全 文 ：第 30 卷 第 6 期
2011 年 6 月
环 境 化 学
ENVIRONMENTAL CHEMISTRY
Vol． 30，No． 6
June 2011
2010 年 5 月 18 日收稿．
* 上海市科委科技攻关项目(08DZ1206302) ;国家高新技术研究发展计划(863 计划) (2007AA092001-15) ;海洋赤潮灾害立体监测技
术与应用国家海洋局重点实验室开放研究基金(MATHAB200917)联合资助．
＊＊通讯联系人，E-mail:jpcheng@ sjtu． edu． cn
软骨藻酸间接竞争 ELISA检测方法的研究*
刘元嫄 高利利 程金平＊＊ 王 茜 王文华
(上海交通大学环境科学与工程学院，上海，200240)
摘 要 为研究满足海产品日常分析的免疫检测法，采用自行制备的软骨藻酸多抗隆抗体，建立间接竞争
ELISA检测方法，分别摸索了抗原、一抗、二抗的最佳使用浓度及温育温度与时间，并用该方法测定了贝类样
品中的 DA含量．结果表明，该方法最低检测限约为 18 ng·mL －1，贝类样品测定的加标回收率在 47． 2%—
94. 2%之间． RSD在 12． 3%—17． 0%之间．所购买 3 种的贝类样品中均无 DA检出．
关键词 软骨藻酸，间接竞争 ELISA，多克隆抗体．
软骨藻酸 (domoic acid，DA)是失去记忆性贝毒的主要成分．人类误食被 DA污染的海产品后可引
起呕吐、腹泻、意识混乱、记忆丧失等症状，严重者可致死［1］． DA主要由海洋硅藻中的拟菱形藻属产生，
我国海域内目前发现的拟菱形属硅藻有 5 种．其中近海的尖刺拟菱形藻在沿海普遍存在尖刺拟菱形藻
是是引发赤潮的重要种类，在大连、青岛、黄海长江口、厦门港及南海各港湾都曾引起赤潮［2］．虽然迄今
为止，中国尚未报道过由 DA引发的中毒事件，海域内存在产 DA毒藻的事实与海产品国际贸易交易量
日趋增大的趋势时刻为海产品检疫敲响着警钟．
对于 DA的分析已经建立了多种方法，包括小白鼠生物检测法、高效液相色谱 (HPLC)检测、气相
色谱检测、薄层色谱、毛细管电泳检测法、免疫学方法、受体分析法、生物传感器检测等［3］．其中免疫法检
测因其速度较快，特异性高，操作简便，能同时检测大量样品受到欢迎，适合于基层检验单位常规分析．
免疫分析中使用的抗体主要分为单克隆抗体及多克隆抗体两类，但免疫分析中所需单克隆抗体的制备
繁琐，制备设施要求高，本研究尝试用自行制备的多克隆抗体，建立满足日常分析需要的免疫分析法．
1 材料与方法
1． 1 实验材料
自行制备的抗软骨藻酸多克隆抗体(效价为 800)和包被抗原 DA-BSA;软骨藻酸(DA)、牛血清白蛋
白(BSA)购自 Sigma 公司;Tween-20、四甲基联苯胺(TMB)购自上海生工生物工程技术有限公司;辣根
过氧化酶标记羊抗兔(IgG-HRP)购自北京博奥森生物技术有限公司．乙腈(色谱纯)购自 TEDIA 公司;
96 孔F型硬板酶标板购自上海生工生物工程技术有限公司．
贝类样品均购自于上海铜川路水产市场．
1． 2 主要仪器与设备
隔水式恒温培养 GNP-9050 型;2—20 μL单通道连续可调移液枪、50—200 μL单通道连续可调移液
枪、100—1000 μL 单通道连续可调移液枪 (Eppendorf) ;50—300 μL 十二通道连续可调移液枪
(MedDragon) ;Multiskan MK3 型酶标仪 (芬兰雷勃)．
1． 3 实验方法
1． 3． 1 抗原及一抗最佳反应浓度
采用棋盘法摸索抗原抗体最佳反应浓度． 96 孔酶标板按行包被 100 μL 含有包被抗原的缓冲液，浓
度分别 1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800、1∶25600． 4 ℃过夜，倒出孔内液体，用洗涤液振荡洗
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涤 3 次，每次 3 min，拍干．每孔加封闭液 200 μL，37 ℃温育 2 h，倒出孔内液体，拍干备用．将一抗用抗体
稀释液倍比稀释后，顺序加入，稀释比例分别是 1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400．每孔 100 μL，同时
设阴性和空白对照，37 ℃温育 1 h．洗涤 3 次，拍干． 将 HRP-IgG稀释至 1∶2000，每孔 100 μL，37 ℃温育
1 h，洗涤 5 次，拍干． 每孔加新鲜配制的底物溶液 100 μL，显色 10 min．每孔加终止液 50 μL．在 450 nm
及 630 nm处测定 OD值，实际值为 OD450 － OD630 ．以 P /N值≥2． 1，吸光度在 1． 0 左右时的抗原及一抗浓
度为最佳反应浓度．
1． 3． 2 二抗最佳反应浓度
按 1． 3． 1 所得抗原及一抗最佳反应浓度加入抗原及一抗，IgG-HRP 按 1 ∶1000、1 ∶ 2000、1 ∶ 3000、
1∶4000、1∶5000 的稀释倍数，每种浓度 10 孔．其余步骤同 1． 3． 1．
1． 3． 3 最佳温育条件
在温育温度为 37 ℃、43 ℃下，分别采用仅含 0． 1% BSA，及含 4% PEG和 0． 1% BSA的两种稀释液，
稀释抗体．并按最佳抗原、一抗、二抗的使用浓度分别测定温育时间为 30 min、60 min 及 90 min 时的各
孔 OD值．其余步骤同 1． 3． 1．
1． 3． 4 样品的前处理
取生鲜带壳或冷冻后在室温下半解冻的样品，用刀切开闭壳肌取出贝肉，将可食部分与中肠腺分
离，放在网孔细小的金属网上沥水 5 min．取 5 g样品，加入 10 mL匀浆液，匀浆后，漩涡振荡 1 min，超声
提取 5 min;4000 r·min －1离心 20 min．移出上清液至 25 mL容量瓶，剩余残渣再加入匀浆液 5 mL，重复
提取两次，上清液均移至 25 mL容量瓶内，蒸馏水定容，0． 22 μm滤膜过滤．
1． 3． 5 间接竞争 ELISA法测定
96 孔板包被和封闭同 1． 3． 1，测定时倒出孔内液体，将一抗稀释至最佳使用浓度后，每孔加入
50 μL;将 DA用乙腈-水溶液(乙腈∶水 1∶9)配成 10 μg·mL －1、1 μg·mL －1、500 ng·mL －1、250 ng·mL －1、
100 ng·mL －1、50 ng·mL －1、25 ng·mL －1、10 ng·mL －1系列浓度，每孔加入 50 μL，每块板作空白对照，采用
1. 3． 3 确定的温育条件．洗涤 3 次，拍干．再加入 1． 3． 2 所确定浓度的 IgG-HRP，每孔 100 μL，温育条件
按 1． 3． 3 确定的结果．其余步骤同 1． 3． 1．以 DA标准物质浓度对 OD值或抑制率绘制标准曲线，计算生
物样品的 DA含量．
2 结果与讨论
2． 1 间接竞争 ELISA方法的建立
2． 1． 1 包被抗原及一抗的使用浓度
典型的 IgG分子基本构象呈“Y”型，在结构上可分为 V区(Y型结构的上半部分)和 C区． V区结构
非常柔软、具有高变性，是与抗原进行特异性结合的区域．抗原与抗体具有一定的量比关系，需要摸索出
一个抗原抗体结合的最佳工作浓度，以提高检测方法的灵敏度．
表 1 为采用棋盘法测定的包被抗原 DA-BSA与所制备的抗 DA 抗体反应得到的 OD450 － OD630的吸
光度值．选择 P /N≥2． 1 且吸光度值为 1． 0 左右的包被抗原及一抗浓度作为最佳使用浓度．由表 1 可见，
吸光度在 1． 0 左右的值有 3 组、其抗体的稀释倍数均为 800，抗原的浓度分别为 2． 0、0． 99、
0． 12 μg·mL －1，且 3 组的 P /N值均≥2． 1．包被抗原浓度为 0． 12 μg·mL －1组因为其抗原浓度过低、且空
白值较高，因而不予采用．剩余两组的吸光度值十分接近，考虑到节约抗原的问题，因而采用包被抗原浓
度为 0． 99 μg·mL －1、抗体稀释倍数为 800 分别作为包被抗原及一抗的最佳使用浓度．
2． 1． 2 最佳二抗浓度
本文所用的二抗是辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗兔 IgG，它是是以一抗分子兔 IgG 蛋白的 C 区
为抗原结合表位的抗体分子．将 HRP标记的羊抗兔 IgG 分别稀释 1000、2000、3000、4000 及 5000 倍，测
定其 P /N值．结果如图 1 所示，呈现两头低、中间高的趋势．当二抗浓度达到 1∶3000 时，二抗与一抗的结
合达到一个较好的平衡点，产生的免疫复合物量最多，平均 P /N比值最高，因此选择 1∶3000 作为二抗的
最佳使用浓度．
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表 1 最佳包被抗原及一抗反应浓度的确定(OD450 － OD630)
Table 1 Optimal concentration of coating antigen and antibody
抗原稀释倍数
抗原浓度
/(μg·mL －1)
抗体稀释倍数
400 800 1600 3200 6400
空白
400 15． 8 0． 834 0． 715 0． 387 0． 165 0． 127 0． 037
800 7． 9 1． 014 0． 778 0． 389 0． 183 0． 111 0． 033
1600 3． 9 1． 207 0． 706 0． 36 0． 256 0． 035 0． 092
3200 2． 0 1． 421 1． 034 0． 559 0． 21 0． 163 0． 032
6400 0． 99 1． 652 1． 079 0． 591 0． 356 0． 04 0． 030
12800 0． 49 1． 397 1． 217 0． 662 0． 337 0． 202 0． 025
25600 0． 25 1． 659 0． 377 0． 702 0． 143 0． 196 0． 069
51200 0． 12 1． 344 0． 947 0． 46 0． 291 0． 228 0． 294
图 1 二抗使用浓度与 P /N值变化
Fig． 1 Variation between P /N and concentration of HRP-IgG
2． 1． 3 最佳温育条件
温育是 ELISA操作过程中的关键步骤．最为常见的温育温度有 37 ℃和室温，其次是 43 ℃和 2 ℃—
8 ℃ ． Salonen等根据 PEG 能加速抗原抗体之间的反应，于 1981 年首次提出在 ELISA 方法中，以 4%
PEG加入 PBS稀释液中，从而使试验在 2 h内完成．董军等在试验中的 PBS稀释液中加入 5%的小牛血
清，亦可减少非特异性反应，降低本底，但单价小牛血清，反应需要 1 h 以上才能完成．许执文结合了加
PEG方法使反应时间缩短又可减少非特异性反应，得到了满意的结果［4］．
本文设计了常见的 37 ℃及 43 ℃两个温育温度，温育时间分别是 0． 5 h、1 h、2 h 并考察了在 0． 1%
BSA抗体稀释液及含 4% PEG的 0． 1% BSA抗体稀释液作用下的效果．结果如图 2 所示．
图 2a表明，在同一温度相同温育时间下，采用含 4% PEG 抗体稀释液的板孔 OD 值明显高于采用
仅含 0． 1% BSA稀释液的板孔，可见 PEG的加入使得 OD值得到了显著提高．图 2b表明，相同的温育时
间，PEG的加入可以明显降低孔间的变异系数． PEG 是一种水溶性非离子型聚合物，其亲水性强、对热
稳定，能与蛋白质一起形成共沉物［5-6］． PEG 对抗体的沉淀作用，缩短了孔中抗体与固相抗原的接触时
间，增加了抗体与抗原的接触机率，从而加快了抗原抗体结合，使反应迅速达到平衡状态，固相载体表面
的反应更为均匀．但采用 PEG稀释液的组，阴性 OD值普遍偏高，这可能是由于 PEG这种沉淀作用几乎
没有选择性，而导致非特异性物质一起沉淀增加了本底值． 选择 P /N 值≥2． 1，OD 值大于 0． 8 的反应
组，得到 3 组条件，分别为:37 ℃温育 60 min、含 4% PEG;37 ℃温育90 min、含 4% PEG;43 ℃温育
90 min、0． 1% BSA(43 ℃温育 90 min，含 49% PEG组，P /N ＜ 2． 1 不符合要求)．考虑到缩短检测时间及
阴性样本和空白值不能过高的因素，选择 37 ℃温育 60 min，含 4% PEG 稀释液作为最佳的抗原与一抗
的反应条件．
图 2c、图 2d显示的是温育条件对一抗二抗结合的影响． 与一抗及抗原反应略有不同的是，当反应
时间从 60 min延长至 90 min，OD值呈现出了一个略微下降的现象(如图 2c) ，说明已经稳定结合的抗原
抗体复合物又出现了一部分解离，导致 OD值下降．这可能是由于二抗的效价较高，特异性较好，一抗分
6 期 刘元嫄等:软骨藻酸间接竞争 ELISA检测方法的研究 1195
子又比较大，两者容易形成免疫复合物，因此一抗与二抗的结合十分迅速，易达到平衡．而抗原 DA则为
小分子物质，其与一抗之间的结合力可能较弱，所需的结合时间较长．此外升高温度也并未如一抗及抗
原反应那样 OD值明显升高，不少组别出现了 OD值下降的情况．这也可能是由于两者抗原的性质区别
较大，免疫球蛋白间的结合在 37 ℃的温度下比较稳定的缘故．从图 2d 同样可见，PEG 的加入对降低孔
间变异系数具有非常好的效果．选择 P /N 值≥2． 1，OD 值大于 0． 8 的反应组，得到 4 组条件，分别是:
37 ℃温育 60 min，含 4% PEG;37 ℃温育 90 min，含 4% PEG;43 ℃温育 90 min，含 4% PEG．考虑到缩短
检测时间及阴性和空白值，最后选择一抗与二抗的最优温育条件为 37 ℃温育 60 min，并采用添加了 4%
PEG的抗体稀释液稀释．
图 2 不同温育条件对吸光度及变异系数的影响
(a)不同一抗温育条件对吸光度的影响;(b)不同一抗温育条件对变异系数的影响;
(c)不同二抗温育条件对吸光度的影响;(d)不同二抗温育条件对变异系数的影响
Fig． 2 Effect of different incubation condition on absorbance and coefficient of variation
2． 1． 4 间接竞争 ELISA法的标准曲线
根据之前的条件优化得到包被抗原的最佳使用稀释倍数是 6400 倍，其浓度为 0． 99 μg·mL －1;一抗
的最佳使用稀释倍数为 800 倍;采用稀释 3000 倍的酶标二抗效果较好，P /N值较高．两次温育的最佳温
度均为 37 ℃，时间均为 1 h，并采用含 4% PEG及 0． 1% BSA的稀释液稀释抗体．
DA各浓度标准溶液的测定结果及其抑制率见表 2．将抗原 DA的标准溶液浓度为横坐标，抑制率为
纵坐标拟合得方程:y = 109． 40 － 15． 45x，相关系数 R2为 0． 9682．其半数抑制浓度 IC50为 6． 9 μg·mL
－1 ．
以抑制率为 90%时的浓度作为最低检测限，可得最低检测限约为 18 ng·mL －1 ．
表 2 间接竞争 ELISA法测定不同浓度软骨藻酸的结果
Table 2 The results of different concentration of domoic acid by ic-ELISA determination
DA浓度 /(ng·mL －1) 0 10 25 50 100 250 500 1000 10000
OD值 1． 411 1． 301 1． 241 1． 182 1． 105 1． 099 0． 945 0． 833 0． 678
抑制率 /% 100 92． 20 87． 95 83． 77 78． 31 77． 88 66． 97 59． 04 48． 05
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2． 2 贝类样品中 DA的 ic-ELISA测定
从水产市场上购得 3 种贝类样品，置入匀浆管前加入 100 μg DA标准品．用 1． 3． 5 建立的 ic-ELISA
方法测定贝类样品中 DA的浓度及其加标回收率．其结果见表 3．测定结果表明在所购买的 3 种贝类中
均未检出 DA，加标回收率在 47． 2%—94． 2%之间，RSD在 12． 3%—17． 0%之间．
ELISA方法是利用抗原抗体特异性结合的原理进行检测．对于 DA这种结构简单的小分子半抗原，
其与抗体的结合能力比较差，可能是影响回收率的重要原因．
表 3 间接竞争 ELISA法测定贝类中的 DA含量(n = 3)
Table 3 Concentration and recovery of domoic acid measured by ic-ELISA (n = 3)
未加标 DA浓度 /(ng·mL －1) 加标 DA浓度 /(ng·mL －1) 加标回收率 /% RSD /%
红心贝 未检出 37． 7 ± 5． 4 94． 2 14． 3
扇贝 未检出 19． 9 ± 3． 4 49． 6 17． 0
文蛤 未检出 18． 9 ± 2． 3 47． 2 12． 3
3 结论
本文采用自制的 DA多抗抗体，优化了抗原、一抗、二抗的使用浓度和温育条件:包被抗原的最佳使
用稀释倍数是 6400 倍，其浓度为 0． 99 μg·mL －1;一抗的最佳使用稀释倍数为 800 倍;二抗的最佳稀释
倍数为 3000 倍．两次温育的最佳温度均为 37 ℃，时间均为 1 h，并采用含 4% PEG 及 0． 1% BSA 的稀释
液稀释抗体．采用以上条件建立的间接竞争 ELISA 法检测 DA，最低检测限约为 18 ng·mL －1 ．利用该法
检测贝类样品中 DA的含量，测得加标回收率在 47． 2%—94． 2%之间，RSD在 12． 3%—17． 0%之间．
参 考 文 献
［1］ Lefebvre K A，Robertson A． Domoic acid and human exposure risks:A review［J］． Toxicon，2010，56(2) :218-230
［2］ 吴多加，李凤琴． 软骨藻酸与人类健康关系研究进展［J］． 卫生研究，2005，34 (3) :378-381
［3］ Jeffery B，Barlow T，Moizer K，et al． Amnesic shellfish poison［J］． Food and Chemical Toxicology，2004，42 (4) :545-557
［4］ 焦奎，张书圣． 酶联免疫分析技术及应用［M］． 北京:化学工业出版社，2004
［5］ 杨永青，江一民，刘文． 聚乙二醇分离血浆中循环免疫复合物的几种放射分析法［J］． 国外医学(放射医学分册) ，1983，(3) :178-
181
［6］ 李璐，顾光煜． 聚乙二醇及其衍生物在检验医学中的应用［J］． 临床检验杂志，2008，26 (6) :469-471
STUDY ON DETECTION METHOD OF INDIRECT-COMPETITIVE
ELISA FOR DOMOIC ACID
LIU Yuanyuan GAO Lili CHENG Jinping WANG Qian WANG Wenhua
(School of Environmental Science and Engineering，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai，200240，China)
ABSTRACT
An indirect-competitive enzyme-linked immunosorbent assay was established，using a self-prepared
polyclonal antibody against domoic，for daily analysis of sea food． The working concentration of artificial
antigen，antibody and HRP-IgG were measured． Best incubation condition，including temperature and time，
was decided and several shellfish were detected． The results showed detection limit was about 18 ng·mL －1 ．
Adding standard recovery ranged from 47． 2% to 94． 2% and RSD ranged from 12． 3% to 17． 0% ． All results
of three kinds of shellfish showed negative．
Keywords:domoic acid，indirect competitive ELISA，polyclonal antibody HPLC．