全 文 ：＊基金项目:山东省卫生厅资助项目(2001CAICBA5)
　作者单位:1.青岛大学医学院附属医院营养科 , 青岛 266003;2.
青岛大学医学院;3.中国科学院海洋研究所生物工程
中心
　作者简介:贺娟(1970-),女,山东青岛人 ,主治医师 , 硕士 ,研究方
向:医学营养学。
　通讯作者:粱惠
文章编号:1001-0580(2005)09-1082-02　　中图分类号:R 151　　文献标识码:A 【论　　著】
凹顶藻提取物的抗氧化作用＊
贺娟1 ,梁惠2 ,史大永3 ,董春景2 ,张秀珍2
　　摘　要:目的　观察凹顶藻提取物(LET)对 DNA 损伤和机体抗氧化能力的影响。方法　对小鼠补充不同剂量
凹顶藻提取物(LET), 采用标准化方法制备 LET ,以反相高效液相色谱法测定总萜含量 ,并采用 Horn 法检测其半数致
死量(LD50)。以体内实验进行提取物的抗氧化活性评价 ,采用单细胞凝胶电泳法测定淋巴细胞的 DNA 损伤 ,以试剂
盒测定血浆中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量 , 应用 SPSS 11.5 软件进行数据处理。结果　LET 中的总
萜含量为 63.29%。其 LD50>3 160 mg/kg , 属于低毒。 LET 中剂量组的血淋巴细胞 DNA 损伤与高剂量组和空白对
照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。 LET 各剂量组小鼠血中 MDA 的含量与空白对照组比较均降低 , 差异有统
计学意义(P<0.05)。结论　LET 含有丰富的天然萜类化合物 , 且使用安全;中剂量 LET 对 H2O2 诱导的血淋巴细胞
DNA 氧化损伤有明显的保护作用;LET 可降低血中 MDA 含量 ,有一定的抗脂质过氧化作用。
关键词:凹顶藻;萜;DNA损伤;超氧化物歧化酶(SOD);丙二醛(MDA)
Ef fects of Laurencia extract on antioxidant activities in mice　HE Juan , LIANG Hui , SHI Dayong , et al.Af f iliated Hos-
pital of Medical College , Qingdao University(Qingdao 266003 , China)
Abstract:Objective　The antio xidant activities of various dosages of Laurencia extract(LET)w ere investigated in
mice.Methods　The to tal content of terpenoids in the LET was detected by High Performance Liquid Chroma tog raphy
(HPLC)and its mediallethaldose(LD50)w as estimated by Horn assay.The antio xidant activities of LET were de tected in
mice.The oxidative DNA damage of peripheral lymphocy tes induced by H2O2 was analyzed by SCGE.The concentrations of
supero xide dismutase(SOD),malony l dialehyde(MDA)in plasma w ere detected with test kit.Da ta w ere analzyed by SPSS
software.Results　The concentration of total terpenodis in the LET was pro ved to be 63.29%.The LET show ed low to xici-
ty w ith its LD50 more than 3 160 mg/kg.There was a significant decreasing tendency of the oxidative DNA damage on pe-
ripheral lymphocytes in the 50 mg/ kg supplement g roup induced by 10μmol/ L H2O2.The levels of MDA in the supplement
groups were less than those of the control group.Conclusion　The LET rich in terpenoids is safety to be taken o rally.The 50
mg/kg LET can protect the peripheral lymphocy tes from oxidative DNA damage induced by H2O2.The LET has anti-lipid
peroxidation activity.
Key words:Laurencia ;terpenoid;DNA damage;SOD;MDA
　　自 20 世纪 60年代 ,国际上提出“向海洋要药物”的口号
以来 , 人们越来越多的将目光投到占地球 70%海洋资源中 ,
海洋生物在漫长的生物演化过程中 ,产生并蓄积了大量结构
独特 、生物活性各异的次生代谢产物 , 包括萜类 、大环内酯类 、
多肽等近 200多个特殊结构。萜类是广泛分布于海洋生物中
的一大类有机化合物 ,主要存在于红藻凹顶藻属的各种类中 ,
主要表现细胞毒性和抗菌活性 , 而对其体内抗氧化活性的国
内外报道较少。本文从采自中国南海的三列凹顶藻(Lauren-
cia tristicha Tseng)中得到含丰富萜类化合物的提取物 , 并应
用分子生物学及动物实验的方法 , 探讨此类化合物的毒性和
抗氧化活性 ,进一步从分子水平上研究其生物学作用机制 ,寻
找具有高度生物活性的新的海洋药物。
1　材料与方法
1.1　材料　
1.1.1　三列凹顶藻(Laurencia tristicha Tseng , Chang EZ.et
BM Xia)属红藻门(Rhodophyta)红藻纲(R hodophyceae), 仙菜
目(Ceramiales), 仙菜科(Cermiacease), 凹顶藻属(Laurenci-
a), 2003 年 4 月采自广东省湛江市硇洲岛附近海域 , 由中国
科学院研究所邵魁双博士鉴定。
1.1.2　实验动物　青岛市实验动物中心提供昆明种小鼠, 动
物合格证号:鲁动质字 D2002009 号 ,雌雄各半 ,体重 18～ 23 g。
1.1.3　动物喂养　40 只昆明小鼠购进后适应性喂养 1 周 ,
随机分为 4组 , 10 只/组 , 雌雄各半。分别给予凹顶藻提取物
25(低剂量组), 50(中剂量组), 100 mg/kg(高剂量组)灌胃 , 灌
胃容积为 0.2 ml , 另设空白对照组 ,给予等量的花生油灌胃 ,
每日 1 次, 实验期为 20 d ,末次给药 24 h后眼眶取血处死动物。
1.2　凹顶藻提取物(LET)的制备　凹顶藻干品约 5 kg , 粉碎
过筛;95%乙醇提取 3 次 , 合并得浸膏 325 g;用约 10 倍量的
水混悬浸膏 , 乙酸乙酯萃取;减压蒸干得棕黑色稠膏 105 g , 以
市售花生油溶解。
1.3　凹顶藻提取物中总萜含量的测定〔1 ～ 3〕　
1.3.1　仪器与试剂　反相高效液相色谱(HPLC)仪(Beck-
man公司)、配二极管阵列检测器 、用 Gold 软件控制仪器操作
数据采集(Beckman 仪器公司提供), Terpinoel 标准品购自
Sigma公司 , 甲醇为优级纯 ,去离子水。
1.3.2　色谱条件　色谱柱为 Beckman C18柱(25 cm×4.6 mm ,
5μm)和Beckman 预保护柱(4.5 cm×4.6 mm , 5μm)。流动相为
甲醇:水=55∶45 ,流速为 1.0 ml/ min ,检测波长为 242 nm ,检测
1082 中国公共卫生 2005年 9月第 21卷第 9期　　Chin J Public Health S ep 2005 Vol.21 No.9
灵敏度为 0.05AUFS。应用外标法进行定量检测。
1.3.3　样品处理　准确称取凹顶藻提取物 0.775 g , 置于 5
ml容量瓶中 , 甲醇定容 , 4 ℃、3 000 r/min 离心 5 min , 取上清
液进入 HPLC 分析。
1.3.4　总萜含量　根据 Terpinoel标准品定性定量测得凹顶
藻提取物中总萜含量 63.29%。
1.4　半数致死量(LD50)的测定(Horn 法)〔4〕　20 只昆明小
鼠 ,随机分为 4 组 , 适应性饲养 3 d;第 4 d 给药前禁食 16 h ,饮
水不限 ,分别以 3 160 , 1 000 , 316 及 100 mg/kg 剂量灌胃 , 观
察 14 d , 记录出现症状及死亡情况。
1.5　DNA 损伤检测　
1.5.1　试剂　正常熔点琼脂糖 、低熔点琼脂糖 、RPM I-
1 640由 GibicoBRL 公司提供 , 二眯基二苯基吲哚由 Boehringer
Mannheim公司提供。 Tris 由 Amresco公司提供;小牛血清由
Gibico公司提供 ,淋巴细胞分离液由爱普生物技术公司提供, 乙
二胺四乙酸 ,磷酸二氢钠等为国产AR级试剂。
1.5.2　仪器　低温离心机(德国 Sigma 3K30 型), 低温冰箱 ,
电泳仪 , 制冰机(英国 IM20K 型), 荧光显微镜(日本 OLYM-
PAS BH-2 型)。
1.5.3　实验方法　采用单细胞琼脂糖凝胶电泳(SCGE)技
术〔5〕。参照 Co lins〔6〕等的方法 , 取新鲜抗凝血 35μl加入盛有
1 640 和 10%小牛血清的离心管中 , 0 ℃培养 30 min ,取淋巴
细胞分离液 100μl加到该离心管的最低层 ,离心 , 取淋巴细胞
层移入磷酸缓冲液中 ,分别加入 5 , 10 , 20μmo l/ L H2O2 处理 5
min , 离心 ,去上清放入冰水浴中备用。取 1%融化的标准琼
脂糖85μl滴在载玻片上 , 4 ℃冰箱放置 5 ～ 10 min ,取 1%融化
的低熔点琼脂糖 85μl和上述淋巴细胞混匀滴在第一层琼脂
薄板上 ,放入溶解液中处理 60 min 后 , 4 ℃电泳 30 min , 中和
液中和 ,二脒基二苯基吲哚染色 , 荧光显微镜下观察。每种处
理观察 100 个细胞 ,计算其损伤单位。
1.6　血清脂质过氧化指标测定　超氧化物歧化酶(SOD)采
用羟胺法;丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸法。测试盒均由
南京建成生物工程所提供。
2　结　果
2.1　LD50实验结果　凹顶藻提取物组经 14 d 观察未见任何
中毒症状 ,无动物死亡。其 LD50>3 160 mg/kg , 属低毒。
2.2　DNA 氧化损伤(表 1)　
表 1　凹顶藻提取物不同剂量组
淋巴细胞 DNA损伤( x ±s , μmol/ L)
分 　组 n
H2O2
0 5 10 20
低剂量组 9 121.4±38.3 255.7±34.8 323.9±16.1 379.9±7.8
中剂量组 9 117.6±35.0 233.9±39.8 285.5±30.3＊ 377.7±8.7
高剂量组 7 129.5±24.6 286.8±28.2 346.4±14.6 386.8±3.8
空白对照组 8 160.6±23.8 305.0±28.0 332.1±10.1 379.6±3.8
　　注:与空白对照组比较 , ＊P<0.05
　　由表 1可见 , 凹顶藻提取物各剂量组的血淋巴细胞 DNA
自发性损伤差异无统计学意义(P >0.05)。 10 μmol/ LH2O2
处理后凹顶藻提取物中剂量组的血淋巴细胞 DNA 损伤与空
白对照组比较差异有统计学意义(P <0.05), 说明中剂量凹
顶藻提取物抗 H2O 2 氧化损伤的能力较二者强 , 对淋巴细胞
DNA的损伤较小。
2.3　凹顶藻提取物各剂量组血浆中 SOD、M DA 含量(表 2)
表 2　凹顶藻提取物各剂量组血浆中 SOD、MDA含量( x±s)
分　组 n SOD(UN/ml) MDA(nmol/ml)
低剂量组 9 204.44±17.88 3.09±0.90＊
中剂量组 9 213.94±15.73 6.15±0.95＊
高剂量组 7 238.65±26.58 7.06±2.54＊
空白对照组 8 238.52±19.60 11.97±1.20
　　注:与空白对照组比较 , ＊P<0.05
　　由表 2 可见 , 凹顶藻提取物各剂量组小鼠血浆中 MDA
的含量较空白对照组均显著降低 ,且差异有统计学意义(P <
0.05)。凹顶藻提取物各剂量组小鼠血浆中的 SOD含量与空
白对照组比较 , 差异无统计学意义(P>0.05)。
3　讨　论
本实验表明, 实验剂量范围内凹顶藻提取物不会引起小鼠
血淋巴细胞的自发性损伤, 且中剂量凹顶藻提取物具有较强的
抗 H2O2 氧化损伤的能力。其作用机制可能与其所含萜类化合
物的结构特点有关 ,萜类是一类具有异戊二烯骨架的化合物 ,
含丰富的烯键 ,化学性质活泼, 易发生加成反应, 具有较强的还
原性 ,能有效地与强氧化剂起反应 ,保护细胞膜和线粒体膜中
的不饱和脂肪酸不被氧化, 从而维持膜的完整性和功能。
本实验表明 , 凹顶藻提取物可增强体内的抗氧化能力 , 使
自由基对脂质的氧化作用减弱。脂质过氧化反应最容易发生
在细胞膜上 , 凹顶藻提取物为脂溶性 , 容易进入细胞膜 ,且总
萜含量达 63.29%,含大量活泼的烯键 , 因此可降低细胞膜上
的脂质过氧化反应。
凹顶藻是天然萜类化合物的丰富来源 , 且在山东半岛海
域分布广 , 数量大 ,本室前期工作表明 , 凹顶藻提取物具有良
好的抑瘤和抑菌作用 , 因此具有很大开发潜力。
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收稿日期:2004-12-23 (宋艳萍编辑　孔繁学校对)
1083中国公共卫生 2005年 9月第 21卷第 9期　　Chin J Publ ic Health Sep 2005 Vol.21 No.9