在 10万左右形成鲜明对照 。红翎菜属 3种凝集素
的蛋白质 N -端 AA 排列顺序基本相同 ,但与陆生
植物的迥然不同 ,所以海藻凝集素的分子构造对研
究凝集素分子进化有着特殊意义。
海萝凝集素对单细胞具有凝集活性 ,这在国内
尚属首次报道。它为海洋经济动物病害防治提供了
有力的理论和实践基础 。此外 ,海萝凝集素还对兔
红细胞表现出极强的凝集活性 。
凝集素所显示的种种生物活性 ,可能都是凝集
素和复合糖蛋白的糖链进行特异性结合所引起的 。
所以研究其识别的糖链结构非常重要。糖抑制实验
表明 ,牛甲状腺球蛋白 、鸡卵白蛋白和 γ-球蛋白对
海萝凝集素在超过一定浓度时表现促凝作用 。笔者
推测 ,促凝作用可能是由于这些蛋白和红细胞膜上
凝集素的活性结合位点直接或间接作用引起的。也
有文献[ 3]推测 ,这是一种异构现象所致 。确切的结
果尚需进一步研究。
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Isolation ,purification and characterization of lectin from Gloiopeltis furcata
SONG Yu-juan1 , CUI Tie-jun2 , LI Dan-tong2 ,LIU Yang2
(1.Department of Biochemistry , National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biolo gical Products , Beijing 100050 , China;
2.Depar tment of Aquaculture, Dalian F isheries College , Dalian 116023 , China)
Abstract:Lectins are proteins or glycoproteins.They show specif ic in agglutination fo r many kinds of cells.
They behave important regularization function and some other activation in o rganism , such as inhibi ting the
increment of tumor cell , activating lymphocyte and inhibiting the agglutinat ion of blood platelet , and they
are also concerned w ith the process of fetation and metabolization.Lectins from terrest rial plants and ani-
mals have been isolated , characterized and exploited ex tensively in many aspects of biochemist ry and
biomedicine.There has no t been a comparable utilization of lectins from marine algae ,mainly due to diff icul-
ties in their isolation and obtaining suf ficient material for study.The real study of marine algal lectins began
in the 1970s , and by the end of 1994 , only 10 kinds of g reen marine alg ae and 13 kinds of red marine algae
were purified.In addition ,5 of the marine algae were partly purified ,while only 2 of them were sold as puri-
fied commodity , relatively few algal lectins have been purif ied and characterized in detail.We screened out
red marine algae Gloiopeltis furcata in the sea near to Dalian ,which showed more po tentiality than some
第 2 期 宋玉娟等:海萝凝集素的分离纯化及性质 171　
other marine alg ae in hemagglutinating activity.There hadn t been any report about the isolation ,purifica-
tion and characterization of lectin from Gloiopeltis furcata(GFL)before.We purif ied it and examined part
of its characterization in order to explore the method of purifying marine algae lectins for the purpose of de-
velopment of marine medicine and the approach of prevention and cure of diseases in marine culture ani-
mals.
GFL was purified by ex traction w ith PBS , follow ed by 35%-85% ammonium sulfate f raction ,dialysis
ag ainst dist illed w ater and a combination of ion-exchange chromatog raphy on DEAE-52 cellulose and gel fil-
t ration on sephadexG-200.The columns of 1.6 cm ×30 cm are sui table for both.One sing le band appeared
on both PAGE and isoelect rofocusing electrophoretogram of the lectin.Its isoelect ric point w as 9.0 , and i ts
relative molecular weight w as 8 318 on sephadexG-200.GFL displayed some agg lutination activity w ith
Chlamydomonas , erythrocytes of rabbit , common carp and crucian carp ,but not any w ith erythrocytes of hu-
man (A ,B ,AB ,O).The hemagg luting activity follow ed the order as ery throcy tes of rabbi t (23)>erythro-
cytes of common carp(22)=erythrocy tes of crucian carp (22)>Chlamydomonas(21).The agglutination
fo r ery throcy tes of rabbit w as the highest and the activity could not be inhibited by D-fructose ,D-galactose ,
glucose , sucrose , lactose ,but could be inhibited by D-mannose , bovine-thy roglobulin , egg albumin and gam-
ma-globulin , and the minimum inhibitory concentration were respectively 0.5 mol/L by D-mannose ,
15.20 mg/mL by bovine-thy rog lobulin , 1.56 mg/mL by egg albumin and 0.45 mg/mL by gamma-g lobu-
lin.Like most lectins f rom marine algae ,GFL was found to be active over a w ide range of pH.The hemag-
glutinat ing act ivity of the lectin appeared at pH 4.0-10.2 , and mo re active at pH 6.5-9.1.The hemag-
glutinat ing activity w as no t affected by heating for 60 min at 90 ℃, so i t w as shown that the lectin had
higher heat resistance.
Key words:Gloiopel tis furcata;lectin;purification;characterization
征　订　启　示
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172　 中 国 水 产 科 学 第 12 卷