全 文 ： 研究报告
肠浒苔凝集素的分离纯化及性质研究Δ*
宋玉娟1 ,崔铁军 2 , 李丹彤22 ,焦春艳2
(1. 中国药品生物制品检定所 北京 100050;2.大连水产学院 辽宁 大连 116023)
摘　要:肠浒苔 Enteromorpha intestinalis经 PBS 缓冲液抽提 、硫酸铵分级 、DEAE-52 纤维素离子交换层析
和 SephadexG-200 分子筛层析 , 从中纯化出肠浒苔凝集素(EIL)。肠浒苔凝集素在 PAGE 和等电聚焦电泳上
均显示单一蛋白染色带 ,其等电点为 8. 9 ,用 SephadexG-200 分子筛层析测得其相对分子质量为 17783。 肠浒
苔凝集素对单胞藻及兔 、鲤 、鲫 、人血型红细胞(A , B , AB , O)均表现出一定程度的凝集活性 , 对鲫的凝集活
性最强 ,且不被已测试的 D-果糖 、D-半乳糖 、葡萄糖 、蔗糖 、甘露糖 、乳糖 、牛甲状腺球蛋白 、鸡卵白蛋白 、γ-球
蛋白抑制。肠浒苔凝集素在 pH4. 0 ～ 10. 2 范围内均有活性 ,而在 pH 6. 9 ～ 8. 0 范围内活性较高。肠浒苔凝
集素在 90℃加热 1h , 活力并未减弱 ,说明这种凝集素具有很强的耐热性。
关键词:肠浒苔;凝集素;纯化;性质
中图分类号:Q946. 1　Q949. 210. 6　文献标识码:A　文章编号:1002-3461(2005)01-0001-05
Isolation , purification and characterization of lectin from En-
teromorpha intestinalis
SONG Yu-juan1 , CU I Tie-jun2 , LI Dan-to ng 2 , JIAO Chun-yan2
(1. National I nst itute for the Control o f P harmaceut ical and B iological P roducts , Bei j ing
100050 , China;2. Dal ian Fisheries college ,Dalian 116023 ,China)
Abstract:Lectin f rom green marine alg ae Enteromorpha intestinalis (EIL) was iso lated by
ext ract ion w ith PBS , fo llow ed by ammonium sulfate f raction and a combinat ion of ion-ex-
change chromatog raphy on DEAE-52 fiber and gel fil tration on SephadexG-200. Lectin
show ed sing le band on both PAGE and isoelect rofocusing elect ropho resis. It s isoelect ric
point w as 8. 9 and mo lecular w eight w as 17783 tested on SephadexG-200. EIL display ed
some agg lutination activities w i th Chlamydomonas and ery throcy tes of rabbi t , common carp ,
crucian carp and human (A , B , AB , O), but the maximum agg lutination w as wi th crucian
carp. The hemagglutinating activity fo r rabbit ery throcyte could no t be inhibited by D-f ruc-
to se , D-galacto se , g lucose , sucro se , mannose , lacto se , bovine-thy rog lobulin , egg albumin
and gamma-g lobulin. The hemagglutinating activity of lect in w ould be showed at pH 4. 0 ～
10. 2 , and mo re po tent at pH 6. 9 ～ 8. 0. The hemagg lut inat ing activity w as no t af fected at
90℃ for 1h , so i t could be said that the lect in had high heat resistance.
Key words:Enteromorpha intestinalis;lectin;purifica tion;characteriza tion
　　凝集素是非免疫起源的蛋白质或糖蛋
白 ,它不仅具有凝集细胞 、抑制肿瘤细胞增
殖 、激活淋巴细胞 、抑制血小板凝集等多种生
物活性 ,而且还可能参与了生物体内胚胎发
育和机体代谢的调控等重要的生理和病理过
程[ 1] 。
1
中国海洋药物杂志 2005 年 2月第 24 卷第 1期 Chin J Mar Drugs , 2005 February , Vol. 24 No. 1
* Δ农业部 85-青年基金资助项目(渔 85-93-青 05)
陆生动植物凝集素已被大量纯化并在生
物化学和生物医学等领域得到了广泛而深入
的研究和应用 ,而海洋生物凝集素的生物活
性也绝不比陆生生物凝集素逊色 ,尤其是海
藻凝集素 ,它广泛存在于各种海藻中[ 2] 。但
是 ,由于其分离纯化困难及原料采集受地理
条件的限制 ,从 70年代开始到 1994年为止 ,
仅有 10种绿藻和 13种红藻的凝集素被分离
纯化[ 3] 。并且 ,其中从5种海藻中得到的只是
部分纯化制品 ,作为商品出售的凝集素仅见 2
种[ 4] 。其比较生物化学研究及更深层的研究 ,
如糖链顺序和结构的研究等[ 2] 尚属空白 。
绿藻肠浒苔在大连等地区生长期长 ,生
物量大。经笔者筛选 ,它具有较高的凝集活
性 ,但国内外未见对其分离纯化的报道。我
们首次对其进行分离纯化及性质研究 ,以期
为海洋药物的开发及海产经济动物病害的防
治开拓出一条新途径 。
1 材料与方法
1. 1 材料
肠浒苔 Enteromorpha intestinalis (L. )
Link采自大连附近海域 ,经大连水产学院李
永函教授鉴定;新西兰兔[合格证号为 SCXK
(辽)2000-0002]购于大连医科大学实验动物
中心;鲤鱼和鲫鱼购于大连市场;单胞藻取自
大连水产学院海养楼藻种间;A ,B ,O , AB型
血液由本校健康学生提供 。
SephadexG-200(Phamacia), 蓝葡聚糖
(Blue Dex tran2000 ,上海伯奥生物科技有限
公司),DEAE 纤维素(DEAE-52 ,What’ man
进口分装),核糖核酸酶(Pharmacia),γ-球蛋
白(human , Serva), Ampho line pH3. 5 ～
10. 0等其它等电聚焦用品均采用 LKB成套
产品 ,牛血清白蛋白(上海浦江生物化学研究
所),卵清蛋白(上海生化所东风技术公司),
其它试剂均为国产分析纯或生化试剂。
1. 2 方法
1. 2. 1 肠浒苔凝集素的分离纯化
1. 2. 1. 1 样品的采集和粗提液的制备
海藻采回后立即用过滤海水洗净 ,吸干
表面水分 ,冰箱中冷冻 ,然后置于冷冻干燥机
中冻干 ,磨粉 ,称取藻粉 20. 00g 加入 PBS 缓
冲液 400mL 中 , 间歇搅拌过夜(4℃), 离心
(4℃,5000r min - 1 , 55min),得到的上清液
即为粗提液。
1. 2. 1. 2 硫酸铵分级和透析
硫酸铵分级参考赵永芳的方法[ 5] 。冰水
浴条件下 ,在粗提液的低饱和度(35%)和高
饱和度(85%)(NH 4)2SO4两侧分别做分级
实验 。选低饱和度梯度中上清活力最强的饱
和度(20%)和高饱和度梯度中上清活力最弱
的饱和度(70%),在冰水浴条件下 ,向粗提液
中加入研磨好的固体硫酸铵至 20%和 70%
饱和度 ,搅拌过夜(4℃),离心(4℃,5000r
min -1 ,55m in),取上清。透析参考北师大生
化教研室的方法[ 6] ,收集沉淀于透析袋中 ,蒸
馏水透析至无 SO 2 -4 为止(10%的 BaCl2检
验),然后将样品冷冻干燥 。
1. 2. 1. 3 DEAE-离子交换层析
取透析后样品 100mg ,用 2mL0. 01mol
L - 1的 Na2HPO4溶解 ,上 DEAE-纤维素柱
(1. 6×30cm),上样后先用 0. 01mo l L - 1的
Na2HPO 4平衡一个柱体积 , 然后用盐浓度
(NaCl)为0. 1mol L - 1 , pH 自8. 0(0. 01mol
L - 1的 Na2HPO 4)到 4. 0(0. 5 mol L - 1的
NaH2 PO 4)进行连续 pH 梯度洗脱 。流速为
30mL h -1 , 3mL tube - 1 ,部分收集器收
集 ,751型分光光度计测 A 280 ,洗脱至 A 280 <
0. 01 。检测每管的凝集活性 ,将活力峰部分
收集合并 。
1. 2. 1. 4 Sephadex-G200 分子筛凝胶层析
进行分离提纯及相对分子质量测定[ 7]
层析柱为 1. 6×30cm ,洗脱液为含 1‰
叠氮化钠的生理盐水 , 流速 20mL h -1 ,
3mL tube - 1 ,样品为经过浓缩的离子交换
层析得到的活力峰 。
1. 2. 2 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测
2
Chin J Mar Drugs , 2005 February , Vol. 24 No. 1 中国海洋药物杂志 2005年 2 月第 24 卷第 1 期
参照瑞典 LKB 公司多用电泳仪操作手
册进行 。胶浓度 7. 5%, 胶缓冲液 pH 为
8. 9 , 预电泳 50mA , 30min , 前电泳 20mA ,
10min ,电泳 40mA , 3h ,然后用三氯乙酸固
定 ,考马斯亮蓝 R250染色 ,用冰醋酸-乙醇脱
色 ,放入保存液(乙醇冰醋酸 ∶冰醋酸∶甘
油:双蒸水=3∶1∶1∶5),最后制成干板保
存。
1. 2. 3 蛋白质含量测定。[ 8]
采用 A280 ,以牛血清白蛋白作对照。
1. 2. 4 凝集活性的测定
参考李丹彤的方法[ 9] 。测定凝集素对其
它类型血细胞和单胞藻的凝集活性的方法同
上 ,可借助显微镜和血球计数板进行定量。
1. 2. 5 等电聚焦电泳测定等电点
等电聚焦电泳按瑞典 LKB公司多用电
泳仪操作手册进行 。Ampho line 的 pH 范围
为 3. 5 ～ 10. 0 , 胶浓度为 4. 8%, 胶厚度为
0. 5mm ,采用表面电极测胶板 pH 。
1. 2. 6 糖抑制实验和蛋白抑制实验
参照李丹彤的方法[ 9] 。
1. 2. 7 pH 对血凝活力的影响
参考 Ahmed 的方法[ 10] 配制 pH4. 0 ～
10. 2的系列缓冲液 ,测定不同 pH 条件下的
血凝活力 。
pH4. 00 ～ 6. 00采用 0. 015mol L -1的
柠檬酸-Na2HPO 4缓冲液 , pH6. 50 ～ 7. 50采
用 0. 015mo l L - 1的磷酸盐缓冲液 , pH8. 00
～ 9. 00采用 0. 015mol L -1的 T ris-HCl缓
冲液 ,pH9. 51 ～ 10. 14采用 0. 015mol L -1
的 Na2 CO 3-NaHCO 3缓冲液 。
1. 2. 8 热稳定性试验
将浓度为 1. 0mg mL - 1凝集素分级后
样品分成若干份 ,分别在 25 ～ 90℃的不同条
件下温育 10 , 20 , 60min ,取样 ,冷却 ,与空白
对照 ,测定血凝活性 。
2　结果
2. 1 肠浒苔凝集素的分离纯化
肠浒苔凝集素的分离纯化共分 4步:(1)
冷冻干燥 , PBS 抽提 , 离心。结果见表 1 。
(2)硫酸铵分级及透析 。选低饱和度梯度中
上清活力最强的饱和度(20%)和高饱和度梯
度中上清活力最弱的饱和度(70%)。有关数
据见表 1。(3)DEAE-纤维素层析 ,得到 2个
蛋白峰 ,第 2个蛋白峰之后为活力峰 ,结果见
表1和图1。(4)Sephadex-G200分子筛层析
得 1个蛋白峰 ,蛋白峰之后为活力峰 ,结果见
表 1。合并有活性部分 ,透析 ,冷冻干燥得白
色样品。在 PAGE 上显示一条蛋白质染色
带 ,结果见图 2。
图 1　DEAE-纤维素离子交换层析结果
表 1 肠浒苔凝集素的纯化结果
成　分 总体积(mL)
总蛋白
(mg)
最小活力体积
(μL)
总活力
(U)
比活力
(U mg - 1)
纯化倍数
(倍)
活力回收率
(%)
粗提液 　 400 　662. 23 　 20 2. 00×104 　30. 20 　　1 　 100
20%(N H4)2SO 4 　 390 　282. 04 　 20 1. 95×104 　69. 14 　　2 　 98
70%(N H4)2SO 4* 　 435 　435. 00 　 10 4. 35×104 　100 　　3 　 218
离子交换层析 　 39 　97. 65 　 40 /24 1. 56×104 　159. 75 　　5 　 78
分子筛凝胶过滤 　 12 　33. 64 　 40 /26 1. 92×104 　570. 75 　　19 　 96
注:*透析干燥后配成 1mg mL - 1的溶液。
3
中国海洋药物杂志 2005 年 2月第 24 卷第 1期 Chin J Mar Drugs , 2005 February , Vol. 24 No. 1
图 2　聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
图 3　Sephadex-G200 测定相对分子质量结果
图 4　等电聚焦电泳结果
2. 2 肠浒苔凝集素的理化性质
2. 2. 1 肠浒苔凝集素的相对分子质量
肠浒苔凝集素经 Sephadex-G200 分子
筛层析 ,得到 1个蛋白峰 ,蛋白峰之后为活力
峰。以核糖核酸酶(ribonuclease)(13700),
卵清蛋白(Egg albumin)(45000),牛血清白
蛋白(bovine serumalbumin)(67000),γ-球蛋
白(gamma-globulin)(165000)为标准绘制标
准曲线(图 3)。根据肠浒苔凝集素最大活力
峰位的 K av值求得相对分子质量为 17783。
2. 2. 2 肠浒苔凝集素的等电点
纯化后的肠浒苔凝集素用等电聚焦的方
法得到单一蛋白染色带 ,其等电点为 8. 9 ,见
图 4。
2. 2. 3 肠浒苔凝集素的血凝活性及单胞藻
凝集活性实验
用人的 A 、B 、O 、AB 4 种血型红细胞及
鲤(Common carp)、鲫(C rucian carp)、兔
(rabbit)红细胞进行血凝活性实验 ,用新月
菱形藻(N itzschia closterium)、亚心形扁藻
(P latymonas subcord i f ormis)、叉鞭金藻
(Dicrateria sp p. )和小球藻(Chlorel la val-
garis)做单胞藻凝集活性实验 ,结果见表 2 。
2. 2. 4 肠浒苔凝集素的热稳定性实验
肠浒苔凝集素的耐热性较高 ,从 20 ～
90℃活性保持稳定 ,且略有升高趋势。
2. 2. 5 肠浒苔凝集素的糖抑制实验和蛋白
抑制实验
表 2 肠浒苔凝集素的凝集活性
细胞来源 兔 鲤 鲫 人血型
A B O AB
菱形藻 扁藻 叉鞭金藻 小球藻
凝集活性 22 21 23 22 22 22 22 21 21 21 21
　　以等量生理盐水代替凝集素作为对照 ,
用兔红细胞进行糖抑制实验 ,结果显示肠浒
苔凝集素不被单糖葡萄糖 、D-半乳糖 、D-果
糖 、D-甘露糖和乳糖抑制 ,蔗糖使红细胞沉降
速度变慢 ,但最终下沉在血凝板 V 型孔底部
形成明显红点 。被实验的 3种蛋白 ,即牛甲
状腺球蛋白 、鸡卵白蛋白 、γ-球蛋白均不表现
抑制凝集的作用。
2. 2. 6 pH 对肠浒苔凝集素的血凝活力的
影响
4
Chin J Mar Drugs , 2005 February , Vol. 24 No. 1 中国海洋药物杂志 2005年 2 月第 24 卷第 1 期
肠浒苔分级透析后的干粉制成 1 mg
mL - 1的溶液 ,在 pH4. 0 ～ 10. 2 缓冲系统中
室温静置 2h ,用兔红细胞测定其血凝活力。
如大多数海藻凝集素一样 ,肠浒苔凝集素在
宽的 pH 范围内表现出凝集活力 ,在 pH6. 9
～ 8. 0范围内保持稳定 ,结果见表 3。
表 3 肠浒苔凝集素的 pH 稳定性
pH 值 4. 0 4. 5 5. 0 5. 6 6. 0 6. 5 6. 9 7. 2 7. 5 8. 0 8. 6 9. 1 9. 6 10. 2
血凝活力 21 21 21 21 22 22 23 23 23 23 22 22 21 21
3 讨论
试验采用海藻凝集素分离提纯的经典方
法 ,即纤维素离子交换层析和 Sephadex 分子
筛层析相结合的方法。DEA E-52 纤维素离
子交换层析实验发现 ,肠浒苔对 pH 值改变
和 NaCl提供的离子强度改变反应明显。经
过对洗脱液 pH 梯度和盐度的反复调整 ,我
们得到了较好的纯化效果 , SephadexG-200
分子筛层析使肠浒苔在离子交换层析的基础
上纯化了 14 倍。经上述两步纯化后我们得
到了较纯的凝集素制品 ,该制品经 PAG E及
等电聚焦均显示一条蛋白染色带。该方法的
缺点是两步层析使凝集素有较多的损失 。
用SephadexG-200 分子筛层析测得肠
浒苔的相对分子质量为 17783 ,这与文献[ 2 , 3]
关于海藻凝集素的相对分子质量较小的报道
(4. 2KD-43KD左右)相符合。已报道的海藻
凝集素相对分子质量最低的为 3. 5KD[ 11] ,这
与陆生植物凝集素的相对分子质量多在 10
万左右形成鲜明的对照。红翎菜属 3种凝集
素的蛋白质 N-端 AA 排列顺序基本相同 ,但
与陆生植物的却迥然不同。所以 ,海藻凝集
素的分子构造对研究凝集素分子的进化有着
特殊的意义。
肠浒苔凝集素对单细胞具有凝集活性 ,
这在国内尚属首次报道。它为海洋经济动物
的病害防治提供了有力的理论和实践基础。
此外 ,肠浒苔凝集素对人 A , B ,O ,AB血型红
细胞的凝集活性均为 22 ,而对 4种单胞藻的
凝集活性均为 21 ,这在一定程度上反映了种
属间的亲缘关系 。肠浒苔凝集素对人血细胞
有凝集活性 ,这为海藻凝集素的资源开发提
供了理论依据 。
凝集素所显示的种种生物活性 ,可能是
凝集素和复合糖蛋白的糖链进行特异性结合
引起的。因此 ,研究其识别的糖链结构具有
非常重要的意义 。糖抑制实验表明 ,肠浒苔
凝集素的活性不被糖抑制 , 这与多数文
献[ 2 , 3]的报道相符合。
参考文献
[ 1] 　孙册 ,朱政 ,莫汉庆 ,等.凝集素[ M] .北京:科学出版
社 , 1986:1.
[ 2] 　堀贯治.海藻のレクチン[ J] .化学と生物 , 1989 , 27
(4):210.
[ 3] 　堀贯治.海藻のレクチン[ J] .化学と生物 , 1994 , 32
(9):586.
[ 4] 　黄方吕节译.海藻凝集素[ J] . 中国海洋药物 , 1991 ,
(2):54.
[ 5] 　赵永芳.生物化学技术原理及其应用[ M] .武汉:武
汉大学出版社 , 1994:6.
[ 6] 　北京师范大学生物系生物化学教研室.基础生物化学
实验[M ] .北京:高等教育出版社 , 1992:17.
[ 7] 　张龙翔 ,张庭芳 ,李令嫒.生化实验方法和技术[ M ] .
北京:人民教育出版社 , 1982:124.
[ 8] 　北京大学生物系生物化学教研室.生物化学实验指导
[ M] .北京:人民教育出版社 , 1980:94.
[ 9] 　李丹彤 ,崔铁军 ,马国庆 ,等.孔石莼凝集素的分离纯
化及性质的研究[ J] . 中国生物化学与分子生物学报.
2000, 16(6):773.
[ 10] 　Ahmed H , ch at terjee BP. Further characterization
and immunochemical stu dies on the carbohyd rate specifi city
of J ackf rui t (Artocarpus in tegrifolia) lectin[ J] . Journal Bi-
ologica l Ch emistr y. 1989 , 264:9365.
[ 11] 　Sampaio AH , Rogers DJ , Barw ell CJ . Isolat ion and
characterizat ion of the lectin f rom the g reen marine alga Ul-
b a lactuca L[ J] . Botanica Mar ina , 1998 , 41:427.
(收稿日期:2004-05-30)
5
中国海洋药物杂志 2005 年 2月第 24 卷第 1期 Chin J Mar Drugs , 2005 February , Vol. 24 No. 1