全 文 ：第 24卷　第 1 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2004 年　1月
Vol.24　No.1　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH Jan., 　2004
榉属植物总 DNA提取方法研究
金晓玲1 , 2　乌云塔娜2　张智俊2　何　平2 , 3
(1.浙江师范大学生命与环境科学学院 , 金华　321004)
(2.中南林学院经济林育种与栽培国家林业局重点实验室 , 株洲　412006)
(3.中国国际工程咨询公司 , 北京　100044)
摘　要　榉属植物体内酚类 、多糖等次生物质含量较高 ,严重影响从中提取总 DNA 的产量和质
量。针对这一问题探索出一种适合榉属植物总 DNA 的提取方法 ,并对提取的总 DNA进行了纯度
和浓度的鉴定 。结果表明此方法可有效去除次生物质对 DNA的干扰 ,样品 DNA的质量和纯度较
高 ,可用于随机引物 RAPD扩增和随后的各种遗传学分析。
关键词　榉属;总 DNA提取;RAPD
Study on DNA extraction of Zelkova
JIN Xiao-Ling1 ,2　WU YUN Ta-Na2　ZHANG Zhi-Jun2　HE Ping2 , 3
(1.Zhejiang Normal University , Jinhua　321004)
(2.The Key Laboratory of Non-timber Breeding and Cultivation of National Forestry Ministry , Center-South
Forestry University , Zhuzhou 　412006)
(3.International Engineering Consulting Corporation , Dept.Agriculture , Forestry and Water , Beijing　100044)
Abstract　The content of phenolic compound , polysaccharides and other secondary metabolites is high in
ligneous plant , which influences frequently the yield and quality of genome DNA when being extracted.In
this study , a new method was introduced which do best for characterization the purity and concentration of
genome DNA.The result showed that it could effectively eliminate the affections of the secondary materials to
extracted genome DNA from Zelkova , and which be suitable for RAPD analysis and other geneticanalysis.
Key words　Zelkova;extraction of genome DNA;RAPD
　　获取高质量的 DNA样品是进行分子生物学研
究的必要前提[ 1] 。目前 , DNA 的提取及纯化在一
些草本植物中已有成熟方案[ 2 ～ 4] 。就木本植物而
言 ,有工作者已摸索出一些适合总 DNA 提取的方
法[ 5 ～ 7] ,但这些方法通用性较差 。造成这种现象的
可能原因是:木本植物体内含有较多的酚类 、多糖 、
萜类等次生物质 ,而且这些物质在不同木本植物体
内的含量及比例不同;它们可与 DNA 结合形成复
合物 ,DNA埋在这种粘稠的胶状物中难以溶解或
产生不同程度的褐变。因此对于不同的物种可能
需要寻找适当的提取方法除去这些次生物质 ,以获
得较高质量的 DNA样品。
榉属是榆科的阔叶落叶乔木 , ,本属全世界共
10种 ,我国仅 3种[ 8] 。榉木材质坚重有光泽 ,为阔
叶树材之上品 。而且具有耐烟尘 、抗有毒气体和很
强的抗风能力等特点 ,在营造优质的人工林中起着
基金项目:国家林业局高技术项目(99-14)。
　第一作者简介:(1963-),女 ,副教授 ,主要从事林木生物技术研究。
　收稿日期:2003-06-17
重要的作用。我国榉树资源缺乏 ,已被列为国家二
类保护植物[ 9] 。在对榉属植物进行有关的分子生
物学研究中 ,发现其叶内酚类 、多糖等次生物质含
量很高 ,从中提取较纯的 DNA 难度较大 。通过反
复实验 ,我们摸索出一种经济 、有效的提取 、纯化榉
属植物总 DNA的方法 ,用此方法提取的 DNA 适用
于PCR扩增和其它遗传学分析。
1　材料与方法
1.1　材料
光叶榉(Zelkova serrata):从湖南省炎陵县下村
采得光叶榉小苗 ,种植于中南林学院苗圃 ,取其嫩
叶;大果榉(Z .sinica):河南省新县林场采得新鲜嫩
叶置 4℃冰壶 ,带回实验室 ,于-70℃保存;大叶榉
(Z.schneideriana):武汉华中农业大学植物标本园
采得种子 ,种植于中南林学院苗圃中萌发得实生
苗 ,取其嫩叶。
1.2　DNA提取和检测方法
1.2.1　DNA的抽提
称取-70℃冰冻的叶片 1.0 g ,置于研钵 ,迅速
加入 CTAB液(含 2% CTAB , 2%PVP , 100 mmol/L
Tris-HCl ,25 mmol/L EDTA ,2.0 MNaCl ,0.5 g/L 亚
精胺(可省去), 2%β-mercaptoethnol(使用前加入))4
mL ,研磨均匀后 ,分装于 1.5 mL 的 Eppendorf 管中/
3体积 ,于 65℃保温 10 ～ 15 min ,期间不断振摇管
子 ,使样品与充分混合 , 12 000 r/min离心 5 min 。
取上清液 ,加等体积氯仿:异丙醇(49:1),摇匀 , 12
000 r/min离心 5 min。重复该步骤一次。取上清
液加 1倍体积的预冷异丙醇 ,小心摇动 ,出现沉淀 ,
得粗 DNA 。短时离心后倒掉上清液 ,于沉淀中加 1
mol/L NaCI 400 μL ,待沉淀溶解后 ,加等体积氯仿:
异丙醇(49:1),摇匀 ,12 000 r/min离心 5 min 。取
上清液加 1/10体积醋酸钠 ,再加2.0 ～ 2.5倍体积
100%乙醇 ,轻摇至白色絮状 DNA 沉淀出现 。4℃
12 000 r/min离心 10 s使DNA沉淀 ,风干DNA。再
加70%乙醇 ,洗涤 、风干 DNA。DNA中加入含 RNA
酶的 TE缓冲液 200 μL 溶解 DNA ,置 37℃保温过
夜。
取出过夜处理的 DNA ,加 0.6 ～ 1.0倍体积的
异丙醇沉淀DNA ,12 000 r/min离心 1 min 。得 DNA
沉淀 ,加100 μLTE 缓冲液溶解 DNA 。用此液进行
电泳及 DNA 纯度和浓度的测定 。将 DNA样品置
-20℃保存 ,用于 PCR扩增和其它遗传学分析。
1.2.2　DNA样品的鉴定
1.2.2.1 DNA纯度 、浓度检测
紫外吸收检测:将各种 DNA 在 Beckman DU
640型蛋白质核酸分析仪上 ,测定 230 、260 、280 nm
处的光吸收值 ,根据 260 与 280 nm 的光吸收比值
及 260与 230 nm的光吸收比值确定 DNA 的纯度 ,
计算 DNA的得率。
琼脂糖电泳检测:将事先用 TE缓冲液配制的
0.8%琼脂糖凝胶(加 EB)加热溶解后 ,铺成 4mm
厚的胶 ,点样液:5 μL DNA+1.5 μL 溴酚兰+5 μL
纯水 。将抽提的 DNA分别点样后 ,置于电极缓冲
液中 ,于 50 V电压下电泳 40 min ,于 BioRAD凝胶
成像系统上观察电泳结果 ,拍照。
1.2.2.2　扩增反应
以提取的 DNA 为模板 ,10碱基寡聚核苷酸为
引物 ,在 eppendorf PCR仪进行PCR扩增。
扩增反应体系:20 μL PCR 反应体积 , ddH2O
12.4 μL , 10 × Buffer 1.5 μL , 25 mmol/L MgCI2
2.0μL , 2 mmol/L dNTPs 1.2 μL , 10 μmol/L Primer
1.0μL , 5U Tag DNA聚合酶 0.2 μL , 10 ng/μL DNA
template 1 μL。
RAPD扩增条件为:95℃变性3 min ,一个循环;
94℃变性 30 s ,36℃退火 30 s , 72℃延伸 60 s , 35个
循环;72℃延伸 5 min ,反应终止。
　　RAPD 扩增产物检测条件:取 PCR产物 , 加
1.0μL的溴酚兰指示剂 ,琼脂糖凝胶浓度为1.4%;
0.5 ×TBE 缓冲液中电泳 , 电压不超过 5V/cm;
0.5 g/L的 EB 中染色 10 ～ 20 min ,蒸馏水中清洗
10 min ,于 BioRAD凝胶成像系统上观察电泳结果 ,
拍照 。
2　结果与分析
2.1　DNA质量检测
　　DNA在 260 nm 处有一个明显的吸收峰 , 本实
验提取的 DNA经检测知:260及 280 nm 的吸收比
值在1.755 ～ 1.859之间 , 说明得到的DNA是比
较纯的。蛋白质 、 酚类及多糖类杂质去除较完全 ,
提取时残留的氯仿 、 乙醇等小分子成分已基本除
去。260及 230 nm 的吸收比值在2.001 ～ 2.286
之间 , 也说明 DNA 溶液中基本上没有残存
的小分子及盐类杂质 , 其纯度已达到下游
操 作 的要 求 。根 据 2 6 0 nm 的 吸 收 值 估 测
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表 1 榉属植物基因组 DNA浓度及产率
Table1 Concentration and poduction of genomic DNA of Zelkova
样品名称
Name of
Samples
OD230
Absorption
at 230nm
OD260
Absorption
at 260nm
OD280
Absorption
at 280nm
OD260/OD230 OD260/OD280
DNA 浓度 (μg/mL)
Concentration
of DNA
DNA产率 (μg/ g)
Product ion
of DNA
大果榉 0.300 5 0.005 7 0.004 2 2.001 1.755 0.340 1 0.112
光叶榉 0.306 5 0.010 1 0.009 4 2.156 1.781 0.435 6 0.136
大叶榉 0.303 1 0.005 7 0.004 2 2.289 1.859 0.411 5 0.121
DNA 的浓度在0.340 1 ～ 0.411 5μg/mL 之间 ,
DNA的产率在 0.112 ～ 0.136 μg/g之间 (表 1)。
电泳检测结果与分光光度计检测结果一致 ,
DNA样品在电泳凝胶上呈现出清晰 、 迁移率很低
的整齐条带 , 各个种的 DNA 的长度都在 20 kb以
上 , 降解较少 (图 1), 溴酚蓝前没有光亮区且样
品槽内也无荧光出现 。由此可见 , 用本文所述的
方法已基本将蛋白质 、 多糖等杂质以及一些带正
电荷的杂质除去 , 得到较纯的 DNA样品 。
2.2　RAPD扩增
用该方法提取的总 DNA样品 , 用Sangon公司
生产的 S1026 (序列为)进行 PCR扩增 , 扩增产
物经电泳染色 , 成像系统照相 (图 2)。可以看
到 , 三种榉树植物 DNA用引物 S1026扩增后 , 出
现多态位点 。表明榉属植物种间存在着明显的遗
传差异。
图 1　榉属植物基因组 DNA
Fig.1　The genomic DNA of Zelkova
1 , 3.大叶榉 Z .schneideriana;2.光叶榉 Z.serrata;
4 , 5.大果榉 Z.sinica M:Mark 23kb
3 讨论
从植物组织中提取 DNA的方法已经比较成
图 2　随机引物 S1026 扩增产生的 RAPD 带型
Fig.2　RAPD patterns generated with random primes S1026
M:分子量标记 DL2.000 ;1.大果榉 Z .sinica;
2.光叶榉 Z.serrata;3.大叶榉 Z.schneideriana
图 3　CTAB法抽提的 DNA
Fig.3　The genomic DNA extracted by CTAB
1.大叶榉 Z.schneideriana;2.光叶榉 Z .serrata;
3.大果榉 Z .sinica
熟 , 一般来说 , 酚类物质是芳族环上的氢原子被
羟基或功能衍生物取代后生成的化合物 , 广泛分
布于植物体 , 是植物体内重要的次生物质之一 。
酚类物质经氧化后易与 DNA 共价结合引起褐变 ,
使 DNA失活 。为有效除去酚类物质 , 抽提液中添
加 PVP 和巯基乙醇 (根据不同材料浓度可适当的
1091期　　　　　　　　　　　　　　　　金晓玲等:榉属植物总 DNA提取方法研究
图 4　改良 CTAB法抽提的 DNA
Fig.4　The genomic DNA extracted by modified CTAB
调整), 可很好的游离出酚类 , 防止酚类的氧化 ,
得到白色 DNA沉淀 。多糖是影响植物 DNA纯度
的另一常见因素 , 这类化合物可与 DNA同时沉淀
使DNA提取物呈胶状从而影响对 DNA样品的浓
缩 , 而且干扰后续操作 , 如抑制某些 DNA修饰酶
的活性 、影响用分光光度法对核酸进行定量分析
等。
榉属植物叶组织中酚类 、 多糖等化合物含量
较高 , 常规提取方法中 , 通过氯仿 —异戊醇抽提 ,
高盐低温沉淀可除去一部分多糖 , 但仅通过上述
步骤并不能完全除去多糖对榉属植物 DNA提取的
影响 。我们采用常用的 DNA 抽提法:SDS 法和
CTAB法提取榉属植物 DNA 时 , 未能取得理想的
结果 , 所得 DNA 颜色均为深褐色。经电泳检测 ,
要么DNA分解严重 , 图谱拖带明显 (图3);要么
DNA在点样槽根本不动 , 而且收得率很低 , 经反
复多次试验均未成功 。因此 , 我们在此基础上对
CTAB法进行了改良 , 去除糖类主要采用抽提缓冲
液的两次抽提 , 高浓度 NaCl和异丙醇沉淀处理 ,
最终达到多糖和核酸分离的目的 , 得到了纯度较
高的DNA乳白色透明颜色 (图4), 电泳图谱拖带
较少 , DNA分子量较大 , 此法比较适合榉属植物
DNA的抽提。这一结果可为榉属植物 DNA的提取
提供借鉴 。
参　考　文　献
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