全 文 ：第 2 6卷 第 6期
25 0 0年 1 1 月 l卜1
水 产 养 殖
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、 01 . 2 6 N 0 . 6
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.
2 0 0 5
单胞藻软琼脂克隆固体培养基保藏技术
陆德祥
(江苏省南通农业职业技术学院 , 江苏 南通 226 0 7)
摘 要 : 单胞藻藻种的保藏技术 , 国内外多采用的是液体低温保藏技术 , 此方法保种时间短 、 营养盐消耗速度快 、 易污染 、
工 作量大 _ 、 试验改用单胞藻软琼脂克隆 固体培养基保藏技术 , 能够使营养成分缓慢的释放 ; 软琼脂 固体培养基的表面覆盖 0 3
(
I
n l厚度 的单胞藻培养液 , 可防止固体培养基水分的挥发 ;使单胞藻藻种在低温 (8一 1 0℃ )环境中能够保藏较长 的时间 ( 2一 3 年 )
关键词 : 单胞藻 ; 软琼脂 ; 克隆 ; 培养基 ; 保藏
中图分类号 : 59 84 4 文献标识码 : B 文章编号 : 10 4一 20 91 (20 0 5 )06 一 0 0 1-8 02
单胞藻在水体中可以作为幼体基础饵料 , 经
光合作用可增加水体溶解氧 , 并能够降低水中的
氨氮 ,稳定水质 ,维护 良性生态循环 , 是轮虫 、 卤虫
等动物性饵料和代用饵料所不能替代的 , 所以在
水产经济动物生产中单胞藻被广泛应用 , 作为虾
蟹类的蚤状 幼体 、 海参 、 鱼苗 、 贝类 的优良开 口饵
料 , 可以极大地提高种苗的成活率和变态率 。 但是
单胞藻藻种的保藏技术一直制约着水产经济动物
的育苗生产 ,现在多用的是液体低温保藏技术 ,这
种方法保种时间短 、 营养盐消耗速度快 、 易污染 、
工作量大 、 容易造成藻种保种失败 。 在保种实际工
作中 , 经过长时间的摸索 , 发现采用单胞藻软琼脂
克隆固体培养基保藏技术 , 可以显 著地提高单胞
藻藻种的保藏效率 ,减少 工作强度 , 延长单胞藻藻
种的保藏时间 。
! 试验材料
硅藻类的三角褐指藻 (hP ae o d ac t对u m t r i c o r n n t“ m
B o h l im )
、 新月菱形藻 (刀i r z 、 。 h i a 。 zo s t e r i u m A ll e n &
N e l s e n )
, 牟 氏 角 毛 藻 ( hC ae z o e e or : m i i e zle r i
L e m m e mr
a n n )等 : 绿藻类包括盐藻 ( D u n 以ie l l a s p . )
等 ;金藻包括球等鞭金藻 (ls oc h ysr i、 蒯b。 。 aP kr e ) 、
湛江叉鞭藻 ( sI oc hysr is 认anj i al lge ns is ;) 黄藻门包括
异胶藻等以及其它几种淡水藻类如小球藻 、 栅列
藻 、 衣藻等 , 藻类生物材料种源均来 自南通农业
职业技术学院生物工程系生物饵料培养 中心 。
2 试验方法
藻类生物材料经过提纯培养 , 预先接种 , 以确
保接种时种群处于指数生长期 。
2
.
1 培养基的配制
氮 、磷 、 铁 、 钾 、 硅 、 等基本元素 ( A 溶液 ) : 巧 g
N a N 0
3 、
6
.
5 9 F e C 13芍 H ZO 、 1 . 5 9 K H Zp O 4一 2H 2 ( ) 、 8 9
N a s i o
3 、 1
.
5 9 C a C 1
2 、 1 o o o m I
J 蒸馏水 。
微量元素 ( B 溶液 ) : 20 m g e u s o 4一 S H Zo 、 2 4 m g
Co C I币 H ZO 、 4 6 m薛ns O 4一 7 H 20 、 35 6 m g M n C I犷4 H ZO 、 6 9
E DTA一 N a 、 4 0 m g H 3B O 3 、 14
.
6 m g N a
Z
M o O
4 一 Z H zO 、
1 0 0 0 m L 蒸馏水 。
维生素等添加剂溶液 ( c 溶液 ) : 10 0 : , 19 v B I 、
0
.
5 m g v B
, 2 、 1 0 0 0 m L 蒸馏水 。
将上述 A 、 B 两种溶液分别配制 ,煮沸消毒后 ,
用高压灭菌的过的棕色试剂瓶储藏于低温 ( 4℃ )冰
箱中。 C 溶液配制时直接用高压灭菌的过的棕色试
剂瓶 ,加人无菌蒸馏水 1 o o m L , 然后将医用 v B I 、
V 1B 2 按照剂量要求加人棕色试剂瓶 (维生素加热
易分解变性 )储藏于低温 ( 4℃ )的冰箱中备用
2
.
2 软琼脂固体培养基的制备
从冰箱中取出按上述培养基营养成分配制 A 、
B
、
C 3 种培养液 , 使用前摇动棕色试剂瓶使营养成
分混合均匀 , 分别用灭菌过的移液管吸取 A 溶液
10 m L
、
B 溶液 O, 5 m L 、 C 溶液 O . s m L 加人 1 0 0 0 m l
的三角锥形瓶中 , 加人比重为 1 . 025 的海水 1 0 0 0
m (L 用食盐或海水晶进行调配 ) 。 培养液用 l%氢氧
化钠调到 p H 值 .7 5 左右 , 按 6% 。的比例称重纯化
收稿日期 : 200 5一 0 5一 16
第 6 期 ·技术与方法 · 陆德祥 单胞藻软琼脂克隆固体培养基保藏技术
琼脂粉 ,加入三角锥形瓶中 。 然后置于电热炉上加
热融化 。 营养液分装于 10 n 1L 的三角锥形瓶中 ,分
装量 30 m L 左右 , 二角锥形瓶 口采用无菌培养容器
封口 膜封 口 。 将上述配制好的固体培养基 , 置于电
热蒸汽压力消毒器中灭菌 ,温度控制在 12 1℃ ,灭菌
时间 2 0一 3 0 m i n 。 次 日待用 。
.2 3 接种与培养
.2 3
.
1 软琼脂克隆固体培养基培养技术 将软
琼脂固体培养基放在六孔电热水浴锅中 ,温度 42 ℃
左右 ,此时软琼脂固体培养基呈液化状态 。 于无菌
超净 一工作台上用移液枪吸取藻种液 10 0 林 L , 迅速注
射到呈液化状态培养基中 , 摇匀 ,立即放到常温的 、
流动的自来水中降温 (半分钟内完成 ) 。 然后将接种
完毕的固体培养基置于 : 温度 (20 士 l )℃的房间内 , 自
然光照 (3 0 0 0 ~ 5 o 0 0 lx 左右 , 避免直射光 )的环境
条件中培养 , 约 2 周时间 , 即可见到克隆的藻细胞
团 。
.2 .3 2 接种针接种与培养 在超净工作台的环
境中酒精灯上 ,用接种环将藻种液接种至固体培养
基中 , 一般采用接种环刺穿培养基表面划 “ 之 ” 或
“ 井 ” 线接种方法 ,将接种完毕的固体培养基置于温
度 2 0 一 2 5℃ 、 自然光照 ( 3 0 0 0 一 S O0 0 l x 左右 ,避免
直射光 )的环境条件中培养 ,约一个月时间 , 即可发
现培养基上有藻群生长 。
.2 .3 3 低温保藏 在超净工作台的环境中挑选
藻种群生长 良好的三角锥形瓶 , 在其表面覆盖 .0 3
(’ m 厚度的单胞藻培养液 (用 A 溶液 5 m L 、 B 溶液
0
.
2 5 : n L
、
C 溶液 0 . 2 5 m L 、 煮沸 消毒 过 的海 水
1 0 0 0m L 混合而成单胞藻培养液 ) , 置于 8 一 10 ℃的
低温培养箱中 , 给予自然光照 。 在此条件下 ,一方面
通过营养成分缓慢的释放 ,另一方面软琼脂固体培
养基的表面覆盖 .0 3 C m 厚度的单胞藻培养液 , 可
防止固体培养基水分的挥发 ,使单胞藻藻种在低温
环境中能够保藏较长的时间 ( 2一 3 年 ) 。
3 结果与分析
3
.
1 两种固体培养基接种保藏方法的比较
采用软琼脂克隆固体培养基保藏技术 ,操作方
便 , 藻种群可在短时间内克隆生长 , 达到分离保种
的目的 。 也可以增加纯化琼脂粉的用量 (可以达到
2% )
, 同时增加藻种的接种量使藻种固体化方便商
业运输 。 采用接种针接种与培养 , 藻种群所需生长
时间比较长 ,增加了 日常管理的工作量 。
3
.
2 藻种的分离与提纯
采用软琼脂克隆固体培养基保藏技术 , 可通过
减少藻种的接种量 (50 一 10 0 u )L ,使藻种在固体培养
基上局部区域内单个细胞克隆生长 , 为增加表面积
采取培育皿接种方法 (方便挑选藻群 ) ,经过 卜2 周
的培养 ,常发现杂藻藻群存在 , 可用接种环将所需
藻种种群重新接种至预备液体培养液中培养 ,然后
再接到软琼脂固体培养基上克隆隆养 , 这样经过几
次反复分离培养 , 使藻种得到提纯 。 此方法也可以
用于分离提纯藻种 。
3
.
3 培养液及固体培养基配制方便有效
将单胞藻所需的营养物资按照所需 的量及作
用 ,分别配制 A 、 B 、 C 三种母液 。 平时保藏在低温环
境中 ( 3 一 4℃ ) , 到使用时取出配制培养液及固体培
养基 ,用 1%氢氧化钠调到合适 的 p H 值 , 比如螺旋
藻其适宜的 p H 值为 8 . 5一 10 . 5 。 经过实践发现用这
3 种母液 A 、 B 、 C 配制的培养液及 固体培养基适合
硅藻类的三角褐指藻 、 新月菱形藻 、牟氏角毛藻 、 中
肋骨条藻 、 海链藻 、 筒柱藻 ;绿藻类包括中国小球
藻 、 蛋 白核小球藻 、 青岛大扁藻 、 亚心形扁藻 、 扁藻
s P
、 微绿球藻 、 眼点微绿球藻 、盐 藻 、 盐藻 s P 等 ;金
藻包括单鞭金藻 、 球等鞭金藻 3 01 0 、 球等鞭金藻
3 0 1 及绿色巴夫藻 ;黄藻门包括异胶藻等 ;淡水藻
类小球藻 、 栅列藻 、 衣藻等 。 国内外资料一般都介绍
采用分别配制培养液的方法 , 而用这 3 种母液 A 、
B
、
C 配制的培养液 , 几乎适合大部分淡水 、 海水藻
类的生长 ,这样就节省 了大量的工作 ,使藻种的保
藏 、培养变得更加方便 、有效 、可行 。
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