全 文 ：
热带海洋学报 JOURNAL OF TROPICAL OCEANOGRAPHY 2010 年 第 29 卷 第 6 期：98−103
http://jto.scsio.ac.cn; http://www.jto.ac.cn
收稿日期：2009-12-10; 修订日期：2009-12-24。刘学东编辑
基金项目：广西科学基金项目(桂科基 0575008); 广西大学基金项目(X041120)
作者简介：李文红(1966—), 女, 广西平果县人, 副教授, 博士, 从事研究藻类分子生物学。whli66@163.com
海洋生物学
江蓠总 DNA 提取及其 PCR 扩增方法的建立
李文红, 房振峰
(广西大学水产系, 广西 南宁 530005)
摘要: 通过对 CTAB 法、SDS 法和植物基因组提取试剂盒 3 种方法提取江蓠 Gracilaria 总 DNA 的得率比较, 并将
得到的总 DNA 用于限制性酶切和 PCR 扩增反应进行纯度检测, 选择出适合江蓠属总 DNA 的提取方法, 建立了江
蓠 RAPD、ISSR 和 ITS 等遗传多样性和系统学研究的分子生物学方法。实验结果表明, SDS 法和植物基因组提取
试剂盒均适用于江蓠总 DNA 的提取; 其中 SDS 法适用于新鲜和冰冻材料的总 DNA 提取, 不仅得率和纯度高, 且
方法稳定性好, 提取时间较短, 在本实验中是江蓠总 DNA 提取的最佳方法。植物基因组提取试剂盒的得率低, 但
质量好, 操作快速简便, 适用于大量新鲜样本总 DNA 的提取。CTAB 法由于相对耗时长且产物稳定性差, 不推荐
在江蓠中使用。
关键词: 江蓠 Gracilaria; 总 DNA 提取; PCR 扩增
中图分类号: Q523 文献标识码: A 文章编号: 1009-5470(2010)06-0098-06
DNA isolation and PCR amplified in Gracilaria
LI Wen-hong, FANG Zhen-feng
(Department of Aquaculture, Guangxi University, Nanning 530005, China)
Abstract: The proper total DNA isolation methods of Gracilaria were chosen from three popular methods known as CTAB,
SDS, and commercial Plant DNA Extraction kits by comparing their yield, quality, reliability, and the extraction time con-
sumed. The total DNA was applied to restricted enzyme digestion and PCR amplification to detect its quality. The reactions of
ingredients and programs of RAPD, ISSR, and ITS were constructed based on the detections. The results showed that the SDS
method is the best method among the three for its highest yield and fine quality of total DNA, both good for fresh and frozen
Gracilaria samples, not time-consuming and excellent reliability. The Plant DNA Extraction Kit was quick and user-friendly
for the mass fresh samples DNA isolation in Gracilaria though its total DNA yield was low. The CTAB method was not rec-
ommended for its time-consuming and poor reliability.
Key words: Gracilaria; total DNA isolation; PCR
江蓠 Gracilaria 属于红藻门(Rhodophycophyta),
红藻纲(Florideophyceae), 杉藻目(Gigartinales), 江
蓠科(Gracilariaceae), 为温、暖水性种类, 除极地外
世界各地均有分布。我国已知的 32 种江蓠属海藻主
要分布在南海、东海, 黄海种类较少; 南海―特别是
海南岛, 是我国江蓠种质和资源分布中心[1]。江蓠的
外形变异幅度很大, 即使是同一种类, 由于所处的
生态环境有异其藻体也会产生不同变化, 这给江蓠
的准确分类带来很大困难。张峻甫等[2]根据囊果被
构造和其他特征, 把长期在东南亚一带被误认为江
蓠模式种的 G. verrucosa 更名为真江蓠 G. asiatica;
认为细基江蓠繁枝变种 G. tenuistipitata(Var.liui)为
细基江蓠 G. tenuistipitata 的生态变型亚种, 其繁枝
的形态特征是长期适应池塘环境的结果。台湾的学
者原将细基江蓠繁枝变种定名为菊花心江蓠 G.
lichenoides, 后来在夏威夷的学术会议上多数学者
认为它实际上和细江蓠是同物异名而把菊花心江蓠
一名取消[3]。笔者曾经将分子标记技术运用于细基
李文红等: 江蓠总 DNA 提取及其 PCR 扩增方法的建立 99
江蓠及其繁枝变种分类地位的探讨 , 尝试从 DNA
水平上为江蓠的分类研究提供新的证据和有效的检
测手段[4]。
全球变化对人类影响最大的是气候变化和生物
多样性变化, 气候变化如何影响海洋生物遗传多样
性以及生物多样性变化对气候变化响应的研究还很
欠缺[5]。我们推测, 地理上大尺度分布的江蓠对新的
气候条件引起的生态环境变化的适应不仅表现为外
形变异产生新的亚种和变种, 其物种基因序列也可
能会发生改变。要从 DNA 水平上揭示气候变化对江
蓠多样性产生的影响, 运用分子生物学技术对江蓠
进行遗传多样性检测、种质鉴定和系统学分析变得
非常重要。基因组 DNA 的提取是进行分子生物学实
验的前提 , 基因组 DNA 质量的高低直接关系到
PCR 扩增、酶切等实验的顺利进行。因此, 快速、
经济地从江蓠样品中提取高产量、高纯度的总 DNA
和建立起通用、有效的分子技术方法已成为江蓠分
子生物学研究的首要问题。
本实验选择已用于江蓠总 DNA 提取的 CTAB
法、SDS 法和植物基因组提取试剂盒等 3 种方法对
不同形态、不同种类和不同保存方法的江蓠样本进
行总 DNA 提取, 通过比较有关结果, 选择出适用性
广、稳定可靠、高效的江蓠总 DNA 制备方法; 并将
提取得到的总 DNA 用于限制性酶切、特异性和非特
异性 PCR 扩增实验, 旨在检验江蓠总 DNA 的质量
并建立起相应的江蓠分子研究技术方法体系, 为江
蓠遗传多样性研究和系统分类研究提供可行的分子
生物学方法。
1 材料与方法
本实验所用材料包括江蓠属 5 个种一个亚种,
分别采自中国沿海广西、广东、福建、江苏和山东。
其中龙须菜 G. lemaneiformis、细基江蓠繁枝变种 G.
tenuistipitata var. liui、细基江蓠 G. tenuistipitata、真
江蓠 G. asiatica 和张氏江蓠 G. changii 外部形态
相似, 均为圆柱形线状, 扁江蓠 G. textorii 为革质
扇形。
1.1 模板 DNA 的制备
1.1.1 CTAB法
参考李向峰等 [6]方法, 取新鲜藻体分别用自来
水和去离子水冲洗干净, 吸干水分, 称取 1.0g 剪碎
加入陶瓷研钵内晾干 , 加入少量石英砂和 PVP-40
与没过藻体的液氮共同研磨至粉状。快速将研磨好
的藻粉转入 65℃预热的 8mL 3%CTAB 提取缓冲液
中, 充分混匀, 65℃温浴 15min 以钝化核酸酶, 其间
混匀 4 次。水浴锅温度降到 40℃, 加入蛋白酶 K 粉
末至终浓度 200µg·mL−1, 温浴 90min, 其间混匀 8
次。冷却至室温, 加入等体积氯仿/异戊醇(24/1), 轻
柔混合 5 min, 2000r·min−1 离心 10min 取上清液。加
入等体积酚/氯仿/异戊醇(25/24/1), 轻柔混合 5min,
4℃ 5000r·min−1离心 10min; 取出上清液转入另一离
心管, 重复用氯仿/异戊醇(24/1)抽提, 12000r·min−1 离
心 10min。加入 2 体积冷乙醇, 置于−20℃过夜。
15000r·min−1 离心 10min, 收集沉淀; 用 70%冷乙醇
洗涤沉淀 2 次, 自然晾干到无乙醇味。将沉淀溶于
适量双蒸水中 , 取上清 , 加入 Rnase 至终浓度
100µg·mL−1, 37 ℃ 温 浴 30min, 冰 浴 30min,
14000r·min−1 离心 10min。氯仿 /异戊醇(24/1)抽提 ,
13000r·min−1 离心 7min, 两遍。用 70%冷乙醇洗涤
沉淀 2 次, 自然晾干到无乙醇味。将沉淀溶于双蒸
水, 取上清液。
1.1.2 SDS法
参考 HU Zi-min 等[7]方法, 取 1.0g 藻体在液氮
中研磨成藻粉, 加入 7.5mL SDS 提取缓冲液, 37℃
温浴 60min, 充分混匀。加入 3mL 5 mol KAc (pH 7.5)
混匀, 冰浴 20min, 4℃, 10000转离心 10min, 重复一
遍; 再用 24︰1 的氯仿︰异戊醇抽提一次。加入
RNA 酶至终浓度 100µg·mL−1, 37℃温浴 120min; 分
别用 25︰24︰1的酚︰氯仿︰异戊醇和 24︰1的氯仿:
异戊醇抽提一次, 4℃, 10000 转离心 10min。加入 0.6
体积的异丙醇, −20℃沉淀 60min; 4℃, 13000 转离心
20min。70%乙醇洗涤 3 次, 每次 4℃, 13000 转离心
5min。自然干燥, 适量双蒸水溶解。−20℃粉状保存。
1.1.3 提取试剂盒法
使用北京鼎国生物技术公司生产的植物基因组
快速提取试剂盒提取江蓠 DNA。
1.2 DNA 浓度及纯度检测
分光光度计 (Beckmen Spectrophotometer)检测
DNA 浓度并换算成每克新鲜藻体的 DNA 得率, 读
取 260nm、280nm 处吸光度的比率 D(260)/D(280)
检测 DNA 纯度。
将模板 DNA 在 0.7%琼脂糖中进行电泳检测。
电泳电压为 4―5V·cm−1, 30min 后将胶取出, 置于凝
胶成像系统中观察并照相。DNA 条带与标准 DNA
的对比, 可以推算出总 DNA 片段的大小。
1.3 限制性内切酶消化
选用 EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、PvuⅡ、Pst
Ⅰ五种限制性内切酶进行 DNA 纯度验证, 酶识别
位点分别为 4 个碱基, 6 个碱基。酶切实验条件如下:
酶的用量为 5U, 37℃水浴 3h, 2.0%的琼脂糖凝胶电泳
检测, 电压 85V, 1.5h。设置两个空白: 1)模板 DNA 加
100 热 带 海 洋 学 报 Vol. 29, No. 6 / Nov., 2010
双蒸水稀释到 20µL; 2)不加限制性内切酶作空白。
1.4 RAPD 扩增反应和引物筛选
参照李向峰等[6]的方法, 建立了 RAPD PCR 反
应体系及扩增程序。25µL PCR 基本反应体系组成:
1xPCR buffer (100 mmol KCl, 80mmol (NH4)2SO4,
100mmol Tris-HCl, pH 9.0, NP-40), 2.5mmol MgCl2,
0.2mmol dNTP, 0.2µmol 引物 , 25ng 模板 DNA,
1.25U/25µL Taq 酶。反应体系的优化按单因子梯度
设置进行(表 1)。PCR 反应基本扩增程序: 94℃预变
性 10min, 其后 35 个循环: 95℃变性 1min, 35℃退火
1min, 72℃延伸 2 min, 最后 72℃延伸 10min。优化程
序参照表 2。
表 1 RAPD 扩增反应体系的优化
Tab. 1 Option of reaction ingredients for RAPD ampli-
fication
成 分 梯度 结果
模板 DNA/ng 0 25 30 50 75 100 25
MgCl2/mmol 0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 2.5
引物浓度/µmol 0.04 0.08 0.12 0.16 0.20 0.2
dNTP 浓度/mmol 0.04 0.10 0.20 0.30 0.40 0.2
Taq 酶浓度/U 0.5 1.0 1.25 2.0 3.0 1.5
表 2 RAPD 扩增程序的优化
Tab. 2 Option of reaction program for RAPD amplifi-
cation
优化因子 梯度 结果
退火温度/℃ 35 36 37 38 39 40 38
退火时间/s 30 60 120 60
延伸温度/℃ 56 60 64 68 72 75 77 80 72
延伸时间/s 60 120 180 120
(预)变性温度/℃ 89 91 92 94 95 97 98 99 94
变性时间/s 30 60 90 30
循环次数/次 25 29 35 35
以连云港栽培龙须菜模板 DNA 进行第一轮引
物筛选, 选取能扩增出条带的引物在野生和栽培龙
须菜两种模板 DNA 中再进行第二轮的筛选, 选取
在两份模板中均能产生条带的引物, 并在其中挑取
条带清晰, 重复性好, 扩增条带数目多的引物用于
下一步试验。
江蓠 DNA 的 RAPD 反应在优化所得的条件下
进行。反应产物在含有溴化乙啶的 1.5%琼脂糖凝胶
中电泳检测, 紫外灯下观察拍照, 用 100bp 的 DNA
ladder 作为分子量标记。
1.5 ISSR 扩增反应和引物筛选
反应条件参照孙雪等[8]略作修改。反应总体积
为 25µL, 其中包括其中包括 1×PCR buffer, 2.5mmol
MgCl2, 0.2mmol dNTP, 0.2µmol 引物 , 40ng 模板
DNA, 1.0 U Taq 酶。反应在 eppendorf mastercycler
gradient PCR 仪上进行。扩增程序为 94℃预变性
5min, 接着 32 个循环: 变性 94℃, 50s, 按照不同引
物的 Tm 值分别在 48℃、50℃、53℃、55℃退火 1min,
延伸 72℃, 2min。最后 72℃延伸 8min。反应产物在
含有溴化乙啶的 2.0%琼脂糖凝胶中电泳检测, 紫外
灯下观察拍照, 用 100bp 的 DNA ladder 作为分子量
标记。从 22 条引物中筛选出 16 条用于后续分析。
1.6 ITS 扩增及其产物检测
所 用 引 物 序 列 参 照 Candia[9]: P1( 正 向 ) 为
5’GGGATCCGTTTCCGGTAGGTGAACCTGC3’ 位 于
18 S 上, P2(反向)为 5’GGGATCCATATGCTTAAG
TTCAGCGGGT3’, 位于 26 S 上。PCR 反应总体
积为 20µL, 包括 10mmol·L−1Tris-HCl, pH 为 8.3,
50mmol·L−1 KCl, 1.5mmol·L−1 MgCl2, Taq 聚合酶
1U, 4 种 dNTP 各 2mmol·L−1, 两个引物各 5mmol·L−1,
DNA 模板约 50ng。反应循环参数为 95℃预变性
5min 后经 5 个循环: 90℃变性 1min, 50℃退火 2min。
72℃延伸 1min 后又 30 个循环: 90℃变性 1min,
60℃退火 1min, 72℃延伸 1min。最后 72℃延伸 10min。
以双蒸水代替模板 DNA 做空白对照。ITS 的扩增产
物电泳检测方法同 RAPD 扩增产物的检测。
2 结果
2.1 DNA 得率与纯度
根据表 3 数据得知, SDS 法提取得到的总 DNA
在平均得率、纯度、方法稳定性上都较其余 2 种方
法要好。总 DNA 平均得率由高到低依次为 SDS 法
(142.8)、CTAB 法(107.4)和提取试剂盒法(9.6)。
所得基因组 DNA 纯度按照其 D(260)/D(280)比
值落在 1.7―1.9 范围的百分率由高到低排列: SDS
法(73%)、提取试剂盒法(45%)、CTAB 法(28%); 3
种方法中稳定性最好的是 SDS 法, 其后依次是试剂
盒法、CTAB 法。根据 A260/A230 比值可知总 DNA
中小分子杂质含量最少的是 SDS 法, 最高的是试剂
盒法。三种方法提取得到的基因组片段分子量大小
一致, 约 23kb(图 1)。
2.2 限制性酶切实验
由图 2 可知, SDS 法和试剂盒法提取的基因组
DNA 均能被 EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、PvuⅡ、
李文红等: 江蓠总 DNA 提取及其 PCR 扩增方法的建立 101
PstⅠ五种限制性内切酶消化, 其质量可以满足江蓠 属红藻分子遗传研究的需要。
表 3 3 种方法 DNA 提取结果的比较
Tab. 3 Yield and quality comparison of DNA isolation
平均得率/(µg·g−1(鲜重)) D(260)/D(280) D(260)/D(230) 提取时间
CTAB 法 107.4 0.72―2.7 (28%介于 1.8±0.1)
0.49―2.08
(62%介于 1―1.8) 需要过夜
SDS 法 142.8 0.33―2.14 (73%介于 1.8±0.1)
0.4―3.1
(47%介于 1―1.8) 10h
试剂盒法 9.6 1.29―2.03 (45%介于 1.8±0.1)
0.5―1.56
(78%介于 1―1.8) 3―4h
图 1 总 DNA 电泳图谱
M: λDNA HindⅢ。SDS 法: 1.细基江蓠繁枝变种; 2.龙须菜; 3.真江蓠;
4.张氏江蓠; 5.扁江蓠。试剂盒法: 6. 细基江蓠繁枝变种; 7. 龙须菜;
8.真江蓠; 9.张氏江蓠;10.扁江蓠
Fig. 1 Total DNA eletrophoresis
图 2 限制性内切酶消化电泳图谱
M1: λDNA HindⅢ; M2: 100bp DNA Ladder Plus
K: 试剂盒法；L: SDS 法。K01: Uncut gDNA; K02: No RE mock;
K1: EcoRⅠ; K2: HindⅢ; K3: BamHⅠ; K4: PvuⅡ; K5: PstⅠ
Fig. 2 Enzyme digestion patterns based on Gracilaria
template DNA
2.3 RAPD 反应条件优化结果
由表 2 得到优化后 25µL PCR 反应体系组成: 1x
PCR buffer (100 mmol KCl, 80mmol (NH4)2SO4,
100mmol Tris-HCl, pH 9.0, NP-40), 2.0mmol MgCl2,
0.2mmol dNTP, 0.2µmol 引物, 30 ng 模板 DNA, 1.5
U/25µL Taq 酶。
2.4 ISSR 扩增结果
设定的反应条件下, ISSR 引物在龙须菜、细基
江蓠繁枝变种、细基江蓠、真江蓠、张氏江蓠和扁
江蓠总 DNA 中均扩增出清晰条带(图 3)。
2.5 ITS 扩增反应和产物检测结果
设定的反应条件下, ITS 引物在龙须菜、细基江
蓠繁枝变种、细基江蓠、真江蓠、张氏江蓠和扁江
蓠总 DNA 中均扩增出清晰条带(图 4)。
图 3 引物 S902 在江蓠属中的 ISSR 扩增图谱(试剂盒法)
1-2.真江蓠; 3.扁江蓠; 4-6.细基江蓠繁枝变种; 7-11.龙须菜; 12.张氏
江蓠
Fig. 3 ISSR patterns of Gracilaria with primer S902 (ex-
traction kit)
图 4 江蓠 ITS-PCR 电泳图谱(SDS 法)
1—2.真江蓠; 3.扁江蓠; 4—6.细基江蓠繁枝变种; 7.张氏江蓠; 8—12.
龙须菜
Fig. 4 ITS amplified patterns based on Gracilaria tem-
plate DNA, M: DGL2000
3 讨论
3.1 江蓠总 DNA 的提取
植物组织中富含理化性质与 DNA 相似的多糖,
多糖与 DNA 会结合成黏稠的胶状物, 很难将多糖
和 DNA 分开, 获得的植物 DNA 常出现产量低、质
量差、易降解, 影响了 DNA 质量和纯度, 抑制限制
性酶切反应和 PCR 扩增[10]。在红藻内储存的重要的
102 热 带 海 洋 学 报 Vol. 29, No. 6 / Nov., 2010
光合产物和储备物质包括红藻淀粉、红藻糖苷、琼
胶和小分子碳水化合物 [11]。江蓠琼胶含量一般在
20%―40%范围内 [12], 江蓠藻体组织中主要的碳水
化合物是硫多糖和羧酸多糖, 比陆生植物的中性多
糖更易水溶, 溶液高度黏稠, 在 DNA 提取中很难去
除。由于海藻中不同颜色、不同种类之间, 或同一
种海藻的不同世代, 不同方法采集和保存(新鲜和冰
冻、干燥)的样本之间, 其化学组分和多糖含量有差
异, 因此海藻总 DNA 提取的方法具有较高的专一
性[13−15]。要获得数量、质量符合要求的模板 DNA
进行江蓠分子遗传研究, 选择合适的总 DNA 提取
方法是关键。
传统的总 DNA 提取方法主要有 CTAB 和 SDS
两种。十二烷基磺酸钠(SDS)是一种阳离子强表面活
性剂, 通常与蛋白酶 K 和抗氧化剂、螯合剂一起使
用; 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)是一种在高盐下
能与核酸结合形成可溶、稳定的复合物, 低盐浓度
下可沉淀的表面活性剂。它们在裂解细胞的基础上,
多次苯酚氯仿等有机溶剂抽提使蛋白质变性沉淀于
有机相, 而核酸保留在水相, 达到分离核酸的目的。
本实验的 SDS 法在加入提取液后的离心过程中, 适
当加大离心力(13000g), 延长离心时间(20―30min);
加入高浓度的 KAc, 提高盐浓度并降低温度(冰浴),
使 SDS-蛋白质复合物转变为溶解度更小的钾盐形
式, 蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全, 离心后除去
沉淀所得江蓠基因组 DNA 的纯度, 得率和稳定性
很好。整个提取过程大约耗时 10 小时, 适用于江蓠
属海藻的新鲜和冰冻样本。CTAB 法在样品液氮研
磨中加入高分子螯合剂 PVP(聚乙烯吡咯烷酮)以络
合多酚和萜类物质, 经离心或氯仿抽提出去, 有效
地防止多酚物质氧化成醌类 , 避免溶液变褐 ; PVP
同时能有效去除多糖 , 能提高 DNA 的纯度。在
CTAB 法实验中我们参照 ZENG J[16]做了一些改良
以提高方法稳定性和总 DNA 纯度: 提高缓冲液中
CTAB 浓度至 3%; 同时提高缓冲液中 NaCl 的浓度,
或在沉淀粗提 DNA 时提高 NaCl 浓度; 还试用博大
公司生产的玻璃奶试剂盒做 DNA 纯化, 效果均不
理想。由于 CTAB 法得到的总 DNA 容易降解, 并且
提取过程耗费时间长, 样品必须过夜处理, 因此在
后续的实验中我们没有使用。
新的总 DNA 提取方法主要是多种商品化的
DNA 提取纯化试剂盒, 其分离原理有的利用核酸的
分子量差异, 有的利用特异性膜与 DNA 结合达到
分离、回收的目的。这些提取纯化试剂盒针对不同
的材料来源设计了不同的提取方法 , 操作简单、
DNA 质量较高, 但提取量少, 且大多价格昂贵。本
实验选用了价格较低、由北京鼎国生物技术公司生
产的植物基因组快速提取试剂盒, 在江蓠新鲜材料
的 DNA 提取中效果良好。
3.2 江蓠总 DNA 的纯度检测
目前检测DNA纯度最常用的方法是测定DNA在
230、260、280nm 的吸收值, 通过计算 D(260)/D(280)
来评价 DNA 的纯度 , 通常认为 D(260)/D(280)在
1.8―2.0 表明 DNA 的纯度较好。但是因为核酸在
260nm 处的吸收很强, 只有存在高水平蛋白质杂质
时才会引起这 2 个波长下吸收值的比值发生明显改
变[17]。因此检测 DNA 纯度最佳的办法是采用 EcoR
Ⅰ、HindⅢ等限制性核酸内切酶对 DNA 进行酶切消
化, 能被完全酶切、并可用作 PCR 模板的基因组
DNA, 才能证明其纯度高, 所含蛋白质、多糖类等
杂质少, 能进一步用于分子标记和 Southern 杂交等
分子生物学的研究。
3.3 江蓠 PCR 扩增方法的建立
CO2 海-气交换的一个重要控制因子是海-气间
p(CO2)差, 海水 p(CO2)大小受植物光合作用、上升
流、温度、盐度和 pH 值等众多因素影响[18]。南海
是我国江蓠的分布中心, 在研究气候变化与南海生
物多样性的相互关系中, 选择典型大型海藻江蓠为
研究对象, 可以起到事半功倍的作用。江蓠 PCR 扩
增方法的建立为从分子水平上揭示江蓠的遗传多样
性特征及其变异提供了技术保证。
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