全 文 ：湖 北 农 业 科 学 2011 年
（责任编辑 王 珞）
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第 50 卷第 16 期
2011年 8 月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 50 No.16
Aug．，2011
收稿日期：2011－01－19
基金项目：安徽省教育厅科研项目（KJ2010B015）
作者简介：魏胜华（1972－），男，安徽蚌埠人，讲师，博士，从事微生物学研究，（电话）13855316466（电子信箱）dreammn＠126．com。
DNA 的提取与纯化是进行分子标记试验最关
键的一步， 获得高质量的 DNA 样品是进行 PCR 扩
增的首要步骤［1］。从植物材料中提取基因组 DNA 的
质量受到多种因素的影响，在不同植物或同种植物
不同时期组织中存在着不同数量的多糖、色素以及
种类繁多的次生物质，特别是多糖、酚类在提取过
程中可与 DNA 产生沉淀，形成包裹 DNA 的黏稠胶
状物，其难以溶解或产生褐变，使得 DNA 提取质量
较低，获得的 DNA 溶液常常黏度大乃至呈胶状，这
些物质如果清除不净则会影响后续的试验研究［2－4］。
大戟属（Euphorbia Linn）为大戟科（Euphorbiaceaec）
植物中最大的一属，全世界有2 000 余种 ［5］，其中不
改良 CTAB法提取大戟属药用植物叶片总 DNA试验
魏胜华，孟 娜
（安徽工程大学生物与化学工程学院，安徽 芜湖 241000）
摘要：由于大戟属（Euphorbia Linn）植物叶片中含大量的多糖、酚类等次生代谢物质，严重影响总 DNA 的
提取，因此，以大戟属药用植物叶片为材料，对常用的 CTAB（Hexadecyltrimethy ammonium bromide）法进
行了改良，并通过琼脂凝胶电泳法对所提 DNA 样品进行了检测。 结果表明，改良 CTAB 法提取的植物总
DNA 纯度很高，较适合提取大戟属植物的总 DNA。
关键词：大戟属；药用植物；CTAB 法；总 DNA 提取
中图分类号：Q949．753．5；Q503 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2011）16－3418-03
A Modified CTAB Method for Total DNA Extraction from the Medicinal Herb Leaves
of Euphorbia Linn
WEI Sheng－hua，MENG Na
（College of Biology and Chemical Engineering， Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，Anhui， China）
Abstract： The cells in Euphorbia Linn leaves were rich in amylose and hydroxybenzene． These substances provided some se-
riously adverse effects on extraction of DNA from Euphorbia． Using the leaves of Euphorbia as material， the DNA were ex-
tracted by a modified CTAB （Hexadecyltrimethy ammonium bromide） method and detected by means of agarose gel elec-
trophoresis． The results showed that the modified CTAB method was suitable for extraction of its’ DNA and it was a good-
method for total DNA extraction from Euphorbia．
Key words： Euphorbia Linn； medicinal herb； hexadecyltrimethy ammonium bromide（CTAB） method； total DNA extraction
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2011.16.049
第 16 期
少种具有很高的药用价值，李忠国［6］调查发现，安徽
省琅琊山药用植物资源中有 22 种大戟科药用植
物；李惠等 ［7］通过研究华东地区大戟属药用植物资
源后，整理出了 26 种大戟属药用植物，并且药用部
位明确，疗效确切，具有较高的药用价值。 大戟属药
用植物的医药价值使得其研究开发成为了热点，尤
其是对大戟属药用植物在分子水平上的探讨方兴
未艾。 目前在大戟属药用植物进行分子标记试验
中，由于本属植物具有白色或黄白色乳汁，含酚类、
黄酮类等次生物质较多，若提取方法不当，不仅提
取出来的 DNA 容易降解， 而且会影响 PCR 扩增反
应的稳定性和重复性。 因此，如何高效简便地去除
多糖、 多酚等次生物质， 对提取纯化大戟属植物
DNA至关重要。目前，大戟属药用植物总 DNA提取
方法的研究在国内外尚未见报道，所以在前期研究
的基础上 ［8，9］，结合本属植物特点，以经典提取植物
DNA 的 CTAB （十六烷基三乙基溴化铵，Hexade-
cyltrimethy ammonium bromide）法为基础［10］，并加以
改进， 筛选出一种比较适合大戟属植物 DNA 提取
的方法，为大戟属药用植物进一步开发利用提供技
术支持。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 供试材料 试验所用植物材料为采自安徽
省琅琊山的大戟 （E． pekinensis Rupr．）、月腺大戟
（E． ebracteolata Hayata）；采自芜湖市的乳浆大戟（E．
esula L．）、斑地锦（E． supina Rafin）、地锦（E． humi-
fusa Willd．）、 一 品 红 （E． pulcherrima Willd． et
Klotzsch．），原植物均经安徽师范大学周守标教授鉴
定。 用于提取 DNA 的材料为各供试植物的新鲜叶
片，采后迅速置于冰盒中，带回实验室后，除去主叶
脉，在电子天平上精确称取 0．5 g，于－20 ℃冰箱保存
3 d。
1．1．2 主要试剂 ①DNA 抽提缓冲液 ，NaCl 500
mmol ／ L，Tris－HCl 100 mmol ／ L、pH 值 8．0 和 EDTA
20 mmol ／ L、pH 值 8．0。 ②DNA 裂解缓冲液 ，NaCl
700 mmol ／ L， Tris －HCl 50 mmol ／ L、 pH 值 8．0 和
EDTA 20 mmol ／ L、pH 值 8．0，CTAB 5％（m/V），β－巯
基乙醇 1％（用前加）［11］。 ③TE 缓冲液，Tris－HCl 10
mmol ／ L、pH值 8．0 和 EDTA 1 mmol ／ L、pH值 8．0。④
50×TAE 缓冲液，Tris 242 g，冰乙酸 57．1 mL，EDTA
（0．5 mol ／ L、pH值 8．0）100 mL。⑤氯仿－异戊醇混合
液（体积比为 24∶1，下同）。 配制药品用的水均为双
蒸馏水。 将以上缓冲液分装后，密封、灭菌，置于冰
箱 4℃保存。
1．1．3 主要仪器 试验中的主要仪器有凝胶成像
仪、微波炉、离心机、超低温冰箱、电泳槽、电泳仪、
手掌型离心机、恒温水浴锅、电热恒温鼓风干燥箱、
超净工作台等。
1．2 方法
1．2．1 改良 CTAB 法提取植物总 DNA ①提取前
将裂解缓冲液放至 65 ℃水浴中。 ②称取 0．5 g植物
材料，用液氮速冻后，迅速研磨成细粉，分装于 1．5
mL 的 Eppendorf 管中。 ③在 Eppendorf 管中加入 1
mL DNA 提取缓冲液， 用力摇动使其充分混匀后，
于 15 ℃、8 000 g离心 5 min。④静止后弃上清，再加
入 1 mL DNA 提取缓冲液 ，充分混匀 ，于 15 ℃ 、
8 000 g 离心 5 min。 ⑤静止后弃上清， 加入 1 mL
65 ℃预热的 DNA 提取缓冲液， 悬浮沉淀， 充分混
匀，放入 65 ℃水浴 30 min。 ⑥于 15 ℃、12 000 g离
心 5 min，取上清，加入等体积的氯仿-异戊醇混合
液，轻轻颠倒混匀，静置 10 min。⑦于 15 ℃、12 000
g 离心 5 min，取上清，加入等体积的异丙醇，充分混
匀，4 ℃静置 30 min 。 ⑧于 15 ℃、12 000 g离心 10
min，静止后弃上清，加入 75 ％（V/V）乙醇洗数次。
⑨于 15 ℃、12 000 g离心 3 min， 静止后弃上清，自
然风干直至无酒精味。 ⑩加入 100 μL TE 缓冲液，
放入 4 ℃环境待用，或－20 ℃储存。
1．2．2 电泳检测 对所提取的 DNA 取 3～5 μL 于
0．8％的琼脂糖凝胶上，以 5 V ／ cm 电泳 1 h 左右，EB
染色 20～25 min，在凝胶成像系统（AlphaImager）中
观察和拍照。
2 结果与分析
2．1 DNA电泳结果
将叶片各部位提取的 DNA 进行琼脂糖凝胶电
泳， 检测结果见图 1。 DNA 电泳结果显示， 改良
CTAB 法所提取的大戟属植物叶片的 DNA 为一条
清晰完整的条带，DNA 片段大小较一致， 条带后面
没有明显的拖尾， 证明所提叶片的总 DNA 含杂质
较少。
M.Marker；1.大戟；2.月腺大戟；3.乳浆大戟；4.地锦；5.斑地锦；6.一品红
图 1 改良 CTAB 方法提取的总 DNA 电泳图
6 5 4 3 2 1 M
魏胜华等：改良 CTAB 法提取大戟属药用植物叶片总 DNA 试验 3419
湖 北 农 业 科 学 2011 年
2．2 总 DNA纯化
加入等体积的氯仿－异戊醇混合液， 轻缓颠倒
混匀， 室温静置 10～15 min； 于 12 000 g 离心 10
min；重复前面步骤。 取上清液，加入终浓度 0． 2～0．
4 mol ／ L 的 NaAc、12 倍体积的无水乙醇，放置 1 h。
12 000 g离心 10 min，弃上清液。 用 70 ％乙醇洗涤
沉淀 2～3 次，自然干燥后，溶于 50～100 μL TE中，－
20 ℃保存备用。
3 讨论
虽然植物 DNA 的提取是一项常规的分子生物
学实验技术，但由于大戟属植物组织细胞中含有大
量的酚类、多糖及其他次生代谢产物，使得用传统
的 CTAB 方法难以分离出高质量的 DNA，如果提取
方法选择不当，会干扰后续的操作。 作者对大戟属
植物叶片总 DNA 的提取过程经过反复的改进，最
后提取出了质量较高的总 DNA，并在提取中总结出
以下操作事项，以期为大戟属药用植物的分子生物
学研究提供技术支撑。
1）首先，用于 DNA 提取的植物材料是从远离
实验室的野外采集获得，新鲜材料在旅途中容易枯
萎、腐烂，特别是一些离体材料极易受到 DNA 酶的
作用，导致 DNA的降解。 因此采集后必须迅速置于
冰盒中，带回实验室。
2）植物材料在研磨时，一定要使材料处于低温
状态， 而且所用研钵应该是预先在－20 ℃冰箱冷冻
过夜、待其彻底冷却后再放入植物材料。 在研磨过
程中，确保不要让液氮挥发干净，以防止植物材料
回温，否则会造成 DNA 的严重降解；研磨叶片时，
粉末研得越细越好， 研磨好的材料非常容易变褐，
宜迅速转入 Eppendorf 管中，不要使之融化，以免造
成 DNA的降解。
3）在提取 DNA 的过程中，所有的操作均需要
动作轻柔，避免剧烈振动，以免 DNA断裂降解。
4）在用氯仿-异戊醇混合液抽提时，离心温度
应保持不低于 15 ℃；若温度太低，可能导致 CTAB
沉淀，从而损失 DNA；在离心前增加氯仿－异戊醇混
合液和提取缓冲液的接触时间，让杂质更好地被分
离，减少用氯仿－异戊醇混合液的抽提次数，避免操
作过程中 DNA的污染。
5）CTAB 是一种阳离子去污剂， 既能有效裂解
植物的细胞壁，又能去除多糖类物质，还可以溶解
细胞膜，较好去除多糖的干扰。在加入 CTAB缓冲液
进行温浴时，将时间延长至 2 h 能更好地处理多糖、
酚类及其他杂质，所获得的 DNA质量也将较高。
6）在提取过程中，采用常规 CTAB 法常出现多
酚类物质的褐化现象，使 DNA 溶液颜色产生浑浊。
β－巯基乙醇具有抗氧化作用， 在改良 CTAB 法中，
提取液中加入 1％ β－巯基乙醇可以有效地去除植
物组织内的多糖物质和多酚类物质，防止酚类物质
造成褐化现象。
7）PCR 技术对 DNA 样品量和纯度的要求均不
高，但因 PCR 具有很高的灵敏度，为防止试剂交叉
污染，应尽量减少提取步骤；采用改良的 CTAB 法提
取大戟属植物 DNA，能够获得高质量的 DNA样品。
8）在 DNA 提取过程中，用异丙醇沉淀时，若异
丙醇未挥发尽， 会直接影响 Taq DNA 聚合酶的活
性，试验中应该让异丙醇沉淀离心后充分挥发。
9）在 DNA 提取过程中，氯仿是蛋白的有效沉
淀剂，对 Taq DNA聚合酶有变性作用。
10）DNA 沉淀出现后 ， 絮状沉淀不一定全是
DNA 沉淀，判断絮状沉淀的标准是看其是否易溶于
TE，若易溶则说明其杂质含量较少，若难溶则说明
其杂质含量较高，纯度较差。 而 TE溶解是一个比较
缓慢的过程，为了充分溶解，通常在 4℃条件下溶解
1 d。
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