全 文 ：研究论文
软骨藻酸分子印迹聚合物的制备及其固相萃取应用
李丽丽a　周文辉b, c　李　永b　林黎明d　朱校斌a　杨黄浩c＊　王小如b, c
(a中国科学院海洋研究所　青岛;b中国海洋大学化学化工学院　青岛;
c国家海洋局第一海洋研究所　青岛 266061;d山东出入境检验检疫局技术中心　青岛)
摘　要　以贝毒-软骨藻酸的结构类似物 1, 3, 5-戊烷三羧酸为模板分子 , 4-乙烯基吡啶为功能单体 , 乙二醇二
甲基双丙烯酸酯为交联剂 ,合成了对软骨藻酸具有较好选择性的分子印迹聚合物。经索氏提取去除模板分子
后 , 在聚合物内部形成了与模板分子 1, 3, 5-戊烷三羧酸以及结构类似物软骨藻酸尺寸 、形状以及活性基团互
补的结合位点。通过静态平衡结合实验研究了该聚合物的结合能力和选择性能 ,与化学组成相同的相应非印
迹聚合物相比 , 1, 3, 5-戊烷三羧酸的分子印迹聚合物对软骨藻酸具有较高的吸附性能和选择性。用 150 mg印
迹聚合物填充于 1.0mL玻璃注射器制成的分子印迹固相萃取柱 , 采用离线模式 ,并结合高效液相色谱实现紫
贻贝和海水中软骨藻酸的分离与检测。对于加标 2 mg/L的紫贻贝和海水样品 , 回收率分别达到(93.4 ±
4.9)%和(89.7±3.2)%(n=3)。
关键词　软骨藻酸 , 分子印迹聚合物 , 记忆缺失性贝毒 ,固相萃取
中图分类号:O658　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1000-0518(2010)02-0132-05
DOI:10.3724/SP.J.1095.2010.90114
2009-02-19收稿 , 2009-05-21修回
国家自然科学基金(20775019)、国家 “八六三 ”计划(2006AA09Z168)、山东省自然科学基金(Y2006B01)、青岛市自然科学基金(08-
1-3-32-JCH)和国家海洋局青年基金(2007601)资助项目
通讯联系人:杨黄浩 ,男 ,教授 ,博士生导师;E-mail:hhyang@fio.org.cn;研究方向:污染物检测新技术
记忆缺失性贝毒(AmnesiaShelfishPoisoning, ASP)-软骨藻酸(DomoicAcid, DA)[ 1]是谷氨酸的一
种异构体 ,能够与控制细胞膜 Na+通道的神经递质谷氨酸受体紧密结合 ,提高 Ca2+的渗透性 ,使神经细
胞长时间处于去极化的兴奋状态 ,最终导致细胞死亡 ,并可能对中枢神经系统海马区和丘脑区造成损
伤 ,从而导致记忆力丧失 [ 2] 。目前 ,测定海产品中软骨藻酸的方法主要有小白鼠生物学试验法 [ 3] 、毛细
管电泳法[ 4] 、高效液相色谱法 (HPLC)[ 5] 等 ,其中 HPLC在软骨藻酸的管理与研究中的应用最为广
泛 [ 6] ,但是因为实际样品基质较为复杂 ,一般需辅助质谱进行分析 ,导致分析成本大幅上升。
固相萃取(Solidphaseextraction, SPE)由于具有回收率高 、有机溶剂用量少 、能处理小体积试样 、操
作简单等优点 [ 7]而成为最常用的样品前处理方法之一 [ 8] ,然而传统固相萃取存在着选择性差的严重不
足 。分子印迹是制备对特定分子具有专一性结合能力的技术 ,分子印迹聚合物 (MolecularlyImprinted
Polymers, MIPs)具有很好的选择性 ,高度的稳定性和长的使用寿命 ,已在分离提纯和传感器等方面显示
出广阔的应用前景[ 9, 10] 。Selergren等[ 11]首次报道了以 MIPs作为固相萃取材料的固相萃取 ,选择性较
高且几乎不存在杂质干扰 ,显示了分子印迹固相萃取的优越性。
Lotierzo等 [ 12]首次报道了采用光接枝 (photo-grafting), 在表面等离子体共振 (surfaceplasmon
resonance, SPR)芯片的金电极上合成了软骨藻酸的分子印迹传感膜 ,并实现了软骨藻酸的 SPR检测 ,但
制备成本和毒性限制了此方法的推广与应用。Kubo等[ 13]以邻苯二甲酸及其异构体为模板分子采用两
步溶胀聚合法(two-stepswelingpolymerization),实现了软骨藻酸分子印迹聚合物的无毒 、低成本制备 ,
但是印迹聚合物的制备过程依然较为繁琐 。本文采用本体聚合法 ,以软骨藻酸的结构类似物 1, 3, 5-戊
烷三羧酸为模板分子模拟软骨藻酸分子合成了对软骨藻酸具有特异性识别能力的分子印迹聚合物 ,制
备过程简单无毒 ,适于推广与应用。并尝试将该印迹聚合物用作固相萃取剂 ,结合高效液相色谱法用于
贝类和海水样品中软骨藻酸的分离 、富集与检测。
第 27卷 第 2期 应 用 化 学 Vol.27 No.2
2010年 2月 　　　　　　　CHINESEJOURNALOFAPPLIEDCHEMISTRY　　　　　　　 Feb.2010
1　实验部分
1.1　仪器和试剂
1100型高效液相色谱仪(美国 Agilent公司),配备 G1312A二元泵 、G1314AVWD检测器;Agela
VenusilXBP-C18柱(250 mm ×4.6 mm, 5 μm),色谱流动相为 V(乙腈 )∶V(水)∶V(三氟乙酸)=
250∶750∶1;流速 0.6 mL/min;进样量 20 μL;柱温为室温;检测波长 242 nm;UV-2102 PCS型紫外可见分
光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司);DZF-6020型真空干燥箱;TGL-16G型离心机;TH-300A型梯度混
合器;FW100型均质器。
软骨藻酸(DomoicAcid, DA)(瑞士 Alexis公司), 1 , 3, 5-戊烷三羧酸 (1 , 3, 5-Pentanetricarboxylic
Acid)(日本 TCI公司), 4-乙烯基吡啶(4-VinylPyridine, 4-VP)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EthyleneGlycol
Dimethacrylate, EGDMA)(美国 AlfaAesar公司),乙腈 、甲醇为色谱纯 ,偶氮二异丁腈(Azobisisobutyroni-
trile, AIBN)、三氟乙酸(TrifluoroaceticAcid, TFA)及其它试剂均为分析纯。紫贻贝(俗称海红)(青岛当
地水产市场),采用人工配制海水 ,配方如表 1。实验用水为超纯水。
表 1　人工海水配方
Table1　Compositionofartificialseawater
NaCl MgSO4 MgCl2 CaCl2 KCl NaHCO3
c/(g·L-1) 31.8 7.74 6.0 1.53 0.07 2
1.2　分子印迹聚合物的制备
0.3 mmol(61 mg)模板分子 1, 3, 5-戊烷三羧酸 、6 mmol(635 μL)功能单体 4-乙烯基吡啶 、30 mmol
(5 670 μL)交联剂乙二醇二甲基双丙烯酸酯 、0.25 mmol(41 mg)引发剂偶氮二异丁腈分散于 5 mL甲苯
中 ,超声分散 10 min, N2气吹除氧 15 min,密封反应器 ,在 N2气保护下油浴 55 ℃反应 24 h。得到的块状
聚合物经研钵研磨 ,过 0.037 ～ 0.074 mm孔筛 ,得到粒径 37 ～ 74 μm的聚合物颗粒 。用体积分数为
20%的乙酸甲醇溶液在索氏提取器中提取 48 h,除去模板分子及未反应的化合物。用乙腈洗涤除去残
留的乙酸和甲醇 ,聚合物颗粒经丙酮反复沉降 ,除去细颗粒后 , 50 ℃真空干燥至恒重 ,即得分子印迹聚
合物。
空白聚合物制备方法除不加入 1, 3, 5-戊烷三羧酸之外 ,其它步骤同上。
1.3　分子印迹聚合物分子识别性能
取 5 mg上述分子印迹聚合物(或空白聚合物)加入 5 mL质量浓度在 0.5 ～ 25 mg/L范围内的软骨
藻酸乙腈溶液中 。室温振荡反应 7 h后高速离心 ,取上清液 ,用紫外可见分光光度计在 242 nm波长下检
测上清液中软骨藻酸的含量(标准曲线法),最后根据溶液的浓度变化计算印迹聚合物(或空白聚合物)
对软骨藻酸的吸附量 。
1.4　软骨藻酸的固相萃取
1.4.1　固相萃取柱的灌装与活化　1 mL玻璃注射器底端用脱脂棉作为筛板 ,防止印迹聚合物颗粒的
流失。取 150 mg分子印迹聚合物填充 ,以乙腈为匀浆液湿法装柱 , N2气吹干柱子制得印迹聚合物固相
萃取小柱 ,依次用 2 mL水 、2 mL乙腈活化 ,最终用 N2气吹干备用。
1.4.2　贝类样品中软骨藻酸的固相萃取
切开新鲜带壳的紫贻贝的闭壳肌取出贝肉 ,放在金属网上沥水 5 min,切细混合 ,以均质器进行均质
处理。取均质样品 5 g,加入 V(甲醇)∶V(水)=1∶1的混合液 5 mL,漩涡振荡 1 min,超声提取 5 min,以
10 000 r/min离心 5 min,取出上清液。于上清液中添加 2 mg/L的软骨藻酸即为贝类样品加标液。
1 mL贝类样品加标液以 0.25 mL/min的速度滴入固相萃取小柱 ,并用 N2气吹干 ,依次用 1 mL水 、
1 mL乙腈淋洗固相萃取小柱 ,流速为 0.25 mL/min,并用 N2气吹干固相萃取小柱。最后用 3 mL含 5%醋
酸的乙腈洗脱 ,流速为 0.25 mL/min,收集洗脱液 。洗脱液 N2气浓缩至干 ,用乙腈定容至 1 mL,得到洗脱
液 。
133　第 2期 李丽丽等:软骨藻酸分子印迹聚合物的制备及其固相萃取应用
用高效液相色谱仪测定加标液和洗脱液中软骨藻酸的含量。
1.4.3　海水中软骨藻酸的固相萃取　海水中直接添加 2 mg/L的软骨藻酸 ,固相萃取过程同上 。
2　结果与讨论
2.1　提取溶剂的选择
早期对贝类中软骨藻酸(DA)的提取采用与麻痹性贝毒素相同的酸性水溶液 ,后来发现 DA在酸性
条件下易分解[ 14] ,不利于批量分析和痕量水平检测 ,而改用 V(甲醇)∶V(水)=1∶1的溶剂作提取液 ,效
果不错 。本文以此混合液作提取溶剂 ,配合自制的 MIP-SPE柱 [ 15]净化 ,避免了贝类样品中大量复杂基
质的干扰。
2.2　色谱条件的选择
软骨藻酸属于三元有机酸 ,极性较大 ,在反相 C18柱上的保留值较小 ,测定软骨藻酸常采用极性的流
动相 ,但是软骨藻酸在流动相中的电离导致色谱峰峰形较差 ,拖尾严重。本文 V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟
乙酸)=250∶750∶1为流动相 ,在 0.6 mL/min的流速下获得了较好的分离效果 。软骨藻酸标准溶液的
紫外光谱在 242 nm处有较大吸收峰 ,并且干扰较少 ,因此 , 以此作为检测波长。图 1为 5 mg/L软骨藻
酸标准溶液的 HPLC色谱图。
图 1　5 mg/L软骨藻酸标准溶液 HPLC色谱图
Fig.1　HPLCchromatogramof5 mg/Ldomoic
acidstandardsolution
图 2　MIP(a)和 NIP(b)对软骨藻酸的吸附
Fig.2　Amountsofdomoicacidboundby(a)MIP
and(b)NIP
2.3　印迹聚合物的分子识别性能
图 3　添加 2 mg/L软骨藻酸的贝类样品提取液(a)和经 MIP-SPE柱萃取后洗脱液(b)HPLC色谱图
Fig.3　HPLCchromatogramsof(a)mytilusedulisextractafteradditionof(a)2mg/Ldomoicacid
and(b)afterextractiononMIP-SPEcolumn
静态平衡法测定的印迹聚合物对不同浓度软骨藻酸的等温吸附曲线如图 2所示 。从图中可以看
出 ,印迹聚合物对软骨藻酸的吸附容量随着体系中软骨藻酸初始浓度的增加而增加。在相同初始浓度
134 应 用 化 学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 27卷　
下 ,印迹聚合物对软骨藻酸分子的吸附容量明显高于非印迹聚合物 ,这表明印迹聚合物具有对软骨藻酸
分子的特异性分子识别能力 ,与以软骨藻酸为模板分子制备的印迹聚合物吸附性能相当 ,优于以邻苯二
甲酸为模板分子制备的印迹聚合物的吸附性能 [ 12, 13] 。由于 1, 3, 5-戊烷三酸和软骨藻酸分子结构中均有
3个羧基可以参与分子识别 ,而邻苯而甲酸仅有 2个羧基参与分子识别 ,说明了三点识别优于两点识
别 。
2.4　海产品中软骨藻酸的分离与分析
图 3a为添加 2 mg/L软骨藻酸的紫贻贝提取液的 HPLC色谱图。从图中可以看出 ,贝类样品提取
液的基质非常复杂 ,对软骨藻酸的定量检测有很大干扰。图 3b为经 MIP-SPE柱萃取后洗脱液的 HPLC
图 4　添加 2 mg/L软骨藻酸的海水样品经 MIP-SPE柱
萃取后洗脱液 HPLC色谱图
Fig.4　HPLCchromatogramofartificialseawateraddition
of2 mg/Ldomoicacidafterextractionon
MIP-SPEcolumn
色谱图 。从图中可以看出 ,贝类样品提取液中的复
杂基质背景基本去除 ,软骨藻酸得到了选择性的分
离与富集。这表明 MIP-SPE柱可以用于贝类样品提
取液中软骨藻酸的快速分离检测。采用该方法检测
添加 2 mg/L软骨藻酸的紫贻贝提取液 ,回收率为
93.4%,相对标准偏差(n=3)为 4.9 %。
2.5　海水中软骨藻酸的分离与分析
图 4为添加 2 mg/L软骨藻酸的海水溶液经
MIP-SPE柱萃取后洗脱液的 HPLC色谱图。从图中
可以看出 ,海水溶液与紫贻贝提取液的固相萃取结
果相似 。海水中的复杂基质已被去除 ,软骨藻酸得
到了选择性的分离与富集 。结果表明 , MIP-SPE柱
可以用于海水中软骨藻酸的快速分离检测。用该方
法检测添加 2 mg/L软骨藻酸的海水溶液的回收率
为 89.7%,低于贝类样品提取液 ,可能与海水 pH值
以及盐的影响有关。
参　考　文　献
　 1　QuiliamM A, WrightJLC.AnalChem[ J] , 1989, 61(18):1 053A
　 2　HampsonDR, HuangXP, WelsJW, WalterJA, WrightJLC.EurJPharmacol[ J] , 1992, 218(1):1
　 3　IversonF, TrueloveJ, NeraE, TryphonasL, CampbelL, LokE.FoodChemToxicol[ J] , 1989, 27(6):377
　 4　NguyenAL, LuongJHT, MassonC.AnalLett[ J] , 1990, 23(9):1 621
　 5　LawrenceJF, CharbonneauCF, MenardC.JAssocOfAnalChem[ J] , 1991, 74(1):68
　 6　Gago-Mart nezA, PiñeiroN, AgueteEC, VaqueroE, NogueirasM, LeãoJM, Rodríguez-V zquezJA, Dabek-Zlotorzynska
E.JChromatographyA[ J] , 2003, 992(1-2):159
　 7　 PooleCF.TrendsAnalChem[ J] , 2003, 22(6):362
　 8　CAIYa-Qi(蔡亚岐), MOUShi-Fen(牟世芬).JInstrumAnal(分析测试学报)[ J] , 2005, 24(5):116
　 9　HauptK.AnalChem[ J] , 2003, 75(17):376A
　10　LAIJia-Ping(赖家平), HEXi-Wen(何锡文), GUOHong-Sheng(郭洪声), LIANGHong(梁宏).ChineseJAnalChem
(分析化学)[ J] , 2001, 29(7):836
　11　SellergrenB.AnalChem[ J] , 1994, 66(9):1 578
　12　LotierzoM, HenryOYF, PiletskyS, TothillI, CulenD, KaniaM, HockB, TurnerAPF.BiosensBioelectron[ J] , 2004,
20:145
　13　KuboT, NomachiM, NemotoK, SanoT, HosoyaK, TanakaN, KayaK.AnalChimActa[ J] , 2006, 577:1
　14　BatesSS, LégerC, WelsM L, HardyK.CanTechnolRepFishAquatSci[ R] , 2003, 2 498:30
　15　QiaoFX, SunHW, YanHY, RowHO.Chromatographia[ J] , 2006, 64:625
135　第 2期 李丽丽等:软骨藻酸分子印迹聚合物的制备及其固相萃取应用
SynthesisofDomoicAcidImprintedPolymer
andItsExtractionApplication
LILi-Lia, ZHOUWen-Huib, c, LIYongb, LINLi-Mingd, ZHUXiao-Bina,
YANGHuang-Haoc＊ , WANGXiao-Rub, c
(aInstituteofOceanology, CAS, Qingdao;
bColegeofChemistryandChemicalEngineering, OceanUniversityofChina, Qingdao;
cTheFirstInstituteofOceanography, SOA, Qingdao266061;
dTechnologicalCenter, ShandongEntry-ExitInspection＆QuarantineBureau, Qingdao)
Abstract　Domoicacid(DA)wasusedasthetargetcompound, itsstructuralanalog1, 3, 5-pentanetri-
carboxylicacidwasusedastemplatemolecules, 4-vinylpyridineasthefunctionalmonomerandethylene
glycoldimethacrylateasthecross-linkingagentforthepreparationofthemolecularlyimprintedpolymers
(MIPs).AfterSoxhletextractionofthetemplate1, 3, 5-pentanetricarboxylicacid, bindingsiteswereformed
inthepolymerwithcomplementarysize, shape, andpositioningofchemicalfunctionalitiesto1, 3, 5-
pentanetricarboxylicacidandalsostructuralanalogdomoicacid.Themolecularlyimprintedpolymerwas
investigatedwiththeaidofequilibriumbindingexperimentstoevaluatethemolecularrecognitionandbinding
characteristicsoftheimprintedpolymer.Theresultsshowthatcomparedwithnon-imprintedpolymer, the
imprintedpolymerexhibitsamuchhigherafinityfordomoicacid.Themolecularlyimprintedsolid-phase
extraction(MISPE)columnswerepreparedfroma1.0 mLglassyringepackedwith150 mgofthemolecularly
polymer.TheMISPEprocedureperformedinanof-linemodecoupledwithreversed-phasehighperformance
liquidchromatographywasdevelopedtoextractdomoicacidfromMytilusedulisandseawatersamples.The
meanrecoveriesofdomoicacidfromMytilusedulisandartificialseawaterspikedwith2 mg/Ldomoicacid
were(93.4±4.9)% and(89.7 ±3.2)%(n=3), respectively.
Keywords　 domoicacid, molecularlyimprintedpolymer, amnesiashelfishpoisoning(ASP), solid-phase
extraction
136 应 用 化 学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 27卷