全 文 ：应用与环境生物学报　2002, 8(1):66～ 70 　 　
Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X 　 2002-02-25
　
脆江蓠凝集素的部分性质及细胞凝集作用＊
郑 　怡1 　余　萍2　刘艳如1
(福建师范大学 1 生物工程学院;2 高分子研究所　福州　350007)
摘　要　脆江蓠藻体的磷酸盐缓冲液浸提液 ,经硫酸铵分级沉淀 , 再经 DEAE-Sepharose和 Sephadex G-100 层析纯化 ,
得到脆江蓠凝集素(GBL).经测定该凝集素是一种分子量为 33.1×103～ 33.8×103的糖蛋白 , 分子中含有 11%的中性
糖 ,具有很高的耐热性.GBL的凝血活性可被某些单糖或双糖及卵粘蛋白抑制 , 当浓度为 2.34 μg/ mL时引起兔红细胞
凝集 ,浓度为 18.75 μg/mL时凝集绵羊红细胞 , 但对鸡 、鸭 、鸽子红细胞及人 A、O、或 B 型血细胞没有凝集作用.GBL能
够凝集两种单细胞藻类 , 当浓度为 18.75 μg/mL时能凝集盐生杜氏藻 , 但藻细胞密度减少到 18.3×104/mL时不能发生
凝集作用;GBL浓度为 9.37 μg/mL时引起蛋白核小球藻凝集 , 但当藻细胞密度减少到 28.9×104/ mL也不产生凝集反
应.GBL还能够凝集正常的枯草芽孢杆菌和经过热处理的酿酒酵母细胞.图 3 表 6 参14
关键词　脆江蓠;凝集素;细胞凝集作用
CLC　Q949.29 :Q513.2
PARTIAL PROPERTIES AND CELL AGGLUTINATION
OF GRACILARIA BURSA -PASTORIS LECTIN＊
ZHENG Yi1 , YU Ping2 &LIU Yanru1
(1Bioengineering College and 2Institute of Polymer Sciences , Fujian Teachers University , Fuzhou　350007 , China)
Abstract　The thallus of Gracilaria bursa-pastoris was extracted with PBS and then isolated by fractionation with
(NH4)2SO4.The purification of crude lectin was carried out by DEAE-Sepharose ion exchange , followed by
Sephadex G-100 filtration.This purified lectin(GBL)is a glycoprotein with a relative molecular weight of 33 100
～ 33 800 , containing 11%neutral saccharide.Its agglutinating activity was found to be tolerant of high tempera-
ture , but inhibited by the presence of some mono- or bisaccharides and ovalbumin.GBL could agglutinate rabbit
erythrocytes at 2.34μg/mL and sheep erythrocytes at 18.75μg/mL , respectively , but had no agglutinating activ-
ities for erythrocytes from chicken , duck , pigeon and human A , B and O blood cell groups.Furthermore , GBL
agglutinated two species of unicellular algae , Dunaliella salina and Chlorella pyrenoidosa , but these agglutina-
tions did not happen if the cell numbers of D.salina were decreased to 9.2×104/mL and C.pyrenoidosa to 18.
3×104/mL.GBL also agglutinated natural cells of Bacillus subtilis and Saccharomyces cerevisiae treated by heat-
ing.Fig 3 , Tab 6 , Ref 14
Keywords　Gracilaria bursa-pastoris;lectin;cell agglutination
CLC　Q949.29 :Q513.2
　　凝集素具有独特的生化性质和生物学功能 ,在医
学和生物学研究上有着广泛的用途.植物凝集素的研
究主要集中在种子植物 ,尤其是豆科植物 ,而低等的
藻类植物凝集素则很少被注意和研究[ 1] .近年来 ,随
着人们对海洋生物活性物质研究的极大关注和兴趣 ,
收稿日期:2001-06-29　　接受日期:2001-08-26
＊福建省科技厅及省自然科学基金资助项目　Supported by the Fujian
Science and Technology Department and the Provincial Natural Science Foun-
dation of Fujian
＊＊通讯作者　Corresponding author
海藻凝集素的研究有了一些新的进展[ 2] .通过研究发
现海藻凝集素的某些性质和生物学功能不同于陆生
植物凝集素 , 有的在开发应用上有重要价值.我国海
藻资源丰富 ,人工养殖的海藻品种和产量不断增加 ,
但目前国内未见有关海藻凝集素性质的研究 ,仅有部
分地区海藻凝集素筛选的报道[ 3] .
江蓠是一种重要的经济和药用海藻 ,我国沿海均
有分布.由于其藻体含胶量高 ,是目前制造琼胶的主
要原料 , 近年来沿海江蓠养殖发展迅速.脆江蓠
Gracilaria bursa-pastoris (Gmel.)Silva 是我国人工栽
培的主要种类之一.本文报道了从该海藻中分离纯化
的凝集素的部分性质及其细胞凝集作用.
1　材料与方法
1.1　材料与试剂
藻体于 2000 年 5 月采自福建省平潭岛.经鉴
定[ 4]为红藻门(Rhodophyta)的脆江蓠 Gracilaria bursa-
pastoris (Gmel.)Silva.DEAE-Sepharose (fast flow)、
Sephadex G-100 为 Pharmacia 产品;丙烯酰胺 、亚甲基
双丙烯酰胺为Sigma产品;N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、
岩藻糖(L-FUC)、十二烷基磺酸钠(SDS)及牛血清白蛋
白(BSA)为Fluka-Garantie 产品;分子量标准蛋白及其
他糖类为国产试剂 ,糖蛋白由四川大学曾仲奎教授提
供 ,新西兰大白兔购自福建省药品检验所 ,绵羊血取
自南京军区福州总医院 ,人血由本校医院提供.海洋
和淡水单细胞类分别引自中国科学院海洋研究所和
水生生物研究所藻种库.细菌和酵母菌种来自本校生
物工程学院.
1.2　实验方法
1.2.1　脆江蓠凝集素的提取和纯化　　新鲜藻体用
蒸馏水洗净后剪碎 ,加磷酸盐缓冲液(PBS ,0.01 mol/
L , pH 7.2 ,内含NaCl 0.14 mol/L)4 ℃下浸泡 12 h后 ,
经高速组织捣碎机捣碎 , 4 ℃下继续浸泡 2 h 后 ,用
300目的筛绢拧干过滤 ,滤液经 5 000 r/min , 4 ℃离
心30 min , 弃沉淀 , 收集上清液 ,加固体硫酸铵达
25%饱和度 ,4 ℃放置 12 h ,离心收集同前 ,再向上清
液中加入硫酸铵达 75%饱和度 ,离心同前 ,收集沉淀
物 ,加 PBS溶解 ,透析除盐后 ,检测凝血活性 ,得到凝
集素粗制品 ,4 ℃保存.
凝集素粗品经 DEAE-Sepharose (fast flow)离子交
换层析(1.6 cm×30 cm),用PBS液洗脱 ,收集活性峰部
分 ,再经Sephadex G-100分子筛层析(1.6 cm×70 cm)洗
脱 、分部收集活性峰部分 ,经风干浓缩 ,获得纯化样品 ,
蛋白质浓度测定采用 CBB-G250法.纯化样品用不连续
聚丙烯酰胺凝脉电泳[ 5](PAGE)测定纯度.
1.2.2　脆江蓠凝集素部分性质的测定　　分子量测
定采用分子筛层析(规格同上),以标准蛋白(牛血清
白蛋白 、卵清蛋白 、碳酸酐酶及核糖核酸酶)的分子量
对Kav(有效分配系数)作图制作标准曲线 ,测定GBL
的分子量;亚基分子量采用 SDS-PAGE(十二烷基磺酸
钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)方法测定[ 5] ;糖和糖蛋白
抑制实验按文献[ 6]方法测定;糖含量测定采用酚-硫
酸法[ 7] ;氨基酸组成分析采用日立 835-50型氨基酸自
动分析仪测定;热稳定性实验按文献[ 8]方法.
1.2.3　红细胞凝集实验　　不同血样(表 3)经离心
收集红细胞 ,加生理盐水离心洗涤 2次 ,以生理盐水
制成 2%压积红细胞悬液用于凝血活性测定 ,测定方
法按文献[ 6]在 V型血凝板上进行.以不加样品作为空
白对照(CK),1 h后镜检结果.
1.2.4　藻细胞凝集实验　　6种实验的单细胞藻类
(表 4)在温度 θ20 ～ 25 ℃,光强 E 3 000 lx ,光暗周期
12 h 12 h条件下培养.取培养 6 d 后的每种藻类培
养物10 mL ,经离心收集藻细胞 ,海产种类加入消毒海
水 ,淡水种类加入蒸馏水 ,离心洗涤 2次 ,最后制备成
藻细胞悬液 ,用浮游生物计数框计数.凝集实验同上 ,
1 h 后显微镜下观察结果.
1.2.5　细菌凝集实验　　实验的细菌(2种)和酵母
菌(1种)采用牛肉膏蛋白胨培养基经继代培养活化 ,
配置成相应的活菌悬液 ,另取一部分菌悬液经 80 ℃
热处理 1 h ,分别以正常菌和热处理过的菌悬液在 V
型血凝板上采用上述同样方法测定凝集活性 ,以上用
具均经灭菌消毒.显微镜或油镜下观察结果.
2　实验结果
2.1　脆江蓠凝集素的提取和纯化
脆江蓠藻体的 PBS浸提液经硫酸铵分级沉淀得
到的凝集素粗品 ,经过 DEAE-Sepharose 离子交换层
析和 Sephadex G-100 分子筛层析二步纯化 ,获得经不
连续聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测呈单一蛋白带
的脆江蓠凝集素(GBL)纯化样品(图 2b),该样品用于
性质测定和细胞凝集实验.
2..2　脆江蓠凝集素的部分性质
2.2.1　分子量和亚基分子量　　GBL 在SDS-PAGE
图谱上显示一条蛋白色带 ,通过与标准蛋白的相对迁
移率(R f)比较(图 1 ,图 2c , d),得出其亚基分子量为
33 800 ,而分子筛层析测得的分子量为33 100.
2.2.2　GBL 糖含量　　经酚-硫酸法测得 GBL 分子
含有 11%的中性糖 ,表明 GBL是一种糖蛋白.
2.2.3　GBL 氨基酸组成　　测定结果(表 1)表明 ,
GBL 分子中苯丙氨酸(Phe)含量最高 ,蛋氨酸(Met)含
量次之 ,而精氨酸(Arg)和赖氨酸(Lys)含量明显高于
天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu).
2.2.4　糖和糖蛋白的抑制作用　　结果(表 2)表明 ,
在 12种糖类中 ,有 5种单糖或双糖对GBL 的凝血活性
具有抑制作用 ,其中 Ara 和 Mal的抑制作用较强 ,而
Glc、Lac及Xyl的抑制作用较弱 ,其它 7种糖类均无抑
制作用.3种糖蛋白中只有卵粘蛋白具有抑制作用.
67　1期 郑　怡等:脆江蓠凝集素的部分性质及细胞凝集作用响 　　
图 1　SDS-PAGE测定脆江蓠凝集素的亚基分子量
Fig 1　Determination of molecular weight of the subunits of GBL
蛋白质分子量(Mr / 103):a.磷酸化酶 B(97.4);b.牛血清白蛋白(67.
0);c.肌动蛋白(43.0);d.碳酸酐酶(31.0);e.胰蛋白酶抑制剂(20.
1);f.鸡蛋清溶菌酶(14.4);g.脆江蓠凝集素(33.8).
Molecular weight of the subunits of proteins(Mr / 103):a.Phosphorylase(97.
4);b.B.S.A.(67.0);c.Actin(43.0);d.Carbonic anhydrase(31.0);e.
Trypsin inhibitor(20.1);f.Egg white lysozyme (14.4);g.Gracilaria bursa
-pastoris lectin(33.8).
图 2　脆江蓠凝集素的聚丙烯酰胺凝胶电泳
Fig 2　Polyacrylamide gel electrophoreses
of Gracilaria bursa-pastoris lectin
a , b.不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳;c , d.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳.
a.粗品;b , c.纯化的GBL;d.标准蛋白
a , b.for PAGE;c , d.for SDS-PAGE.a.Crude GBL;b , c.Purified GBL;
d.Standard protein.
表 1　脆江蓠凝集素(GBL)的氨基酸组成
Tab 1　Amino acid composition of Gracilaria
bursa-pastoris lectin(ρ/μg mL)
氨基酸种类
Amino acid
含量
Content
氨基酸种类
Amino acid
含量
Content
氨基酸种类
Amino acid
含量
Content
Asp 8.75 Cys 27.92 Phe 45.72
Thr 5.27 Val 11.16 Lys 12.30
Ser 5.89 Met 41.99 His 0.00
Glu 8.07 Iie 10.05 Try -
Gly 4.99 Leu 7.55 Arg 35.00
Ala 7.18 Tyr 0.00 Pro 0.00
2.2.5　GBL 的热稳定性　　实验表明 ,GBL 的凝血
活性在40 ～ 60 ℃范围内仍保持原有的活性 ,当处理
温度升高至80 ℃时 ,凝血活性有所降低 ,温度超过90
℃时 ,GBL的凝血活性才完全丧失.
2.3　GBL凝集红细胞活性
实验结果(表 3)表明 ,GBL 引起兔和绵羊血红细
胞凝集的 ρmin分别为 2.34μg /mL 和18.75μg /mL ,因
此对兔红细胞的凝集活性大于绵羊血红细胞.GBL 对
鸡 、鸭 、鸽子红细胞及人 A 、O或 B 型血红细胞没有凝
集作用(ρmax 300 μg /mL).
2.4　GBL对单细胞藻类的凝集作用
实验结果见表 4 , GBL 能够凝集盐生杜氏藻
Dunaliella salina(图 3A)和蛋白核小球藻 Chlorella
pyrenoidosa(图 3B),引起凝集的 ρmin分别为 18.75μg /
mL和 9.73μg /mL ,对其他 4种单细胞藻没有凝集活
性.GBL 对藻细胞的凝集活性与细胞密度有关 , 随着
藻细胞密度的减少 ,GBL 的凝集活性也随之降低 ,当
蛋白核小球藻细胞密度 n 减少至 28.9×104mL-1 ,盐
生杜氏藻减少至 18.3×104 mL-1时 ,在 GBL 浓度为
ρmin300 μg / mL时也不能引起藻细胞凝集(表 5).
2.5　GBL对细菌和酵母菌的凝集作用
结果表明(表 6), 不同状态的细菌和酵母菌对
GBL的反应不同 ,GBL 能够凝集正常的枯草芽孢杆
菌 ,但不能凝集经高温处理后的杆菌.相反 ,GBL能凝
集经高温处理的酿酒酵母细胞而不能凝集正常的酵
母细胞.
3　讨 论
海藻凝集素的研究近十年来尽管已取得了一些
进展 ,但对它们理化性质 、生物学功能的了解及实际
应用还远不如其他陆生植物(种子植物)凝集素.本实
验对分离纯化的脆江蓠凝集素(GBL)部分性质的研
究结果表明 ,GBL是一种较低分子量(33.1×103 ～ 33.
8×103)和单个亚基的糖蛋白 ,这与多数海藻凝集素
具有较低分子量的特征相符[ 9] .在 3种糖蛋白中 ,只
有卵粘蛋白可抑制GBL的凝血活性 ,表明卵粘蛋白上
有被 GBL 识别的糖链 , 采用亲和柱纯化时可与
Sepharose偶联.
凝集素与糖专一性结合是其最基本 、最重要的特
性.GBL的凝血活性可被单糖所抑制 ,这是 GBL 不同
与其他海藻凝集素的一个重要特征.因为多数海藻凝
集素的凝集活性不被单糖抑制 ,这一特性曾被认为是
海藻凝集素的共同特性而区别与其他陆生植物凝集
素[ 9] .但 Rogers等[ 10](1990)报道了 2种红藻凝集素可
与单糖(Fuc 和 Gal)专一性结合 ,以后 Alvarez-Her-
nandez等[ 8] (1999)又报道了 1 种海产绿藻凝集素
的凝血活性可被单糖衍生物(GlcNAc和GalNAc)抑
68 　　　　　　　　应 用 与环 境生 物学 报　　Chin J Appl Environ Biol　　　　　　　　　　　　　　 　　　8卷
表 3　脆江蓠凝集素(GBL)对不同红细胞的凝集作用
Tab 3　Agglutination of various erythrocytes by Gracilaria bursa-pastoris lectin
动物红细胞　Animal erythrocyte
兔 Rabbit 绵羊 Sheep 鸡 Chicken 鸭 Duck 鸽 Pigeon
人红细胞　Human blood cell
A O B
ρmin(GBL)/μg mL-1 2.34 18.75 - - - - - -
图 3　脆江蓠凝集素对两种单细胞藻类的凝集作用
Fig 3　Agglutination of two species of unicellular algae by Gracilaria bursa-pastoris lectin
A.盐生杜氏藻(×80);B.蛋白核小球藻(×180)　A.Dunaliella salina(×80);B.Chlorella pyrenoidosa(×180)
表 4　脆江蓠凝集素(GBL)对单细胞藻类的凝集作用
Tab 4　Agglutination of unicellular algae by Gracilaria bursa -pastoris lectin
藻　种
Alga species
细胞密度
Cell density (n/ 104mL -1) ρmin(GBL)/μg mL
-1
金藻门　Chrysophyta
　　球等鞭金藻■ Isochrysis galbana 230.5 -
　　绿色巴夫藻■Pavlova viridis 195.8 -
绿藻门　Chlorophyta
　　蛋白核小球藻 Chlorella pyrenoidosa 115.6 9.37
　　盐生杜氏藻■Dunaliella salina 63.4 18.75
　　雨生红球藻 Haemetococcus pluvialis 18.6 -
　　亚心形扁藻■Platymonas subcordiformis 21.3 -
　　　　　　■海产藻类 Marine species.
69　1期 郑　怡等:脆江蓠凝集素的部分性质及细胞凝集作用响 　　
表 5　脆江蓠凝集素(GBL)对不同密度单细胞藻类的凝集作用
Tab 5　Agglutination of unicellular algae with different cell densities by Gracilaria bursa -pastoris lectin
蛋白核小球藻
Chlorella pyrenoidosa
盐生杜氏藻
Dunaliella salina
n(cell)/ 104mL-1 115.6 57.8 28.9 14.4 7.2 3.6 1.8 73.4 36.7 18.3 9.2 4.6 2.3 1.2
ρmin(GBL)/μg mL-1 9.37 18.74 - - - - - 18.75 37.5 - - - - -
表 6　脆江蓠凝集素(GBL)对细菌和酵母菌的凝集作用
Tab 6　Agglutination of bacteria and yeast by
Gracilaria bursa-pastoris lectin
大肠杆菌
Escherichia coli
N T
枯草杆菌
Bacillus subtilis
N T
酿酒酵母
Saccharomyces cerevisiae
N T
- - + - - +
　 N:活菌 Natural bacteria;
　 T:热处理后的菌 Heat-treated bacteria and yeast.
制.从上述的研究和本文的结果来看 ,少数海藻凝集
素与陆生植物凝集素一样可与某些单糖专一性结合.
GBL的另一显著特性是具有相当高的耐热性 ,可
能与其特殊的化学组成和较高的糖含量有关 ,海藻凝
集素的这种耐高温性在文献中也有报道[ 8] ,有的实验
甚至发现海藻凝集素在 100 ℃处理 30 min 也不失
活[ 11 , 12] .
细胞凝集是凝集素众多生物学功能中最基本和
研究最多的功能之一 ,是凝集素与细胞相互作用中最
易被观察到的一种现象.凝集素除了能凝集红细胞
外 ,还能凝集其他类型的细胞如淋巴细胞 、肿瘤细胞
及细菌等[ 1] .有关海藻凝集素的细胞凝集作用报道最
多的是对红细胞的凝集活性 ,对其他类型细胞的凝集
作用的研究甚少[ 13] .Hori等[ 14](1996)首次报道了几种
陆生植物和海藻凝集素对某些海洋微藻的凝集作用 ,
在本实验的藻细胞凝集实验中 ,选用了海洋和淡水的
单细胞藻类 ,结果表明 GBL不仅能够凝集海洋单细胞
藻类 ,而且还能凝集淡水单细胞藻类.Hori和本研究的
结果证实了植物凝集素对海产或淡水单细胞藻类细
胞都具有凝集活性.本实验还证实了这种凝集活性与
藻细胞密度有关.这些研究将有助于将植物凝集素应
用于微藻研究 ,如种类鉴定 、细胞表面特征及细胞之
间的相互作用和识别等.在本实验中 ,GBL 还能凝集
细菌或酵母菌 ,但正常的与经过热处理的菌体细胞呈
现不同的结果 ,提示了不同状态下细胞表面的凝集素
受体发生了变化.
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