全 文 ：　　收稿日期:2000-10-18
作者简介:卫　锋(1967-),男 ,副主任检验师 ,硕士 , 1990年毕业于大连理工大学应用化学系。
高效液相色谱法测定贝类中的软骨藻酸
卫 　锋1 , 　程 　日方2 , 　宫静宏1 , 　唐守亭1
(1.辽宁出入境检验检疫局 , 辽宁 大连 116001;2.大连理工大学 , 辽宁 大连 116012)
摘要:介绍了用反相高效液相色谱(RP-HPLC)测定贝类中软骨藻酸的方法。样品以 V(甲醇)∶V(水)=1∶1 的溶
液提取 , 经 LC-SAX强阴离子柱固相萃取净化 , 用 RP-HPLC 定量分析。 方法的最小检出限为 0.2 μg/ g , 在 1.0
mg/ L ～ 25.0 mg/ L范围内有良好的线性关系 , 测定结果准确 ,重现性好 , 回收率大于 96%。
关键词:高效液相色谱法;固相萃取;软骨藻酸;贝类
中图分类号:O658　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-8713(2001)03-0248-03
1　前言
　　软骨藻酸(domoic acid , DA)是一种天然神经性
氨基酸 ,可从被污染的贝类中分离 、提取获得 。其结
构式为:
人们食用毒化的贝类 ,可引起记忆丧失 、眩晕 、昏迷
甚至死亡等 。根据这一中毒特征 ,该毒素被命名为
记忆丧失性贝毒素(amnesic shellfish poisoning ,
ASP)。不少国家对其制定了 20 μg/g 的限量标
准[ 1] 。目前测定贝类中软骨藻酸的方法主要有高
效液相色谱法(HPLC)[ 2] 、毛细管电泳法[ 3] 、小白鼠
生物学试验法[ 4]等 ,其中 HPLC 是公认的检测贝类
中DA的有效方法 。本文对贝类中 DA 的提取 、净
化和色谱条件进行探索 ,建立了贝类中 DA的 RP-
HPLC测定方法。该方法简单易行 ,结果令人满意。
2　实验部分
2.1　仪器和试剂
　　仪器:HP1100 高效液相色谱仪(附 DAD 检测
器), JZ-Ⅱ型组织均质器(铁道部电气化设计研究院
四方电器设备厂), TGL-16G 型台式高速离心机(上
海医用分析仪器厂), LD5-2A 型离心机(北京医用
离心机厂), XW-80A型涡旋混合器(上海精科实业
有限公司), KQ-250型超声波清洗器(昆山市淀山
湖检测仪器厂)。
试剂:Milli-Q 纯水;色谱纯甲醇 、乙腈;优级纯
三氟乙酸(TFA , England);3 mL LC-SAX柱(Supel-
co , USA);MUS-1 标准物质(DA 的质量比为 98
μg/g)、MUS-1B 标准物质(DA 的质量比为 36
μg/g)和 DACS-1C 校正液(DA 的质量浓度为 100
mg/L)均由 National Research Council Canada提供;
0.5 mol·L-1柠檬酸溶液(pH 3.2):40.4 g 一水柠檬
酸和 14.0 g 柠檬酸三铵溶解于 400 mL 水中 ,以浓
氨水调 pH 3.2 ,加入 50 mL 乙腈 ,完全混合溶解后 ,
以水定容至 500 mL;DA标准溶液:以 V(乙腈)∶V
(水)=1∶9 的溶液稀释 DACS-1C 校正液为含 DA
1.0 mg/L , 2.5 mg/L , 10.0 mg/L , 25.0 mg/L的标
准溶液;DA 样品添加溶液:称取固体软骨藻酸(纯
度>90%,Sigma Chemical Co.)适量 ,以 V(乙腈)∶
V(水)=1∶9的溶液配成含 DA约 200 mg/L的溶液
(准确浓度以 DACS-1C 校正溶液校正)。
2.2　色谱条件
　　色谱柱:Zorbax SB-C18 ,150 mm×4.6 mm i.d.,
5 μm ;流动相:V(乙腈)∶V(水 ,含体积分数为0.1%
的三氟乙酸)=13∶87的溶液 ,流速:1 mL/min;进样
量:10 μL;检测波长:242 nm;以峰面积外标法定
量 。按上述条件 ,对标准溶液和样品进行 HPLC 分
析 ,其色谱图见图 1 。
2.3　样品处理
　　取生鲜带壳或冷冻后在室温下半解冻的样品 ,
用刀切开闭壳肌取出贝肉 ,将可食部分与中肠腺分
离 ,放在网孔细小的金属网上沥水 5 min ,切细混
合 ,以均质器进行均质处理。取 5.0 g 均质样品于
50 mL 加盖离心管中 ,加入 10 mL 的 V(甲醇)∶V
(水)=1∶1 的溶液 ,涡旋混匀 1 min , 超声提取 5
min ,以 4 000 r/min离心 20 min ,使固液两相彻底分
离 ,移出上清液至 25 mL 容量瓶中 ,残渣再加入 5
mL的 V(甲醇)∶V(水)=1∶1 的溶液重复提取两
遍 ,上清液均移入 25 mL 容量瓶中 ,以水定容至刻
度 ,混匀 。取上述粗提取液 5.0 mL 移入依次经 6
mL甲醇 、3 mL 水 、3 mL 的 V(甲醇)∶V(水)=1∶1
的溶液活化的 LC-SAX柱上 ,待液体以 1 滴/ s的速
度流出后 ,再依次用 5 mL 的 V(乙腈)∶V(水)=1∶
第 19卷第 3期
2001年 5月
色 谱
CHINESE JOU RNAL OF CHROMATOGRAPHY
Vol.19 No.3
M ay 2001
图 1　10 mg/L DA标准溶液(a)、10μg/ g标准添加样品(b)、空白样品(c)和 MUS-1标准物质(d)的色谱图
Fig.1　Chromatograms for the separation of the 10 mg/L DA standard(a), 10μg/ g DA spiked sample(b),
blank sample(c)and MUS-1 reference material(d)
1.DA;2.DA C5′-diastereomer.
9的溶液 、0.5 mL 柠檬酸洗脱液以 1滴/ s的流出速
度过柱 ,弃去流出液 ,最后用 2 mL 柠檬酸洗脱液洗
脱吸附在柱上的 DA ,供 HPLC 测定 。在液体过柱
时 ,当液体凹液面下端与柱填料上端水平时 ,止住液
体流出 ,避免 LC-SAX柱填料与空气接触。
3　结果和讨论
3.1　提取溶剂的选择
　　早期对贝类中 DA的提取一般是根据其水溶性
特性 ,采用与麻痹性贝毒素(PSP)相同的酸性水溶
液提取方法[ 5] ,后来发现 DA 在酸性条件下易分解 ,
不利于批量分析和痕量水平检测 ,而改用水 、甲醇 、
V(甲醇)∶V(水)=1∶1 的溶液作提取溶剂 ,效果都
不错 。本方法选用 V(甲醇)∶V(水)=1∶1的溶液
作提取溶剂 ,配合 LC-SAX柱净化 ,样品回收率大于
96%,避免了基体中色氨酸的干扰[ 6] 。
3.2　固相萃取(SPE)净化
　　SPE 技术是目前纯化样品中待测成分的常用有
效方法 。我们在试验中发现 ,样品中的 DA 经甲醇-
水提取后 ,能很好地保留在 LC-SAX 阴离子交换柱
上;用 5 mL 的 V(乙腈)∶V(水)=1∶9 的溶液能除
去样品中的内源性杂质特别是色氨酸的干扰;2 mL
柠檬酸溶液能完全洗脱 DA ,回收率大于 96%。
3.3　洗脱液用量对回收率的影响
　　在样品中添加 75 μg DA 标准品(相当于样品中
DA的质量比为 15 μg/g),按“2.3”节进行样品处
理 ,考察柠檬酸洗脱液用量对方法回收率的影响 ,结
果见表 1 。从表 1 可知 , 洗脱液用量大于 1.0 mL
时 ,其体积的变化对回收率的影响就不明显了 。
3.4　LC-SAX柱对 DA回收率的测定
　　取 MUS-1提取液按“2.3”节中“取上述提取液
5.0 mL……,供 HPLC 测定”一段文字所述操作 ,分
别通过任意 3根 LC-SAX 柱 ,测定提取液中 DA 含
量 ,并与粗提取液经 5倍稀释直接进样测定结果比
较 ,计算得回收率为 98.4%(n=3)。
表 1　洗脱液体积对 DA回收率的影响
Table 1　The influence of elution volume
on accumulative recovery of DA
Elu tion volume
(mL)
Mass of DA
(μg)
Accumulative recovery
(%)
0.50 0.032 8 2.2
1.00 14.321 6 95.48
1.50 14.469 0 96.46
2.00 14.499 2 96.67
2.50 14.522 4 96.82
3.00 14.545 4 96.97
3.50 14.557 7 97.05
4.00 14.563 1 97.09
3.5　检测波长
　　为了获得 DA 的最佳 DAD/UV 检测响应 ,在
190 nm ～ 400 nm 范围内对 DA进行了吸收强度扫
描 。图 2是 10 mg/L DA 标准溶液的紫外吸收曲
线 。由图 2可见 , 242 nm 是 DA 的最大紫外吸收波
长 ,因而被选为本方法的最佳检测波长。
图 2　DA 紫外光谱图
Fig.2　UV spectrum of DA
3.6　流动相
　　在 Zorbax SB-C18柱上比较了常用的不同配比的
乙腈-水(含 0.1%TFA)和甲醇-水(含 0.1%TFA)
流动相体系 ,结果表明 , DA 的保留时间对流动相的
配比非常敏感 ,并且乙腈-水(含 0.1%TFA)体系优
·249·　第 3期 卫　锋等:高效液相色谱法测定贝类中的软骨藻酸
于甲醇-水(含 0.1%TFA)体系 。选择 V(乙腈)∶V
(水 ,含 0.1%TFA)=12∶88 , 13∶87 , 14∶86 时 , DA
色谱峰对称性大于 0.9 ,DA 与DA C5′非对映异构体
的分离度大于 4;随着流动相中乙腈比例的减小 ,
DA保留时间增加 , DA 色谱峰对称性增强 , DA 与
DA C5′非对映异构体分离度增大。基于上述结果 ,
最后选定 V(乙腈)∶V(水 ,含 0.1%TFA)=13∶87
的溶液为本方法的流动相 。在此流动相下 , DA 峰
形的对称性 、出峰时间 、DA与 DA C5′非对映异构体
的分离度均较理想。
3.7　线性关系
　　在本方法所确定的实验条件下 , DA 在 1.0
mg/ L ～ 25.0 mg/ L 时 ,其峰面积(Y )与质量浓度
(X , mg/L)有良好的线性关系 , 回归方程 Y =
45.15X +4.43 , r=0.999 9。
3.8　回收率 、精密度和最小检出量
　　本实验共进行 3 个添加水平的试验 ,空白样品
加标后按“2.3”节方法处理 ,每一水平测定 6次 ,平
均回收率为 97.23%, RSD为 2.43%。精密度以在
空白样品中添加同一水平对照品的回收率结果的重
现性表示 ,测定结果的标准偏差和 RSD在允许范围
之内(见表 2)。样品最低检出量为 0.2 μg/g 。
3.9　实际样品检测
　　我们在实验中还测试了两个有证标准物质 ,结
果见表 3。
表 2　方法的回收率和精密度(n=6)
Table 2　Recovery and precision of the method(n=6)
Added
(μg/ g)
Found
(μg/g)
Aver.recovery
(%)
RSD
(%)
5.00 4.86±0.14 97.24 2.74
10.00 9.69±0.25 96.92 2.59
20.00 19.5±0.39 97.55 1.95
表 3　样品测试结果
Table 3　Analytical results of samples
S ample
code
Found
(μg/ g)
Average
(μg/ g)
Standard mass
concent ration
(μg/ g±95C I)
M US-1B 93.78 , 93.93 , 96.61 94.77 98±5
MUS-1 35.33 , 35.25 , 35.72 35.43 36±1
参考文献:
[ 1] 　Lawrence J F , Benjamin P Y , Cleroux C , et al.J Chro-
matogr , 1994 , 659:119-126
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O ff Anal Chem , 1991 , 74:68-72
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[ 6] 　Quilliam M A , SIM P G , Mcculloch A W , et al.Int J
Environ Anal Chem , 1989 , 36:139-154
High Performance Liquid Chromatographic Determination
of Domoic Acid in Shellfish Samples
WEI Feng
1 , CHENG Fang2 , GONG Jing-hong1 , TANG Shou-ting1
(1.Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarant ine Bureau of China , Dalian 116001 , China;
2.Dalian University of Technology , Dalian 116012 , China)
Abstract:Domoic acid in shellfish samples w as determined by HPLC with DAD/UV detector at 242 nm.
Samples w ere ext racted with methanol-water follow ed by clean-up of the ext racts wi th strong anion exchange
solid phase ext raction cart ridge(3 mL LC-SAX).Zorbax SB-C18 column , 150 mm×4.6 mm i.d., and mobile
phase of acetonit rile-0.1% aqueous t rifluoroacetic acid(13∶87 , V/ V)were used for the assay.The quantitative
analy sis w as performed wi th ex ternal standard.The calibration curve of domoic acid w as linear in the range of
1.0 m/ L-25.0 mg/ L and the detection limit w as ca.0.2μg/g.
Key words:high performance liquid chromatog raphy ;solid phase ext raction;domoic acid;shellfish
·250· 色 谱 第 19卷