全 文 ：　
第４４卷　第４期　
２０１４年４月
中 国 海 洋 大 学 学 报
ＰＥＲＩＯＤＩＣＡＬ　ＯＦ　ＯＣＥＡＮ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＯＦ　ＣＨＩＮＡ
４４（４）：０４７～０５３
Ａｐｒｉｌ，２０１４
龙须菜ＲＳＡＰ分析及其ＳＣＡＲ标记的转化
王津果，隋正红，周　伟，马金华，张　淑，常连鹏
（中国海洋大学海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室，山东 青岛２６６００３）
摘　要：　初步探讨限制性位点扩增多态性（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＲＳＡＰ）分子标记技术在龙须菜遗传多
样性检测和种质鉴定上的应用。利用所优化的适合于龙须菜ＲＳＡＰ分析的ＰＣＲ反应体系，对青岛湛山湾野生群体和栽培
品系９８１、０７－２进行遗传多样性分析和比较。试验采用１５对引物组合在３个群体１４个龙须菜个体中共扩增出６６９个位
点，其中多态位点数为１４６个，多态性比例２２％，平均每对引物产生１０条多态性条带，片段大小在１００～１　０００ｂｐ之间。
湛山湾野生群体的Ｎａ（１．００７　５）、Ｎｅ（１．００７　１）、Ｈ（０．００３　６）、Ｉ（０．００５　１）与栽培品系９８１的Ｎａ（１．００３　０）、Ｎｅ（１．００２　１）、
Ｈ（０．００１　２）、Ｉ（０．００１　８），以及栽培品系０７－２的Ｎａ（１．００９　０）、Ｎｅ（１．００６　３）、Ｈ（０．００３　７）、Ｉ（０．００５　４）相比较可知３个群体的
遗传多样性是有差异的。种群间的遗传多样性分析表明，在所有检测的样品中，遗传多样性多来自不同群体间的多样性。
群体遗传结构分析表明，２个栽培品系９８１、０７－２间遗传距离不大，但栽培品系与湛山湾野生群体间的遗传距离相对较大，
而ＵＰＧＭＡ聚类分析也明显的将湛山湾野生群体与栽培品系９８１、０７－２区分开来，表明野生群体与栽培品系间已产生一定
的遗传隔离。通过分析湛山湾野生群体及栽培品系９８１、０７－２的ＲＳＡＰ指纹图谱，从中筛选栽培品系９８１的特异条带，并将
其转化为稳定性好、特异性高的序列特征化扩增区（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｒｅｇｉｏｎｓ，ＳＣＡＲ）分子标记。
关键词：　龙须菜；ＲＳＡＰ；遗传多样性；栽培品系９８１；ＳＣＡＲ
中图法分类号：　Ｑ７８５　　　　　文献标志码：　Ａ　　　　　文章编号：　１６７２－５１７４（２０１４）０４－０４７－０７
　 　基金项目：“十二五”农村领域国家科技计划项目（２０１２ＡＡ１００８１１－３）；农业部公益性项目（２００９０３０３０）资助
收稿日期：２０１３－０１－１７；修订日期：２０１３－０３－２９
作者简介：王津果（１９８９－），女，硕士。Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｇ１８７５３２３２９５１＠１６３．ｃｏｍ
　 通讯作者：Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｕｉｚｈｅｎｇｈ＠ｏｕｃ．ｅｄｕ．ｃｎ
　　ＲＳＡＰ是由杜晓华于２００６年首次提出的一种新型
ＤＮＡ分子标记技术，具有步骤简单、检测位点较多、成
本较低等优势，未获得全基因组测序结果以前，在遗传
多样性分析、连锁图谱构建和基因定位等方面具有一
定的推广应用价值［１］。张明科［２］进一步研究了该技术
的引物设计并优化了反应体系。乔利仙［３］与辛本华［４］
先后将该技术应用到重楼属植物的遗传多样性分析与
红藻门紫菜遗传多样性及种质鉴定方面。
目前，经青岛湛山湾野生种群选育而来的栽培品
系９８１、０７－２已在福建南部海区［５］、广东省汕头市南澳
岛等地栽培多年［６］，并在浙江、山东及辽宁沿海建立了
龙须菜（Ｇｒａｃｉｌａｒｉｏｐｓｉｓ　ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ）栽培产业［７］。
栽培品系由于多年的无性繁殖而引起种质退化，野生
资源由于沿岸改造与人为干扰，其分布面积逐渐减少。
因此，为适应龙须菜产业化规模不断扩大的现状，如何
保护野生资源的遗传多样性并使之可持续利用变得日
益重要。本研究以湛山湾野生群体和栽培品系为材
料，运用ＲＳＡＰ技术从基因组ＤＮＡ水平上，分析等位
基因及频率、遗传杂合度、多态信息含量等，旨在从分
子水平上探讨龙须菜不同群体的的遗传差异，为龙须
菜种质资源的保护和可持续利用以及遗传育种工作提
供理论依据。
ＳＣＡＲ标记被广泛应用于一些形态上难以区分而且
经济价值差异较大的种和品种鉴别及种质评价［８］。本研
究通过分析ＲＳＡＰ指纹图谱，以期筛选获得龙须菜生产
上的主要苗种来源９８１的特异条带，并将其转化为稳定
可靠、特异性高的ＳＣＡＲ标记。通过利用特异的ＳＣＡＲ
标记鉴定优良的龙须菜栽培品系９８１，可以防止或减少
使用不合格品系给龙须菜生产造成的损失。
１　材料与方法
１．１材料与处理
试验用龙须菜为２０１０年１０月分别采自青岛胶州湾
养殖海区和青岛湛山湾的９８１、０７－２和湛山湾野生四分
孢子体。将采集来的样品切片，置于显微镜下观察，在皮
层细胞中分布有呈十字形分裂的四分孢子囊的藻株即为
四分孢子体［９］。选取１０株湛山湾野生四分孢子体与栽
培品系９８１、０７－２分别２个样品，在海水中用消毒毛刷除
掉附着的杂藻和泥砂后，用蒸馏水冲洗１次。
１．２试验方法
１．２．１龙须菜基因组ＤＮＡ的提取　　采用天根植物
基因组 ＤＮＡ 提取试剂盒（ＴＩＡＮＧＥＮ　ＢＩＯＴＥＣＨ，北
中　国　海　洋　大　学　学　报 ２　０　１　４年
京）提取龙须菜的基因组ＤＮＡ，紫外分光仪测定浓度，
１％琼脂糖电泳检测ＤＮＡ分子的完整性。
１．２．２ＲＳＡＰ分析　　ＲＳＡＰ的分析参照杜晓华等［１］
的方法并作了适当的改进。其中引物由上海生工技术
有限公司合成，引物序列如表１。６个引物可分别与其
它任何１个引物组合而得到１５对引物，利用这１５对引
物对１４个龙须菜样品 ＤＮＡ 进行ＰＣＲ扩增。２０μＬ
ＰＣＲ反应体系中各反应物含量：２μＬ　１０×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ，
３０ｎｇ 基因组 ＤＮＡ，２．５ ｍｍｏｌ·Ｌ－１　ＭｇＣｌ２，０．１５
ｍｍｏｌ·Ｌ－１　ｄＮＴＰｓ，０．４μｍｏｌ·Ｌ
－１引物，２Ｕ Ｔａｑ
ＤＮＡ聚合酶。ＰＣＲ反应在杭州朗基９６孔精品型ＰＣＲ
仪上进行，反应程序为：９４℃变性５ｍｉｎ，前５个循环为
９４℃变性１ｍｉｎ，３５℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸１ｍｉｎ；接
下来３０个循环为：９４℃变性１ｍｉｎ，４６℃退火１ｍｉｎ，
７２℃延伸１ｍｉｎ；最后７２℃延伸５ｍｉｎ。结束后产物进
行４℃保存。
扩增产物通过６％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
（Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＰＡＧＥ）进行分
析，银染［１０］。
表１　ＲＳＡＰ分析与ＳＣＡＲ验证所用的引物
Ｔａｂｌｅ　１Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ＲＳＡＰ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　ＳＣＡＲ　ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
引物名称Ｐｒｉｍｅｒ　ｎａｍｅ 引物用途Ｐｒｉｍｅｒ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ 引物序列（５’—３’）Ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（５’—３’）
Ｓ１ ＲＳＡＰ　 ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＡＴＧＡＡＴＴＣ
Ｓ２ ＲＳＡＰ　 ＴＡＴＣＴＧＧＴＧＡＧＧＧＡＴＡＴＣ
Ｓ３ ＲＳＡＰ　 ＴＴＧＧＧＡＴＡＴＣＧＧＡＡＧＣＴＴ
Ｓ４ ＲＳＡＰ　 ＧＡＣＴＣＣＡＴＴＡＧＧＡＡＧＣＴＴ
Ｓ５ ＲＳＡＰ　 ＡＧＣＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣ
Ｓ６ ＲＳＡＰ　 ＧＴＧＣＡＴＣＧＡＴＣＴＧＧＴＴＡＡ
ＳＣＡＲ１Ｆ ＳＣＡＲ正向引物① ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＡＴＧＡＡＴＴＣＣＴＡＧ
ＳＣＡＲ１Ｒ ＳＣＡＲ反向引物② ＴＧＧＴＧＡＧＧＧＡＴＡＴＣＴＡＡＴＴＧＡＣ
ＳＣＡＲ２Ｆ ＳＣＡＲ正向引物① ＧＣＧＧＡＡＧＴＴＴＧＣＧＴＣＣＴＡＡＴＣＡＧ
ＳＣＡＲ２Ｒ ＳＣＡＲ反向引物② ＴＴＧＧＧＣＧＴＴＡＴＣＧＧＧＣＴＡＴＣＡＣＣ
Ｎｏｔｅ：①Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ　ｏｆ　ＳＣＡＲ；②Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ　ｏｆ　ＳＣＡＲ
１．２．３ＲＳＡＰ数据分析　　人工观察统计电泳条带，以
扩增清晰的带为标准进行标记分析，将电泳图谱中的
每一条带的迁移位置记为一个位点，相同迁移位置的
扩增带出现时记为１，缺失和模糊不清时记为０，构建
０－１矩阵。运用ＰｏｐＧｅｎ［１１］分析种群内的遗传多样性：
观测到的等位基因数，Ｎａ、有效等位基因数，Ｎｅ、平均
基因多样性指数，Ｈ 以及Ｓｈａｎｎｏｎ多样性信息指数，Ｉ；
种群间的遗传多样性：种群内总的基因多样性，Ｈｔ、种
群内的基因多样性，Ｈｓ、种群间的基因分化度，Ｇｓｔ、基
因流，Ｎｍ；计算出遗传距离，Ｄ，采用 ＭＥＧＡ５．０软件按
ＵＰＧＭＡ法进行聚类。
１．２．４　９８１特异条带目的回收与测序　　将筛选到的
特异条带，按照 Ｐｏｌｙ－ｇｅｌ　ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ＯＭＥ－
ＧＡ，上海）说明进行聚丙烯酰胺凝胶胶回收。以回收
回来的ＤＮＡ片段为模板，进行２０μＬ×５的放大ＰＣＲ，
扩增程序参照ＲＳＡＰ的反应程序。放大ＰＣＲ的产物
经１．５％的琼脂糖电泳检测，１００μＬ　ＰＣＲ产物琼脂糖
电泳后，运用 ＴａＫａＲａ　Ａｇａｒｏｓｅ　Ｇｅｌ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ按照说明书进行回收。
目的片段的连接按照ｐＭＤＴＭ１８－Ｔ　Ｖｅｃｔｏｒ说明书
进行连接。转化后平板培养，随机挑取１０个阳性克隆
进行目的片段检测。阳性克隆在１ｍＬ含Ａｍｐ的ＬＢ
培养基中培养４ｈ，加终浓度２０％甘油，经由上海生工
３７３０测序仪进行单向测序。
１．２．５ＳＣＡＲ引物的设计与验证　　使用ＮＣＢＩ的Ｖｅｃ
Ｓｃｒｅｅｎ对测序后的ＤＮＡ片段在线去除载体序列，然后
在ＧｅｎＢａｎｋ里面比对是否有同源序列。此外，将整理
过的序列载入软件Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐｒｅｍｉｅｒ　５．０，根据引物设计
原则，在序列两端设计特异引物，并送上海生工合成。
参照１．１提取９８１、０７－２各２株和３０株湛山湾野生四
分孢子体的基因组ＤＮＡ，确定ＳＣＡＲ引物的退火温度
并进行验证ＰＣＲ，程序如下：９４℃变性５ｍｉｎ；９４℃变
性１ｍｉｎ，５４℃（ＳＣＡＲ引物１）／６５℃（ＳＣＡＲ引物２）退
火１ｍｉｎ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３０个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ，
４℃保存。１．５％琼脂糖凝胶电泳进行目的片段的检
测。
２　结果与分析
２．１ＲＳＡＰ扩增结果
１５对引物在１０株湛山湾野生四分孢子体、２个
９８１样品、２个０７－２样品共计１４个样品中扩增出６６９
个位点。龙须菜１４个样品的ＲＳＡＰ聚丙烯酰胺凝胶
８４
４期 王津果：龙须菜ＲＳＡＰ分析及其ＳＣＡＲ标记的转化
电泳扩增条带情况见图１。
（１－１０泳道，１５－２４泳道为湛山湾野生四分孢子体扩增结果；１１，１２，２５，２６
泳道为９８１扩增结果；１３，１４，２７，２８泳道为０７－２扩增结果。１－１４泳道，
１５－２８泳道分别为２对引物扩增结果。黑色箭头所示为栽培品系９８１的
特异条带。Ｌａｎｅｓ　１－１０ａｎｄ　１５－２４：ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｔｅｔｒａｓｐｏｒｏｐｈｙｔｅｓ
ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｚｈａｎｓｈａｎ　Ｂａｙ；Ｌａｎｅｓ　１１，１２，２５，２６：ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｃｕｌｔｉ－
ｖａｒ　９８１；Ｌａｎｅｓ　１３，１４，２７，２８：ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｃｕｌｔｉｖａｒ　０７－２．Ｌａｎｅｓ
１－１４ａｎｄ　１５－２８：ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｐａｉｒｓ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
Ｂｌａｃｋ　ａｒｒｏｗｓ　ｓｈｏｗ　ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｂａｎｄｓ　ｏｆ　ｃｕｌｔｉｖａｒ　９８１）
图１　龙须菜１４个样品的ＲＳＡＰ聚丙烯酰
胺凝胶电泳扩增结果图示
Ｆｉｇ．１　ＲＳＡＰ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　１４ｓａｍｐｌｅｓ　ｏｆ
Ｇ．ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ　ｒｅｓｏｌｖｅｄ　ｂｙ　ＰＡＧＥ　ａｎａｌｙｓｉｓ
由图１可见，青岛湛山湾野生四分孢子体与栽培品
系９８１、０７－２的ＲＳＡＰ扩增片段大小在１００～１　０００ｂｐ，群
体间差异条带少，群体内各个体间的差异条带更少。
２．２龙须菜各群体内的ＲＳＡＰ分析
湛山湾野生和栽培品系９８１、０７－２种群内的平均观
测等位基因数（Ｎａ）、有效等位基因数（Ｎｅ）、平均基因
多样性指数即平均杂合度（Ｈ）以及Ｓｈａｎｎｏｎ多样性信
息指数（Ｉ）、多态性位点比率（Ｐ／％）见表２。
表２　各群体内的遗传多样性
Ｔａｂｌｅ　２　Ｔｈｅ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ｅｖｅｒｙ　ｇｒｏｕｐ
种群Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　 Ｎａ　 Ｎｅ　 Ｈ　 Ｉ　 Ｐ／％
湛山湾野生种群① １．００７　５　１．００７　１　０．００３　６　０．００５　１　０．７５
栽培品系９８１② １．００３　０　１．００２　１　０．００１　２　０．００１　８　０．１５
栽培品系０７－２③ １．００９　０　１．００６　３　０．００３　７　０．００５　４　０．９０
Ｎｏｔｅ：①Ｗｉｌｄ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　Ｚｈａｎｓｈａｎ　Ｂａｙ；②Ｃｕｌｔｉｖａｒ　９８１；
③Ｃｕｌｔｉｖａｒ　０７－２
由表 ２ 可以看出，各群体内多态性位点比率
（Ｐ／％）都很低，最低的为栽培品系９８１，多态性比率不
到０．２％，栽培品系０７－２多态性位点比率最高，为
０．９％，这反应了龙须菜各群体内部遗传变异水平是非
常低的。各群体的有效等位基因数 Ｎｅ在１．００２　１～
１．００７　１之间，湛山湾野生群体与栽培品系有效等位基
因数差别不大，有效等位基因数最大的是湛山湾野生
群体，达到了１．００７　１。各群体内的基因多样性指数Ｈ
在０．００１　２～０．００３　７之间，该指数的值也是较低的。
Ｓｈａｎｎｏｎ指数Ｉ，分布在０．００１　８～０．００５　４之间，最大
的为栽培品系０７－２。Ｉ值表示群体的基因变异程度，各
群体的Ｉ值普遍很低，说明了各群体的基因变异程度
低。各群体的有效等位基因数Ｎｅ和基因多样性指数
Ｈ 以及Ｓｈａｎｎｏｎ指数Ｉ的变化趋势是一致的。
２．３湛山湾野生与栽培品系９８１、０７－２种群间ＲＳＡＰ分
析
　　种群内总的基因多样性Ｈｔ、种群内的基因多样性
Ｈｓ、种群间的基因分化度Ｇｓｔ、基因流Ｎｍ 见表３。所
有群体内总的基因多样性 Ｈｔ为０．０９５　３，大于各群体
内的基因多样性系数 Ｈｓ为（０．００２　９），而湛山湾野生
与２个栽培品系群体之间两两分析结果显示，任何２个
群体的总基因多样性均小于０．０１。由此可见，各群体
间的基因多样性主要来自湛山湾的样品和栽培品系样
品之间的差异。所有群体间的基因流为０．０１５　５，小于
１，表现出很低的基因流动性，表明群体间几乎不存在
基因流动。各群体间的基因分化度Ｇｓｔ也均大于０．５，
说明在所有检测的样品中，遗传多样性多来自不同群
体间的多样性。
湛山湾野生与２个栽培品系９８１、０７－２群体个体间
的遗传距离见表４，利用 ＵＰＧＭＡ方法对龙须菜野生
群体与２个栽培品系进行聚类分析，相应的 ＵＰＧＭＡ
聚类树见图２。
（１－１０个体为湛山湾野生四分孢子体；１１，１２个体为栽培品系９８１；１３，
１４个体为栽培品系０７－２．ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ　１－１０：ｔｅｔｒａｓｐｏｒｏｐｈｙｔｅｓ　ｏｆ　Ｚｈａｎｓ－
ｈａｎ　Ｂａｙ，ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ　１１ａｎｄ　１２：ｃｕｌｔｉｖａｒ　９８１，ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ　１３ａｎｄ　１４：
ｃｕｌｔｉｖａｒ　０７－２）
图２　龙须菜群内总的ＵＰＧＭＡ法遗传聚类图
Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ＵＰＧＭＡ　ｄｅｎｄｒｏｇｒｏｍ　ｏｆ　ａｌ　ｔｈｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ
Ｇ．ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ　ｕｓｉｎｇ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｓｔａｎｃｅ
９４
中　国　海　洋　大　学　学　报 ２　０　１　４年
表３　种群间的基因多样性
Ｔａｂｌｅ　３　Ｇｅｎｅ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ｉｎｔｅｒ－ｇｒｏｕｐｓ　ｏｆ　Ｇ．ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ
种群Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　 Ｈｔ　 Ｈｓ　 Ｇｓｔ　 Ｎｍ
湛山湾野生①—９８１　 ０．０８０　６　 ０．００２　４　 ０．９６９　７　 ０．０１５　６
湛山湾野生①—０７－２　 ０．０７２　０　 ０．００３　７　 ０．９４８　９　 ０．０２６　９
９８１—０７－２　 ０．０６３　９　 ０．００２　５　 ０．９６１　２　 ０．０２０　２
湛山湾野生①—９８１—０－７２　 ０．０９５　３　 ０．００２　９　 ０．９６９　９　 ０．０１５　５
Ｎｏｔｅ：①Ｗｉｌｄ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　Ｚｈａｎｓｈａｎ　Ｂａｙ
表４　１４个个体间的遗传距离
Ｔａｂｌｅ　４　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｓｔａｎｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　１４　Ｇ．ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ
１　 ２　 ３　 ４　 ５　 ６　 ７　 ８　 ９　 １０　 １１　 １２　 １３　 １４
１
２
３
４
５
６
７
８
９
１０
１１
１２
１３
１４

０．００６　０
０．００６　０
０．００４　５
０．００４　５
０．００１　５
０．００４　５
０．００３　０
０．００４　５
０．００３　０
０．１７４　３
０．１７４　３
０．１４６　２
０．１５３　２

０．００３　０
０．００４　５
０．００１　５
０．００４　５
０．００１　５
０．００３　０
０．００４　５
０．００３　０
０．１７４　３
０．１７４　３
０．１４９　７
０．１５３　２

０．００４　５
０．００４　５
０．００７　５
０．００４　５
０．００３　０
０．００４　５
０．００３　０
０．１７４　３
０．１７４　３
０．１４６　２
０．１５３　２

０．００６　０
０．００３　０
０．００３　０
０．００７　５
０．００３　０
０．００４　５
０．１７２　５
０．１７２　５
０．１４７　９
０．１５１　４

０．００３　０
０．００３　０
０．００１　５
０．００３　０
０．００４　５
０．１７２　５
０．１７２　５
０．１４７　９
０．１５１　４

０．００３　０
０．００４　５
０．００３　０
０．００４　５
０．１７２　５
０．１７２　５
０．１４７　９
０．１５１　４

０．００４　５
０．００６　０
０．００１　５
０．１７６　１
０．１７６　１
０．１５１　４
０．１５４　９

０．００４　５
０．００３　０
０．１７４　３
０．１７４　３
０．１４６　２
０．１５３　２

０．００７　５
０．１６９　０
０．１６９　０
０．１４４　５
０．１４７　９

０．１７７　８
０．１７７　８
０．１４９　７
０．１５６　６

０．００３　０
０．１２７　４
０．１３４　２

０．１３０　８
０．１３７　６

０．００９　０ 
注：１～１０个体为湛山湾野生四分孢子体；１１～１２个体为栽培品系９８１．１３～１４个体为栽培品系０７－２。Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ　１～１０：ｔｅｔｒａｓｐｏｒｏ－
ｐｈｙｔｅｓ　ｏｆ　Ｚｈａｎｓｈａｎ　Ｂａｙ；Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ　１１～１２：ｃｕｌｔｉｖａｒ　９８１；Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ　１３～１４：ｃｕｌｔｉｖａｒ　０７－２．
　　由图２可以看出，１～１０号样品为一个群体，１１～
１２号样品为一个群体，１３～１４号样品为一个群体，与
１４个样品分属于３个不同群体相一致，１～１０号为属
于湛山湾野生群体，１１～１２号属于栽培品系９８１、１３～
１４号属于栽培品系０７－２。由聚类图可以看出，各群体
间的遗传距离小，群体间遗传距离最长在０．１７左右，
而群体内的遗传距离均低于０．０１。
２．４目的片段的回收、测序以及ＳＣＡＲ引物设计与验证
将筛选得到的栽培品系９８１特异的片段回收测序
后，得到大小分别为６２０ｂｐ、５４２ｂｐ的２条片段。在序
列两端设计ＳＣＡＲ引物，引物信息见表１。ＳＣＡＲ引物
２对９８１、０７－２各３株和３０株湛山湾野生四分孢子体
共计３６株龙须菜的扩增结果如图３，扩增片段大小为
４４２ｂｐ，ＳＣＡＲ引物１扩增结果与ＳＣＡＲ引物２扩增结
果一致，片段大小为６１６ｂｐ。结果表明，２对特异
ＳＣＡＲ引物对９８１基因组 ＤＮＡ 可以扩增出预期大小
的特异条带，而在０７－２和湛山湾野生四分孢子体中均
无扩增条带。
（１～３泳道：９８１；４～６泳道：０７－２；７～３６泳道：湛山湾野生四分孢子体；Ｍ：ＤＬ２０００。Ｌａｎｅｓ　１－３：ｃｕｌｔｉｖａｒ　９８１；Ｌａｎｅｓ　４－６：ｃｕｌｔｉｖａｒ　０７－２；Ｌａｎｅｓ　７－３６：ｔｅｔ－
ｒａｓｐｏｒｏｐｈｙｔｅｓ　ｏｆ　Ｚｈａｎｓｈａｎ　Ｂａｙ；Ｍａｒｋｅｒ：ＤＬ２０００．）
图３　ＳＣＡＲ引物２对龙须菜新个体的验证ＰＣＲ电泳图
Ｆｉｇ．３　Ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ　ｐｒｏｆｉｌｅ　ｏｆ　Ｇ．ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ　ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ＳＣＡＲ　ｐｒｉｍｅｒ　２
０５
４期 王津果：龙须菜ＲＳＡＰ分析及其ＳＣＡＲ标记的转化
３　讨论
ＲＳＡＰ技术的ＰＣＲ扩增程序借鉴了ＳＲＡＰ［１２］技
术，引物的设计借鉴了ＲＡＰＤ［１３］随机序列的模糊匹配
原理。从操作步骤上讲，ＲＳＡＰ技术是 ＡＦＬＰ［１４］的极
大简化；从基因组的扩增区域上讲，ＲＳＡＰ是对ＳＲＡＰ
和ＴＲＡＰ［１５］的有效补充。因为后两者主要针对单拷贝
区扩增，而ＲＳＡＰ扩增的限制性位点则散布于整个基
因组区（包括重复区和单拷贝区）。ＲＳＡＰ标记技术是
一个操作简单、产率中等、可靠稳定、适用性较广的一
种分子标记技术，已经在植物的多种研究中成功应
用［１－４］。
采用１条ＲＳＡＰ引物，无论含６ｂｐ或含４ｂｐ的限
制性位点识别序列的引物进行ＰＣＲ扩增，均不能扩增
或很少扩增出条带；而采用２条不同的引物组合进行
ＰＣＲ扩增时，可获得丰富的扩增谱带［１］。因此本试验
中仅采用了由６条引物组合而成的１５对引物。另外，
在ＲＳＡＰ条带统计过程中，本研究只对条带的出现与
否进行了统计，而未对条带的强弱进行分析，实际扩增
条带的强弱在一定程度上也能反映 ＤＮＡ水平的变化，
如拷贝数的多少等［１６］。而在相关文献中，把扩增条带
的强度差异作为区分不同样本的报道并不多见，因此
本试验中进行ＲＳＡＰ条带统计时，也只将条带的有无
作为是否多态性位点的标准。
ＲＳＡＰ结果分析表明，湛山湾二倍体野生群体与两
个栽培品系９８１、０７－２，各群体内的多态性比率都非常
低，最低的栽培品系９８１的仅为０．１５％，而湛山湾野生
群体与栽培品系０７－２的都低于１％，比Ｐａｎｇ等［１７］分析
的青岛湛山湾二倍体的龙须菜多态性比率（１４．７％）和
丁弘叶等［１８］研究所得的青岛湛山湾二倍体的龙须菜多
态性比率（３３．３％）低；同时各群体的有效等位基因数
也很少，表示群体基因变异程度的Ｓｈａｎｎｏｎ指数Ｉ也
非常低，湛山湾野生群体的仅为０．００５　１，比Ｐａｎｇ等［１７］
与丁弘叶等［１８］的相应数值要低一个数量级甚至更多。
以上数据都反映出本试验中各群体的基因变异程度非
常低，这是由于所采用的分子标记技术ＲＳＡＰ是基于
限制性内切酶酶切位点的多态性标记，基因发生突变
的概率本身就很低，如果是特定位点的突变频率会更
低，这就直接导致了在分析同一物种不同群体遗传多
样性时会出现很低的情况。这也说明了同一物种的遗
传多样性检测值与所采用的分子标记技术相关。
另外，群体间的ＲＳＡＰ分析结果显示，野生群体与
两个栽培品系间的基因流为０．０１５　５，小于１，基因流动
性很低，表明群体间几乎不存在基因流动。两两群体
间的基因分化度Ｇｓｔ也均大于０．５接近１，说明各群体
间的基因分化程度大。各群体间的遗传距离很小，遗
传相似系数很大，尽管２个栽培品系９８１、０７－２间遗传
距离不大，但栽培品系与湛山湾野生群体间的遗传距
离相对较大，而 ＵＰＧＭＡ聚类分析也明显将湛山湾野
生群体与栽培品系９８１、０７－２区分开来，表明野生群体
与栽培品系间已产生一定的遗传隔阂。
本试验中ＲＳＡＰ分析的群体内及群体间遗传多样
性系数均都很低，也是由于材料本身的原因：龙须菜产
生的是不动精子，不能进行远距离受精；湛山湾二倍体
野生群体中的个体均于２０１０年１０月采自青岛湛山湾，
时空的一致性导致了所采集个体几乎不与外来个体间
发生杂交互换，缺乏基因的流动；栽培品系９８１最初是
由湛山湾野生个体通过人工选择而来的，０７－２则是在
９８１基础上进一步经过人工诱变选育而来，在生产实践
中一直都通过营养繁殖进行栽培，造成了龙须菜群体
内由于缺乏等位基因的互换而遗传多样性低。针对龙
须菜遗传多样性低的现状，一方面有必要通过保护其
特殊生长环境保护龙须菜的野生资源，另一方面加快
其遗传育种进度，同时建立种质库，进而更好地实现对
现有龙须菜种群遗传资源的保护。
目前用ＳＣＡＲ标记进行农作物种质鉴定在国际上
已普遍展开［１９］。在国内藻类方面，ＳＣＡＲ标记已被广
泛地应用于紫菜的种质鉴定［２０－２２］，同时在龙须菜的种
质鉴定方面也得到了应用［１８］。栽培品系９８１生长快
速，分支多，耐高温，速生抗逆，琼胶含量高且好，属主
要的栽培品种，是从青岛湛山湾野生种群经过诱变选
育而来［２３］，与栽培品系０７－２、野生个体在外观上没有明
显的区别，但在生长性状及生化特性上差异显著［２４］，而
长期以来并没有很好的便捷的手段或方法区分。本试
验中，在对龙须菜野生种群与栽培品系９８１、０７－２进行
ＲＳＡＰ遗传多样性分析过程中，发现６条栽培品系９８１
的特异条带，并将其中两条带成功转化为９８１特异的
ＳＣＡＲ标记。该ＳＣＡＲ标记将在生产上广泛应用的栽
培品系９８１与其他龙须菜材料区分，保证栽培苗种的
纯度，避免使用不合格苗种给龙须菜栽培产业造成损
失，进而更有效地进行大规模的人工养殖和满足科研
需要。
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２５
４期 王津果：龙须菜ＲＳＡＰ分析及其ＳＣＡＲ标记的转化
ＲＳＡＰ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｎ　Ｇｒａｃｉｌａｒｉｏｐｓｉｓ　ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ
ａｎｄ　Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ　ｏｆ　ＳＣＡＲ　Ｍａｒｋｅｒ
ＷＡＮＧ　Ｊｉｎ－Ｇｕｏ，ＳＵＩ　Ｚｈｅｎｇ－Ｈｏｎｇ，ＺＨＯＵ　Ｗｅｉ，ＭＡ　Ｊｉｎ－Ｈｕａ，ＺＨＡＮＧ　Ｓｈｕ，ＣＨＡＮＧ　Ｌｉａｎ－Ｐｅｎｇ
（Ｔｈｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｏｃｅａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ，Ｑｉｎｇｄａｏ　２６６００３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｓｉｔｅ　Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＲＳＡＰ）ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｗａｓ　ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｄｅ－
ｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｎｄ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｒａｃｉｌａｒｉｏｐｓｉｓ　ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ．Ｔｈｒｅｅ　ｐｏｐｕｌａ－
ｔｉｏｎｓ，ｗｉｌｄ　ｆｒｏｍ　Ｚｈａｎｓｈａｎ　Ｂａｙ，Ｑｉｎｇｄａｏ　ａｎｄ　ｔｗｏ　ｃｕｌｔｉｖａｒ（９８１ａｎｄ　０７－２ｃｕｌｔｉｖａｒ）ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ａｎｄ　ｃｏｍ－
ｐａｒｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ＲＳＡＰ　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ．１５ｐｒｉｍｅｒ　ｐａｉｒｓ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ａ　ｔｏｔａｌ　ｏｆ　６６９ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ
ｂａｎｄｓ　ｗｉｔｈｉｎ　１４ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ　ｕｓｅｄ，１４６ｏｆ　ｗｈｉｃｈ（２２％）ｗｅｒｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ．Ｅａｃｈ　ｐｒｉｍｅｒ　ｐａｉｒｓ　ｇｅｎｅｒａｔｅｄ　１０
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｂａｎｄｓ，ｗｉｔｈ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｓｉｚｅ　ｒａｎｇｅｄ　ｆｒｏｍ　１００ｔｏ　１　０００ｂｐ．Ｔｈｅ　Ｎａ，Ｎｅ，Ｈａｎｄ　Ｉ　ｗａｓ　１．００７　５，
１．００７　１，０．００３　６ａｎｄ　０．００５　１ｆｏｒ　ｗｉｌｄ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｚｈａｎｓｈａｎ　Ｂａｙ　ａｎｄ　１．００３　０，１．００２　１，０．００１　２ａｎｄ
０．００１　８ｆｏｒ　ｃｕｌｔｉｖａｒ　９８１，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ａｂｏｖｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｉｎｄｅｘ　ｗａｓ　１．００９　０，１．００６　３，０．００３　７ａｎｄ　０．００５　４
ｆｏｒ　ｃｕｌｔｉｖａｒ　０７－２，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　ｗａｓ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｃｏｍｐａｒｉ－
ｓｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｉｎｄｅｘ．Ｔｈｅ　ｃｕｌｔｉｖａｒ　９８１ｓｈｏｗｅｄ　ｌｏｗｅｒ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｔｈａｎ　ｂｏｔｈ　ｔｈｅ　ｃｕｌｔｉｖａｒ　０７－２ａｎｄ　ｗｉｌｄ
ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｚｈａｎｓｈａｎ　Ｂａｙ．Ｔｈｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉ－
ｖｅｒｓｉｔｙ　ｉｎ　ａｌ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｗａｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　ｌａｒｇｅｌｙ．Ｉｎ　ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｐｏｐｕ－
ｌａｔｉｏｎ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｓｍａｌ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｓｔａｎｃｅ　ａｎｄ　ｈｉｇｈ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｔｈｒｅｅ　ｇｒｏｕｐｓ
ｏｆ　Ｇ．ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｓｔａｎｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｗｉｌｄ　ｐｏｐｕ－
ｌａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｂｅｔｗｅｅｎ　９８１ａｎｄ　０７－２ｃｕｌｔｉｖａｒ．Ｔｈｅ　ＵＰＧＭＡ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｗｏ　ｍａｉｎ　ｃｌｕｓ－
ｔｅｒｓ，ｗｈｉｃｈ　ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｔｈｅ　ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｗｉｌｄ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ａｆｔｅｒ　ａｎａｌｙｚｉｎｇ　ｔｈｅ
ＲＳＡＰ　ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ　ａｍｏｎｇ　ｔｈｒｅｅ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｂａｎｄｓ　ｏｆ　ｃｕｌｔｉｖａｒ　９８１ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ａｎｄ　ｃｏｎ－
ｖｅｒｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｒｅｇｉｏｎｓ（ＳＣＡＲ）ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｒｋｅｒ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｓｐｅ－
ｃｉｆｉｃｉｔｙ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：　Ｇｒａｃｉｌａｒｉｏｐｓｉｓ　ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ；ＲＳＡＰ；ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ；９８１ｃｕｌｔｉｖａｒ；ＳＣＡＲ
责任编辑　高　蓓
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