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龙须菜中 5种植物激素的 GC-MS 检测方法
邵旻玮
( 贵阳护理职业学院，贵州 贵阳 550081)
摘 要：以红藻龙须菜为材料，建立龙须菜中 5 种植物激素的 GC-MS 检测方法。该方法线性相关系数
在 0.9943 ～ 0.999 之间，变异系数在 1.4% ～ 2.9% 之间，回收率范围为 76.7% ～ 104.3%。本方法最
低检测限范围在 1.0×10-2 ～ 2.5×10-2 mg/L 之间。
关键词：龙须菜；微量检测；GC-MS
植物激素是植物体内合成的、对植物生长发育具
有显著作用的微量物质 [1]。植物受到逆境胁迫时，植
物体内的激素发生变化，从而通过影响植物的生理生
化活动来产生抵御胁迫的能力 [2]。研究逆境下植物激
素的含量变化，对于揭示植物激素与植物抗逆性之间
的关系具有重要的意义，但由于藻类中的植物激素含
量普遍较陆地高等植物低，所以对前者的研究远不如
后者系统和充分。本文建立一次性检测龙须菜中 5种
植物激素的GC-MS检测方法。
1 提取和鉴定方法
1.1 试验仪器和设备
岛津 QP2010 气相色谱 - 质谱联用仪、R-215
旋转蒸发仪、XW-80A旋涡混合器、PB203-N分
析天平、固相萃取装置、GXZ型智能光照培养箱。
1.2 试验试剂和材料
水杨酸 (SA)、肉桂酸 (RA)、茉莉酸 (JA)、吲
哚乙酸 (IAA) 标准品均购自 Sigma 公司；二氢茉
莉酸 (dhJA)、脱落酸 (ABA) 购自东京化成工业株
式会社 (TCI)；三甲基硅烷化重氮甲烷正己烷溶
液 (2.0mol/L) 购自 Sigma 公司；甲醇、正己烷为
色谱纯；其余试剂均为分析纯；水为 2 次重蒸水。
Oasis…HLB固相萃取小柱、Oasis…MAX固相萃取小
柱购自 Waters 公司。龙须菜样品采自广东汕头南
澳养殖基地。
1.3 试验方法
1.3.1 标准溶液的配制… 准确称取水杨酸 (SA)、
肉桂酸 (RA)、茉莉酸 (JA)、吲哚乙酸 (IAA)、脱
落酸 (ABA) 标准品各 0.01…g，置于 10…ml 容量瓶
中，用色谱纯甲醇定容至刻度，即得标准样品的混
合溶液。
作者简介：邵旻玮（1985-），女，硕士，讲师；主要从事
生物学教学与研究工作。
1.3.2 提取… 称取 1.0… g 藻样，加入液氮研磨
成粉，再加入 4℃含 BHT…100… mg/L的正丙醇∶
水∶ HCl(2 ∶ 1 ∶ 0.002)4… ml 和 100…ng二氢茉莉酸
( 内标 )，4℃避光放置过夜。离心 (4… 000… r/min)…
15…min，将离心后的液体转入另 1 试管中，残渣用
2…ml 正丙醇∶水∶ HCl 再提取 1 次，合并全部提
取液于试管中，加入 4℃含 BHT… 100… mg/L的二
氯甲烷 4…ml，离心 (4…000…r/min)10…min，弃去上
层水相，下层正丙醇、二氯甲烷有机相于 30℃水
浴下旋转蒸发至干，待净化。
1.3.3 净化… 用 Oasis…HLB小柱子 (Waters 公司 )
固相萃取纯化提取物，纯化步骤如下：依次用 5…ml…
100% 甲醇和 5…ml 纯水淋洗 HLB固相萃取小柱，
弃去淋洗液，将1.3.2中的试样提取液过柱，用5…ml…5%
甲醇-水清洗，弃去流出液后抽干，最后用3…ml…100%
甲醇洗脱，收集全部洗脱液于4…ml带盖玻璃试样瓶中。
1.3.4 衍生化… 将 1.3.3 中收集的洗脱液在 30℃
水浴中旋转浓缩至约 1…ml 后加入 20…μl三甲基硅
烷化重氮甲烷正己烷溶液，盖紧混匀，在 30℃水
浴中反应 1… h；结束后用平缓氮气吹干，色谱正己
烷溶解并定容至 1…ml，供 GC-MS分析。
1.4 色谱 -质谱条件
色谱条件：通过 SPB1 聚二甲基硅氧烷非极性
柱 (30… m×0.32… mmID×0.25…μm) 分离样品。
初始温度 40℃，保持 3…min，以 20℃ /min 升到…
200℃，保持 10…min，然后以 30℃ /min升到 280℃，…
保持 10…min。进样口温度 250℃。以氦气作为载气，
纯度 99.999%，流速为 1…ml/min。分流进样，分
流比为 10 ∶ 1。自动进样，进样量为 1…μl。质谱条
件：电子轰击源 (EI)，电子能量 70… eV，离子源温度
200℃，选择离子检测模式 (SIM)。
1.5 测定
将1.3.1中的混合标准溶液依次稀释成50…μg/ml、…
25…μg/ml、10…μg/ml、5…μg/ml、1…μg/ml、
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中国园艺文摘 2016 年第 8期
0.5…μg/ml、0.1…μg/ml，然后各加入 0.1…μg
二氢茉莉酸作为内标，按照 1.4 中的色谱 - 质谱
方法进行分析得到各自的峰面积，计算各植物激
素和内标的峰面积比值，以峰面积比值 (y) 对相应
的植物激素浓度 (x，μg/ml) 进行线性回归，得出
标准曲线的斜率，用于内源激素的定量分析。计
算采用如下公式：植物激素含量 (ng/g)=(A激素 /…
A内标/a×M)/W。其中，A为峰面积，a为由标准
曲线得来的斜率，M为内标加入量，W为样品重。
2 结果与讨论
2.1 提取溶剂的选择
比较常用的几种提取剂甲醇、丙醇、正丙醇和丙
酮的提取效果，发现丙酮和甲醇极性较强，对植物激
素的提取效果不错，但是也能提取出龙须菜体内大量
的脂类和色素杂质，从而给下一步净化带来困难。丙
醇虽然提取的色素和脂类较少，但提取植物激素的效
率不高，最终不采用。正丙醇既能有效的提取植物激
素又能减少脂类和色素的溶出，同时参考 Eric[3] 的方
法加入适量的盐酸，使得相同条件下酸性的植物激素
更容易进入有机相。
2.2 固相萃取小柱的选择
固相萃取技术具有溶剂用量少、便捷、高效的
特点，比传统的液 - 液分配技术优越。通过比较
HLB和 MAX…2 种固相萃取柱的净化效果，发现…
2 种柱子纯化后的样品进行 GC-MS 分析显示：
2 种柱子对 5 种植物激素都有保留。但是考虑到
MAX柱操作过程比 HLB柱复杂，而各种植物激素
又不同程度的对光敏感，所以最终选用 HLB柱。
2.3 衍生化试剂的选择
5 种植物激素属于酸性物质，极性大，因而不能
直接用气质联用仪进行分析，需要先进行衍生化反
应。已报道的衍生化方法有硅烷化衍生法 [4] 和重氮甲
烷甲基化法 [5] 等，其中三甲基硅烷化重氮甲烷的衍生
化速度最快、反应最完全，衍生化干扰物质少。所以
本实验选择三甲基硅烷重氮甲烷正己烷溶液作为衍生
试剂，操作简单、快速、安全。
2.4 线性范围
将混合标准溶液依次稀释成50…μg/ml、25…μg/ml、…
10…μg/ml、5…μg/ml、1…μg/ml、0.5…μg/ml、…
0.1…μg/ml，然后各加入 0.1…μg二氢茉莉酸作
为内标，得系列标准溶液，按照 1.4 中的色谱 -
质谱方法进行分析，分别平行测定 5 次，取平均
值。然后以各内源植物激素的峰面积与二氢茉莉酸
峰面积之比 y(A激素/A内标 ) 对内源植物激素与二氢
茉莉酸浓度之比 x(C激素/C内标 ) 作线性回归分析，
结果见表 1。
表 1 5 种植物激素的线性回归方程和相关系数 (r2)、线性范围
植物激素名称 线性方程 相关系数 r2 线性范围 (mg/L) 最低检测限 (mg/L)
水杨酸 y=0.012x+0.0018 r2=0.9987 0.1 ～ 50 2.0×10-2
肉桂酸 y=0.166x+0.0138 r2=0.9981 0.1 ～ 50 1.5×10-2
茉莉酸 y=0.259x+0.0153 r2=0.9998 0.1 ～ 10 2.5×10-2
吲哚乙酸 y=1.504x+0.251 r2=0.9968 0.1 ～ 10 1.5×10-2
脱落酸 y=0.0422x+0.0131 r2=0.9943 0.1 ～ 10 1.0×10-2
2.5 回收率、精密度、最低检测限和定量限的
测定
按前述的步骤将已知量的混合标准溶液分别加
入 1.0… g 龙须菜中，进行回收率和精密度试验，每
个水平的试样重复测定 6次，结果见表 2。试验结果
表明本方法的回收率范围为 76.7% ～ 104.3%，精密
度为 1.4% ～ 2.9%。本方法的最低检测限是根据进
样量和信噪比的数据来确定的，最低检测限的范围在
1.0×10-2 ～ 2.5×10-2…mg/L 之间。定量限为信噪比
等于 10 时的浓度，为 0.1…mg/L。
3 小结
采用固相萃取 (SPE) 和气相色谱 - 质谱 (GC-
MS) 技术建立龙须菜体内 5 种植物激素——水杨酸
(SA)、肉桂酸(RA)、茉莉酸(JA)、吲哚乙酸(IAA)、
脱落酸 (ABA) 的提取和微量检测技术，获得满意
的分离效果和检测灵敏度；在加标水平为 100… ng、
150… ng、250… ng 时，5 种激素的加标回收率为
76.7%～104.3%，相对标准偏差(RSD)均小于3%，
方法的检出限在 1.0×10-2 ～ 2.5×10-2…mg/L 之
间，该方法简便、灵敏、准确、重现性好。
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表 2 5 种植物激素的添加回收率和精密度 (n=6)
植物激素
样品含量
(ng)
加入值
(ng)
回收率
(%)
RSD
(%)
水杨酸 39.26 100 76.7 ～ 080.1 1.7
150 87.0 ～ 090.6 2.2
250 85.9 ～ 095.0 2.8
肉桂酸 45.63 100 82.4 ～ 089.7 1.4
150 80.6 ～ 092.1 2.6
250 85.3 ～ 101.2 2.9
茉莉酸 38.70 100 77.3 ～ 088.5 2.5
150 81.4 ～ 090.9 2.3
250 95.3 ～ 100.7 1.6
吲哚乙酸 145.49 100 89.7 ～ 093.6 1.7
150 92.7 ～ 100.2 2.1
250 92.5 ～ 103.7 2.3
脱落酸 24.33 100 84.2 ～ 097.4 2.1
150 91.7 ～ 104.3 2.5
250 93.3 ～ 101.3 2.2
参考文献：
[1] 韩春梅,刘建国,张勇.不同激素配伍对雨生红球藻细胞
生长和虾青素累积的调节作用、藻株差异及应用[J].
海洋与湖沼,2009,40(4):430-436.
[2] Zeid I M.Response of bean (Phaseolus vulgaris)
to exogenous putrescine treatment under salinity
stress[J].Pakistan Journal of Biological
Sciences,2004,7(2):219-225.
[3] Eric A,Schmelz.Simultaneous analysis of
phytohormones, phytotoxins, and volatile organic
compounds in plants[J].Plan,2003,100:32-39.
[4] Zhang W.The phytohormone profile of the red alga
Porphyra perforate[J].Bot.Mar,1993,(36):257-266.
[5] Hussain A.Hydrophilic growth inhibitors from
Laminaria digitata and Ascophyllum nodosum[J].
New Phytol,1973,(72):403-410.
（上接 1页）
浓度 1…mg/ml 对 HT1080 细胞进行细胞毒性评估。
结果显示，所有的山苦瓜抽取物对于抗药性金黃色
葡萄球菌 (ATCC…33591) 与绿脓杆菌 (ATCC…27853)
的生长都没有抑制效果；部分品种的水抽物与甲醇抽
取物可抑制大肠杆菌 (ATCC…10536) 与沙门氏杆菌
(ATCC…19126) 的生长；即使将水抽物以 100℃加热
5…min，亦有抑制上述2种细菌生长的作用。2012年，
吕岳霖 [2] 等分别以冷水 ( 水抽物，H) 与甲醇 ( 甲醇
抽取物，M) 抽取进行抗氧化活性分析。结果发现品
种之间清除 DPPH自由基与氢氧自由基的活性都不
相同，最有效品种之 50% 有效浓度清除 DPPH自由
基为 181…µg/ml(H) 及…246…µg/ml(M)；最有效品种
之 50%有效浓度清除氢氧自由基为 148…µg/ml(H) 及…
37…µg/ml(M)。在抑制铜离子诱导低密度脂蛋白过氧化
活性方面，特别是甲醇抽取物 (M)在…4…000…µg/ml 浓
度下，表现出保护效果 ( 以 TBARS 表示 )，几乎与…
0.8…mM…Trolox 效果相当。以上结果显示，山苦瓜
抽取物未来也许可以开发为天然抗氧化保健食品。
5 问题及展望
目前，山苦瓜遗传育种研究仍较为薄弱，真正进
行山苦瓜育种的较少。山苦瓜的营养成分与保健功能
方面的研究也少有报道，其他方面的研究几乎是空
白。这主要归结于山苦瓜自身的市场份额占有量较少，
与普通苦瓜相比几乎可以不计。综合上述问题，以后
的山苦瓜研究需要加强以下几点。
(1) 加强各地种质资源搜集、评价及创新利用；…
(2) 加强基础性研究，如：遗传多样性分析、种质鉴
定、抗病、抗虫、耐高温、耐低温、全雌系等基础性
研究；(3) 加强产业后继产品的开发，如：山苦瓜保
健食品、山苦瓜饮料等，增强产业的可持续发展。
参考文献：
[1] 吕岳霖,刘玉华,梁文俐等.不同品种山苦瓜抗细菌与细
胞毒性之研究[J].植物学汇刊,2011,52:427-434.
[2] 吕岳霖,刘玉华,全中和等.不同品种山苦瓜抗氧化活性
研究[J].植物学汇刊,2012,53:207-214.
[3] 周友民,赵哲毅.山苦瓜萃取物活化转录因子PPARγ及
抑制巨噬细胞发炎介质之分泌[J].营养科学,2008,
33(3):108-115.
[4] 李祖强,罗蕾,黄荣等.山苦瓜化学成分及抗癌活性[J].
中国学术期刊文摘(科技快报),1998,4(6):749-751.
[5] 李祖强,罗蕾.山苦瓜有效成分的研究[J].云南大学学
报,1993,12(15):37-41.
[6] 赖正锋,张少平,李跃森等.山苦瓜栽培技术[J].现代农
业科技,2013,(1):93-93.
[7] 吴水金,李跃森,林江波等.山苦瓜冬季大棚栽培技术
[J].中国园艺文摘,2015,(7):195-196.
[8] 吴水金,张玉灿,赖正锋等.苦瓜新品种如玉45号的选育
[J].中国蔬菜,2013,(11):104-106.
[9] 罗蕾,李祖强.山苦瓜中两个乌苏烷类新三萜[J].云南
植物研究,1997,19(1):316-320.
[10] 罗蕾,李祖强,张元清.山苦瓜中三萜及甾体成分的研
究[J].药学学报,1998,33(11):839-842.