全 文 ：书云南大学学报(自然科学版)，2016，38(4):638～ 644 DOI:10．7540 / j．ynu．20150644
Journal of Yunnan University
茸毛木蓝根总黄酮的提取工艺及其体外抗氧化作用研究
*
王小果1，张汝国1，王 明2，司高飞3
(1．黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558000;2．黔南州外侨台港服务中心，贵州 都匀 558000;
3．黔南州民族医药研究协会，贵州 都匀 558000)
摘要:通过正交试验，对溶剂法提取茸毛木蓝根总黄酮化合物的工艺进行了优化研究．结果表明，各因素对
总黄酮提取率的影响程度依次为:乙醇体积分数＞提取温度＞提取次数＞料液比．最佳提取工艺条件分别为乙醇
体积分数为 60%、提取温度为 90 ℃、料液比为 1 ∶ 30、提取 3次，每次 2 h．用清除超氧阴离子、DPPH和羟基自由
基法评价了该提取物的体外抗氧化能力，并与同等条件下 BHT和抗坏血酸抗氧化能力进行比较．结果显示，茸
毛木蓝根总黄酮具有较强的体外抗氧化能力．
关键词:茸毛木蓝;总黄酮;提取工艺;抗氧化活性
中图分类号:Ｒ 284．2 文献标志码:A 文章编号:0258－7971(2016)04－0638－07
茸毛木蓝(Indigofera stachyoides Lindl．)为豆科
木蓝属植物，其根又名血人参(《贵州植药调
查》)［1］、铁刷子(《贵州民间方药集》)［2］、山红花
和红苦刺(《云南中草药》)［3］，性温，味甘微苦，有
舒筋活血、滋阴补肾、调经摄血和降血糖、保肝［4］
等功效．在《贵州植物药调查》、《贵州草药》、《贵州
民间药物》、《贵州省中药材、民族药材质量标准》
(2003年版)及《云南草药》等医药著作中均有记
载，并对其植物形态和药理活性进行了简略描述．
茸毛木蓝分布于国内云南、贵州、湖北、广西等地，
尼泊尔、泰国、缅甸、不丹及印度等国家也有分布．
为贵州苗族用药，应用历史悠久，市场潜力巨大，如
由贵阳德昌祥药业有限公司生产的芪胶升白胶囊，
以茸毛木蓝根为主要成分之一，对治疗肿瘤放化疗
后引起的白细胞减少及气血亏损等症具有疗效［5］．
目前，茸毛木蓝以采挖野生资源以供药用，魏升华
等［6］对其不同种质资源药材的品质进行评价研
究，刘莉等［7］重点研究其生物学特性，而索贝贝［8］
则以其种子萌发特性为切入点进行研究，力求扩大
种植面积，早日实现茸毛木蓝野生变家种的研究目
标．
黄酮类化合物是以黄酮为母体的一大类化合
物，广泛存在于药用植物、蔬菜、水果中，具有抗炎、
抗菌、抗氧化、软化血管及降血糖等生理活性．茸毛
木蓝根化学成分研究表明，其富含黄酮类化合
物［9－11］，此外，还含有挥发油［12－13］等．国内虽有关
于茸毛木蓝根化学成分研究的报道，但尚未见对茸
毛木蓝根总黄酮进行研究的文章．本文对茸毛木蓝
根总黄酮的提取工艺及提取物的体外抗氧化活性
进行了研究．
1 材料与方法
1．1 材料与试剂 茸毛木蓝根原料采集于贵州省
都匀市周边，由中国林业科学研究院资源昆虫研究
所张弘研究员鉴定为豆科木蓝属植物茸毛木蓝．用
中草药粉碎机粉碎，过 20～60目标准筛．
芦丁标准品购于中国药品生物制品检定所．
DPPH(1，1－dipheny－2－picrylhydrzyl，美国 Sigma公
司)、NaNO2、无水乙醇、Al(NO3)3、NaOH 等均为分
析纯试剂．
1．2 仪器与设备 SP－75PC型紫外可见分光光度
计，上海光谱仪器有限公司;FW－177 型中草药粉
碎机，天津泰斯特仪器有限公司;BSA224S－CW 型
电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;
* 收稿日期:2015－10－26
基金项目:贵州省教育厅青年基金(黔教科 2010105);黔南医专基金项目(QNYZ201306)．
作者简介:王小果(1982－)，女，河南人，硕士，讲师，主要从事天然药物化学研究及相关教学工作．E－mail:450718418@ qq．com．
TGL－16G高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂;
HH系列数显恒温水浴锅，金坛市科析仪器有限公
司;PH－618 型酸度计，上海仪电科学仪器有限公
司．
1．3 方法
1．3．1 提取步骤 称取茸毛木蓝根粉末 3 g，加入
适量乙醇溶液，回流提取，离心，浓缩上清液，定容
于 25 mL容量瓶中，备用．
1．3．2 配制芦丁标准溶液 取适量芦丁标准品在
120 ℃干燥至恒重，精确称 0．015 7 g 于小烧杯中，
加入适量 50%乙醇溶液，加热溶解，冷却后定容于
50 mL容量瓶中，配成质量浓度为 0．314 mg /mL 的
芦丁标准溶液，备用．
1．3．3 芦丁标准曲线的绘制和提取液总黄酮含量
的测定 分别移取芦丁标准溶液 0． 0、0． 5、0． 75、
1．0、1．2、1．5 mL和 2．0 mL，加入 50%乙醇溶液补足
至 2．0 mL，然后采用 Al(NO3)3络合显色法
［14］测其
吸光度，绘制芦丁质量浓度－吸光度曲线，得标准
曲线的回归方程 y(吸光度)= 1．273 7x(芦丁质量
浓度，mg / mL)+0．053 5，Ｒ2 = 0．996 5．
分别移取 3 份提取液 0．5 mL 于 5 mL 具塞试
管中，后面步骤同 1．3．3．同时移取 0．5 mL 提取液，
用 50%乙醇溶液补足至 2．0 mL 作为对照液，测其
吸光度，根据回归方程计算出提取液中总黄酮的质
量浓度，以芦丁计．
ρ2 = ρ1 × V总 V测 ．
上式中，ρ2为提取液中总黄酮的质量浓度(mg /
mL);ρ1为根据回归方程计算出的总黄酮质量浓度
(mg /mL);V总为提取液定容体积(mL);V测为显色
反应中提取液的测定体积(mL)．
Y=m/m0×100%．
上式中，Y 为提取率;m 为提取液中总黄酮的质量
(mg);m0 为茸毛木蓝根粉末的质量(mg)．
1．3．4 单因素试验 采用溶剂浓度、茸毛木蓝根
与溶剂用量的料液比、提取时间、提取次数和提取
温度为影响因素进行考察，选择出正交试验的因素
水平．
1．3．5 正交试验［15］ 根据单因素实验结果设计
L9(3
4)因素水平表进行正交试验，优化提取工艺．
1．3．6 体外抗氧化活性测定 采用邻苯三酚自氧
化法、DPPH和羟基自由基清除体系，并与相同条
件下的抗坏血酸和 BHT抗氧化活性进行比较．
1．3．6．1 提取液对超氧阴离子自由基的清除作
用［16］ 邻苯三酚自氧化速率测定步骤:将 Tris －
HCl缓冲液(pH= 8．2)和 5 mmol /L 邻苯三酚在 25
℃恒温水浴锅中保温 30 min 后，移取 5．0 mL 缓冲
液和 50．0 μL 邻苯三酚溶液于具塞试管中，摇匀，
立即在 325 nm处测其吸光度，以缓冲液为空白，每
隔 0．5 min 测 1 次，测 4．5 min，平行做 3 次取平均
值，自氧化速率控制在 0．059～0．066 A /min．
加入提取液后氧化速率的测定步骤:移取 5．0
mL缓冲液，分别加入 2．0 mL不同质量浓度的提取
液和 50．0 μL 邻苯三酚溶液于具塞试管中，摇匀，
立即同上法测定，以缓冲液为空白．由公式(1)计算
出抑制率:
抑制率 Z=
A0－Aj
A0
×100% ． (1)
上式中，A0 为邻苯三酚自氧化速率;Aj 为含提取液
时的氧化速率．
1．3．6．2 提取液对 DPPH自由基的清除作用［17］
分别将 2．0 mL不同质量浓度的提取液和 DPPH溶
液(2×10－4mol /L)混合在一起，摇匀，避光静置 30
min后在 517 nm 处测其吸光度 Ai，采用相同方法
测定 2．0 mL DPPH溶液和 2．0 mL 60%乙醇溶液混
合后的吸光度 Ac，以及 2． 0 mL 提取液和 2． 0 mL
60%乙醇溶液混合后的吸光度 Aj ．以公式(2)计算
清除率:
清除率 Z=［1－(Ai－Aj)/Ac］×100% ． (2)
1．3．6．3 提取液对羟自由基的清除作用［18］ 取
1．3．1所得茸毛木蓝根总黄酮提取液，分别稀释为
60、80、100、120、150、200、300 μg /mL，取 1．0 mL 稀
释液，依次加入 2．0 mL磷酸盐缓冲溶液，2．0 mL邻
二氮菲，2．0 mL 硫酸亚铁溶液，1．0 mL 0．1%双氧
水，充分混合后，在 532 nm 处测其吸光度，并根据
式(3)计算出清除率，其中 A1表示 60%乙醇溶液取
代提取液的吸光度，A2表示 60%乙醇溶液取代双氧
水的吸光度，A0表示提取液的吸光度．
清除率 Z=(A0－Ai)/(A2－A1)×100% ． (3)
1．3．6．4 与抗坏血酸和 BHT的对照实验 按照上
述实验方法分别测定抗坏血酸和 BHT对超氧阴离
子、DPPH和羟基自由基的清除作用，并与提取液
的清除作用进行比较．
2 结果与分析
2．1 单因素实验结果
2．1．1 溶剂体积分数 称取 5份 20～60目茸毛木蓝
936第 4期 王小果等:茸毛木蓝根总黄酮的提取工艺及其体外抗氧化作用研究
根粉末 3 g，分别加入 40%、50%、60%、70%、80%乙
醇溶液 90 mL，90 ℃下回流 2 h，离心，浓缩上清液，
定容．所得提取液操作步骤同 1．3．3，结果如图 1 所
示，随着乙醇体积分数的增大，提取率升高后降低，
因此选择 50%、60%、70%乙醇作为正交试验的 3
个水平．
2．1．2 提取时间 称取 4份 20～60 目茸毛木蓝根
粉末 3 g，加入 60%乙醇溶液 90 mL，在 90 ℃下分别
回流 0．5、1、2、3 h后，操作步骤同 1．3．3．结果如图 2
所示，提取时间从 0．5 h到 1 h，提取率有较大增幅，
而 1 h到 3 h相比增加不明显，因此选择每次提取
时间为 2 h．
2．1．3 料液比 称取 4份 20～60 目茸毛木蓝根粉
末 3 g，分别加入 60%乙醇溶液 60、90、120、150 mL，
在 90 ℃下回流 2 h，操作步骤同 1．3．3．结果如图 3
所示，料液比在选择的范围内对提取率影响不明
显，综合考虑，选择 1 g ∶ 20 mL、1 g ∶ 30 mL、1 g ∶
40 mL作为正交试验的 3个水平．
2．1．4 提取温度 称取 5份 20～60 目茸毛木蓝根
粉末 3 g，加入 60%乙醇溶液 90 mL，分别在 60、70、
80、90、100 ℃回流 2 h，操作步骤同 1．3．3．结果如图
4所示，随着温度升高，提取率有较大幅度的增加，
综合考虑，选择 80、90、100 ℃作为正交试验的 3 个
水平．
2．1．5 提取次数 称取 4份 20～60 目茸毛木蓝根
粉末 3 g，加入 60%乙醇溶液 90 mL，在 90 ℃回流，
分别提取 1、2、3 次和 4 次，每次 2 h，操作步骤同
1．3．3．结果如图 5所示，随着提取次数增加，提取率
增加，但增加的幅度越来越小，因此选择 2、3、4 次
作为正交试验的 3个水平．
2．2 正交试验结果 根据单因素实验结果，选择
乙醇浓度、料液比、提取温度、提取次数 4 个因素，
提取时间为 2 h，设计 L9(3
4)正交表(见表 1)进行
实验，以茸毛木蓝根总黄酮提取率为考察指标，以
确定茸毛木蓝根总黄酮最佳提取工艺参数．
图 1 乙醇体积分数的影响
Fig．1 Effect of ethanol concentration on extraction rate
图 2 提取时间的影响
Fig．2 Effect of extraction time on extraction rate
图 3 料液比的影响
Fig．3 Effect of rate of solid / liquid on extraction rate
图 4 提取温度的影响
Fig．4 Effect of temperature on extraction rate
表 1 正交试验的 L9(3
4)因素水平表
Tab．1 L9(3
4)orthogonal design table
水平
A
乙醇体积分数 /%
B
料液比 /(g·mL－1)
C
温度 /℃
D
提取次数
1 50 1 ∶ 20 80 2
2 60 1 ∶ 30 90 3
3 70 1 ∶ 40 100 4
046 云南大学学报(自然科学版) http:/ /www．yndxxb．ynu．edu．cn 第 38卷
正交试验结果如表 2和表 3所示，所选因素对
茸毛木蓝根总黄酮提取率均有影响，但影响大小有
差异，顺序为 A＞C＞D＞B，即乙醇体积分数＞提取温
度＞提取次数＞料液比．乙醇体积分数对提取率的影
响比较显著，提取温度也有一定的影响，但 100 ℃
和 90 ℃相比，提取率增加不明显，从能耗方面考
虑，选择 90 ℃作为提取温度．而料液比和提取次数
在选用的水平范围内对总黄酮提取率影响并不明
显．综合考虑，最佳组合为 A2B2C2D2．即乙醇体积分
数为 60%，料液比为 1 ∶ 30，提取温度为 90 ℃，提
取 3次，每次 2 h．
2．3 体外抗氧化活性 抗氧化实验结果如图 6、7
和 8所示，茸毛木蓝根总黄酮提取液具有一定的清
除超氧阴离子、DPPH 和羟基自由基的活性，在一
定范围内，清除效果随着提取液总黄酮浓度的增大
而增强，虽然清除效果与抗坏血酸和 BHT 相比均
较低，但却随着浓度的增大向二者接近．对于 DP-
PH和羟基自由基来说，清除作用比对超氧阴离子
的强，这可能是由于提取液中所含黄酮种类不同所
致．
表 2 正交实验结果(n=3)
Tab．2 Ｒesults of orthogonal test (n= 3)
实验序号 A(乙醇体积分数) B(料液比) C(提取温度) D(提取次数) 总黄酮提取率 /%
1 1(50%) 1(1 ∶ 20) 1(80 ℃) 1(2次) 2．28
2 1(50%) 2(1 ∶ 30) 2(90 ℃) 2(3次) 2．30
3 1(50%) 3(1 ∶ 40) 3(100 ℃) 3(4次) 2．33
4 2(60%) 1(1 ∶ 20) 2(90 ℃) 3(4次) 2．40
5 2(60%) 2(1 ∶ 30) 3(100 ℃) 1(2次) 2．55
6 2(60%) 3(1 ∶ 40) 1(80 ℃) 2(3次) 2．51
7 3(70%) 1(1 ∶ 20) 3(100 ℃) 2(3次) 2．53
8 3(70%) 2(1 ∶ 30) 1(80 ℃) 3(4次) 2．46
9 3(70%) 3(1 ∶ 40) 2(90 ℃) 1(2次) 2．49
平均值 1 2．303 2．403 2．417 2．440
平均值 2 2．487 2．437 2．397 2．447
平均值 3 2．493 2．443 2．470 2．397
极差 0．190 0．040 0．073 0．050
表 3 方差分析
Tab．3 Analysis of variance
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性
乙醇体积分数 0．070 2 23．333 19．000 ＊＊
料液比 0．003 2 1．000 19．000
温度 0．009 2 3．000 19．000 *
提取次数 0．004 2 1．333 19．000
误差 0．01 2
＊＊影响显著;* 有一定影响
146第 4期 王小果等:茸毛木蓝根总黄酮的提取工艺及其体外抗氧化作用研究
图 5 提取次数的影响
Fig．5 Effect of extraction times on extraction rate
图 6 对超氧阴离子自由基的抑制结果
Fig．6 Ｒestraining effects on pyrogallol autooxidation
图 7 对 DPPH自由基的清除结果
Fig．7 Ｒestraining effects on DPPH radical
图 8 对羟基自由基的清除结果
Fig．8 Ｒestraining effects on hydroxyl radical
3 结 论
3．1 正交试验结果 茸毛木蓝根中含有丰富的黄
酮类化合物，在乙醇回流提取时，乙醇体积分数是
影响提取率的主要因素，提取温度也有一定的影
响，而料液比和提取次数在选用的水平范围内对总
黄酮提取率影响不明显．由此筛选出最佳提取工艺
参数为乙醇体积分数 60%，料液比 1 g ∶ 30 mL，提
取温度 90 ℃，提取 3次，每次 2 h．
3．2 茸毛木蓝根总黄酮提取液的体外抗氧化活性
实验显示，提取液对超氧阴离子、DPPH 和羟基
自由基均具有一定的清除作用，但清除效果与抗坏
血酸和 BHT 相比均较低，且对 DPPH、羟基自由基
的清除效果要大于对超氧阴离子的清除效果．茸毛
木蓝根总黄酮提取物具有很多生物活性，本试验主
要研究其体外抗氧化性，因此对茸毛木蓝根其他生
物活性仍需进一步研究．
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Extraction technology optimization and antioxidative activity of
flavonoids in Indigofera atachyoides Lindl
WANG Xiao-guo1，ZHANG Ｒu-guo1，WANG Ming2，SI Gao-fei3
(1．Qiannan Medical College For Nationalities，Duyun 558000，China;
2．The Servicer of Foreign and Taiwan，Hongkong and Macao Affairs of Qiannan Prefecture，Duyun 558000，China;
3．Qiannan Medical Ｒesearch Association for Nationalities，Duyun 558000，China)
Abstract:The solvent extraction technology of flavonoids in Indigofera atachyoides Lindl was optimized by
orthogonal experiments．The experimental results showed that the order of different factors affecting extraction rate
was content of ethanol，temperature，time，rate of solid / liquid．The optimal extraction conditions were 60% ethanol
content，90 ℃ temperature，1 ∶ 30 rate of solid / liquid，2 h extraction time，three times．In vitro antioxidative actity
of the extract was evaluated by two systems，viz． DPPH radical scavenging activity and pyrogallol autoxidation
methods．The results indicated flavonoids in Indigofera atachyoides Lindl have strong antioidative activity in vitro．
Key words:Indigofera stachyoides Lindl．;flavonoids;extraction technology;antioxidative activity
446 云南大学学报(自然科学版) http:/ /www．yndxxb．ynu．edu．cn 第 38卷