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doi:10． 15889 / j． issn． 1002－1302． 2016． 04． 081
3． 5 mg /L水杨酸诱导斜生栅藻积累虾青素
的分子机理
凌善锋，蔡福欢，刘彦文，朱 勇，韩 梁，程 淼
( 荆楚理工学院生物工程学院，湖北荆门448000)
摘要:在自然条件下，向对数生长期的斜生栅藻(Scenedesmus obliquus) 培养液中加入3． 5 mg /L 的水杨酸溶液，进
行胁迫培养以诱导藻类细胞内虾青素的合成与积累。在培养过程中，每隔 3 d对藻液取样制片，然后用显微镜观察其
生长状况及细胞形态变化。结果发现:经3． 5 mg /L水杨酸诱导的藻的形态发生了明显变化，该水杨酸溶液对于斜生
!藻细胞来说是一种逆境胁迫因子，藻细胞内通过积累高达 1． 123 mg /g的虾青素来形成一种自我保护机制。八氢番
茄红素脱氢酶(PDS) 和β－胡萝卜素加氧酶(crtO) 基因表达水平上调是藻细胞合成虾青素的主要调控机制。随着培
养时间增加，藻细胞生物量呈时间依赖性增加( 除15 d外) ，最高达2． 08×106 个 /mL。
关键词:水杨酸;斜生栅藻;形态;生物量;虾青素;分子机制
中图分类号:S917 文献标志码:A 文章编号:1002－1302(2016)04－0287－04
收稿日期:2015－11－22
基金项目:国家自然科学基金( 编号:30671394) ; 药物合成与优化湖
北省重点实验室开放基金( 编号:OPP2014YB02) ;湖北省教育厅科
学技术研究项目( 编号:Q20126101) ;荆楚理工学院引进博士科研
启动经费 ( 编号:2013BK05) ;湖北省教育厅省属高校青年教师出
国留学项目( 编号:鄂教外函［2014］59 号)。
通信作者简介:凌善锋(1971—)，男，浙江富阳人，博士，副教授，主要从
事天然虾青素的产业化研究工作。E－mail:shanfeng86@163． com。
虾青素是类胡萝卜素的含氧衍生物，属于酮式类胡萝卜
素，具有增强免疫功能等生理作用，是一种极具应用潜力的次
生代谢物质，在食品、饲料、化妆品、医药等领域有着广阔的应
用前景［1］。目前虾青素主要用于水产养殖的色素添加剂，售
价高达 1 200 万元 / t，估计全球每年需求量超过 20 亿美元。
天然虾青素的主要生产来源是雨生红球藻提取以及从红法夫
酵母菌发酵液中提取，但这些虾青素的产量远不能满足市场
需求。斜生栅藻(Scenedesmus obliquus) 是一种广泛分布于温
暖地区的池塘、沟渠及河流中的淡水单细胞绿藻，其生命力
强、繁殖快，对环境条件变化反应敏感，是培养虾青素的另一
种理想来源［2］。
藻体内虾青素的生物合成过程主要是由一些关键酶催化
—782—江苏农业科学 2016 年第 44 卷第 4 期
完成的，一般有异戊二烯焦磷酸异构酶(IPI)、八氢番茄红素
合成酶(PSY)、番茄红素－β－环化酶(LYC)、β－胡萝卜素羟化
酶(crtＲ－b)、八氢番茄红素脱氢酶(PDS)、胡萝卜素脱氢酶
(ZDS)、β－胡萝卜素酮化酶(BKT) 和β－胡萝卜素加氧酶(cr-
tO) 等［3－5］。例如，PDS和 ZDS催化无色的八氢番茄红素转化
成红色的番茄红素，crtO催化 β－胡萝卜素形成虾青素的部分
氧化反应。但是，缺乏藻体内虾青素合成的分子调控机理的
研究使得虾青素大规模商业应用受到限制。为了更好地理解
虾青素生物合成的酶基因调控机理，近年来，学者们运用荧光
定量 PCＲ来研究所测定的类胡萝卜素基因表达和虾青素的
积累之间的关系，Gao等从分子水平分析得到，25 mg /L 水杨
酸(SA) 诱导条件下雨生红球藻中虾青素的生物合成主要是
通过 ipi－1、ipi－2、psy、crtＲ－B、bkt、crtO 基因在翻译水平和 lyc
在翻译后水平的上调实现的，pds同时在翻译和翻译后 2 个水
平的上调实现。而且，ipi、crtO、bkt 基因的 5上游侧翼序列中
可能包含水杨酸(SA) 调控相关的顺式反应元件TCA－ele-
ment( 水杨酸反应元件) ，这意味着水杨酸作为虾青素合成的
有效调控子刺激形成虾青素［6］。茉莉酮酸甲酯和赤霉素诱
导开启了 3 种 bkt 基因的表达，并且学者们在该基因的 5＇侧
翼序列中识别出了顺式作用元件，因此形成了虾青素生物合
成调控网络的分子信号［7］。在氮缺乏和强光等胁迫条件下，
雨生红球藻体中 pds基因表达水平明显上调［8］。最近的研究
表明，在 0． 17 mol /L盐诱导 10 d后，雨生红球藻 QLD 株产生
17． 7 mg /g干质量虾青素，其主要原因是ipi－1、ipi－2、psy、lyc、
bkt2、crtＲ－B、crtO共 7 个虾青素的生物合成基因上调，其中前
5 个酶基因上调更明显，即:由酶IPI 催化丙酮酸盐形成二甲
基丙烯焦磷酸，由 PSY催化?牛儿焦磷酸合成四十碳的八氢
番茄红素，由 LYC 催化番茄红素环化形成 β－胡萝卜素，由
BKT催化 β－胡萝卜素形成虾青素的部分氧化反应的酶促反
应能力均得到明显加强［9］。
利用斜生栅藻生产天然虾青素具有诱人的探索前景; 但
是至今还未见用水杨酸诱导斜生!藻生产虾青素的尝试。本
试验是首次试图利用水杨酸胁迫斜生!藻培养虾青素，利用
荧光定量 PCＲ分析虾青素合成关键酶基因的新颖表达水平
谱，并且得出与之紧密相关的虾青素产量，本研究为水杨酸介
导的信号网络和虾青素生物合成通路之间的关系提供证据，
而且揭示出水杨酸在类胡萝卜素形成中起到的新多功能作
用，将为水杨酸在虾青素产业化中的大规模应用提供基础实
践知识。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
水杨酸，斜生栅藻藻种，标准培养液，摄影显微镜，台式高
速冷冻离心机，紫外分光光度计，GYB30－6A 高压均质机( 上
海东华高压均质机厂) ，超声细胞破碎仪等。
1． 2 斜生栅藻的培养
斜生栅藻株购自中国科学院武汉水生生物研究所，每个
250 mL 锥形瓶中加入培养基 150 mL，以及稀释的接种藻液
30 mL。自然光照，强度为 1 000 ～ 1 500 lx，35． 5 ℃静止培养，
直至培养到生长期，然后用 3． 5 mg /L水杨酸进行胁迫培养。
1． 3 3． 5 mg /L水杨酸对斜生栅藻生物量的影响试验
每 500 mL瓶中装 200 mL 藻液，加入水杨酸使终浓度达
到 3． 5 mg /L进行培养，共培养 18 d，每隔 3 d 考察 3． 5 mg /L
水杨酸对斜生栅藻生物量的影响，以不加水杨酸的相应处理
作为对照( 表1) ，每个培养时间3 次重复。
表 1 3． 5 mg /L水杨酸的培养时间对斜生栅藻生物量的影响
培养时间(d) 生物量(106 个 /mL)
0( 对照) 0． 90±0． 16
3 0． 93±0． 10
6 1． 05±0． 08
12 1． 09±0． 09
15 2． 08±0． 52
18 1． 97±0． 53
由表 1 可知，18 d内，各培养时间的藻细胞生物量均高于
对照，说明 3． 5 mg /L水杨酸能够促进斜生栅藻细胞生物量的
增加。且随着培养时间增加，藻细胞生物量呈时间依赖性增
加( 除15 d外) ，培养15 d 时藻细胞生物量最大，是对照的
2. 31 倍，但差异不显著(P＞0． 05)。该研究结果对于虾青素
生产具有极其重要的意义。
1． 4 显微观察
水杨酸胁迫培养后，每隔 3 d 取少量处理的藻细胞在光
学显微镜下观察 1 次( 按18 d计) 并拍照，以不加水杨酸的相
应处理作为对照，观察藻细胞的形态、颜色变化及细胞聚集情
况等。
1． 5 虾青素提取、含量测定
利用新型的高压均质破壁和虾头壳内源酶辅助提取虾青
素相结合的方法提取虾青素，具体如下:藻种预处理、高压均
质按照陈兴才等的方法［10］并进行了优化，GYB30－6A 高压均
质机进行高压均质破壁的条件为:28 ℃，42 MPa，循环 3 次;
虾头中的内源酶丰富，有活性很高的水解酶系，能有效地解离
出虾青素，利用姜淼等的方法［11］获得内源酶粗酶，51 ℃、pH
值 4． 2 条件下酶解 2 h 进行辅助提取，提取后采用高政权等
的方法［3］测定虾青素含量，共 3 次重复。
1． 6 荧光定量 PCＲ分析
按照 Gao 等的方法［9］并作改进，具体如下:mＲNA 用
SVＲNA抽提试剂盒(Promega，USA) 按照说明书进行提取，
ＲNA的浓度用 NanoDrop@ ND－1000 (Nan oDrop，USA ) 测
定，cDNA在 20 μL 体系中用 SuperScript Ⅲ第一链合成试剂
盒进行合成。用作扩增特异基因 ( 虾青素生物合成路线中的
酶) 的引物根据NCBI 数据库或库中的同源序列用 Primer
Premier 5． 0 合成，如表 2 所示。qＲT－PCＲ产物用自动移液器
移到 384 孔的板上，在 ABI StepOne Plus System (Applied Bio-
systems，USA) 中用SYBＲ 荧光绿进行定量，act 作为内标基
因。每个 PCＲ 反应包括 5 μL SYBＲ 荧光绿、1 μL 的引物复
合物( 包括正向和反向，浓度为5 μmol /L)、4 μL cDNA、2 μL
PCＲ反应缓冲液( 含Mg2+)、0． 3 μL Taq DNA聚合酶(Promega
公司)、0． 3 μL dNTP( 浓度为15 mmol /L)、超纯水。qＲT－PCＲ
的扩增条件如下:95 ℃ 3 min;95 ℃ 5 s，退火30 s( 退火温度
如表 2) ，72 ℃ 15 s，42 个循环。同一个样品同一个基因的
qＲT－PCＲ试验重复 3 次。
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表 2 用作 qＲT－PCＲ的特异引物和退火温度
引物序列(5→3) 退火温度(℃)
psyF:CGTGAGACTGCAGAATCAATTGGGG;psyＲ:CCAATTGATTCTGCAGTCTCACGAA 62
pdsF:AAACTCGCGGTCATTGGTCAAGGCG;pdsＲ:GCGCCTTGACCAATGACCGCGAGTT 66
lycF:TCCTGTCACAAACGGCAATCATGTT;lycＲ:AGTAGCTGCTCCCGGGCACTGCACA 62
crtＲ－bF:TCATTTGCTGCTACCACGATGCTGT;crtＲ－bＲ:ACAGCATCGTGGTAGCAGCAAATGA 66
bktF:CCATACTCTACATCATACATTGTTC;bktＲ:GAACAATGTATGATGTAGAGTATGG 55
ipi－1F:ACGCATATCCCCCGCGTGAACTCCG;ipi－1Ｒ:ATGCTCCTGAGCTTAAACTGGAGGTC 63
ipi－2F:GCCCGGCGGCAGTCCGATGACG;ipi－2Ｒ:GCGGAGTTCACGCGGGGGAAATGC 61
crtOF:GGCTGGTGTGAGGGTCAGTGGGT;crtOＲ:CTGACCCAACGACCATCACCCACTG 70
zdsF:GTGCTTGACATTGCGACACTTGCCC;zdsＲ:GTGGGCAAGTGTCGCAATGTCAAGC 65
actF:TGCCGAGCGTGAAATTGTGAGG;actＲ:CGTGAATGCCAGCAGCCTCCA 55
注:psy为八氢番茄红素合成酶基因;pds为八氢番茄红素脱氢酶基因;lyc为番茄红素－β－环化酶基因;crtＲ－b 为 β－胡萝卜素羟化酶基因;
bkt为 β－胡萝卜素酮化酶基因;ipi为异戊二烯焦磷酸异构酶基因;crtO为 β－胡萝卜素加氧酶基因;zds为胡萝卜素脱氢酶基因。
2 结果与分析
2． 1 显微观察
显微观察得到: 对照组( 不加水杨酸) 细胞两端尖细变
椭，并且以 4 个或 2 个为群体的形式存在( 图1 － 1)。
3． 5 mg /L水杨酸培养 3 d 后，藻细胞形态变化较明显( 图1－
2)。3． 5 mg /L处理组培养 6 d 后，观察细胞形态，细胞变大
变圆甚至出现不规则形状，并有微红色出现( 图1－3) ，说明
虾青素开始逐渐在斜生栅藻细胞中积累。培养 9 d 后，原本
的青绿色细胞逐渐变淡，最后转为微红色，同时藻类数量明显
增多，细胞的形态也由两端尖细逐渐膨胀、变圆甚至有不规则
形态( 图1－4) ;而且，以4 个细胞的群体形式存在的细胞群体
解散，分为单个细胞。3． 5 mg /L 水杨酸培养 12 d 后，培养液
中藻细胞内有明显的红色，推测虾青素积累在增加( 图1 －
5)。培养 15 d后，细胞继续胀大变椭、变红，一些细胞开始聚
堆，而且细胞内红色明显加深( 图1－6)。培养 18 d 后，细胞
中虾青素的积累少量增加，仍然是 3． 5 mg /L培养液中藻细胞
内红色积累最多，但细胞出现了自溶现象( 图1－7)。
2． 2 虾青素含量测定
在 3． 5 mg /L 水杨酸胁迫培养组，随着藻细胞培养时间的
延长( 除了15 d) ，虾青素的积累量在逐渐增加。方差分析表
明，12、15、18 d斜生栅藻体内虾青素含量与对照相比有显著
差异(P＜0． 05) ( 图2)。
2． 3 荧光定量 PCＲ分析
与虾青素含量相对应，荧光定量 PCＲ 分析表明:15、18 d
斜生栅藻体内虾青素合成基因 pds和 crtO的表达水平与对照
相比有显著差异(P＜0． 05) ，12 d后 crtO和 18 d后 ipi基因表
达水平与对照相比都有显著差异(P＜0． 05) ( 图3)。图 4 分
析表明:bkt和 psy基因表达水平随着水杨酸处理呈现时间依
赖性地增加。
3 结论与讨论
近些年来，虾青素一直是国际学术界的研究热点之一。
学者们从雨生红球藻、甲壳类等生物中提取虾青素已经取得
—982—江苏农业科学 2016 年第 44 卷第 4 期
一些较好的研究成果［4－5］。自从 2008 年 Qin等发现斜生栅藻
能在逆境胁迫条件下迅速合成和积累虾青素以来［2］，斜生栅
藻可能就是下一个天然虾青素产业化的热点藻类。水杨酸作
为一种新的植物内源激素，它不仅能调节植物的一些生长发
育过程，而且是一种能够激活植物一系列防御防卫反应的重
要内源信号分子，藻体内可能存在虾青素合成基因调控相关
的水杨酸反应元件［3］。学者们研究了水杨酸对雨生红球藻
抗氧化系统的影响，发现 500 μmol /L水杨酸使受光线胁迫的
雨生红球藻体内的超氧化物歧化酶和抗坏血酸过氧化物酶活
性分别增加 4． 5 和 15． 5 倍［12］，5． 0 mg /L 水杨酸能明显促进
雨生红球藻积累虾青素，一方面加快虾青积累进程，另一方面
虾青素产量显著提高［3］。近年来，对雨生红球藻中虾青素合
成关键酶基因的转录调控机制进行了研究，结果表明，在营养
胁迫、光线胁迫等逆境条件下，通过运用荧光定量 PCＲ 等技
术得出雨生红球藻体内控制虾青素合成的多个关键酶基因如
β－胡萝卜素酮基化酶、β－胡萝卜素水解酶、番茄红素－β－环
化酶等明显上调［8，13－14］。一定质量浓度的水杨酸作为一种诱
导因子能促进雨生红球藻积累虾青素，水杨酸构筑了虾青素
生物合成调控网络的分子信号。从分子水平分析得到，水杨
酸诱导了 8 个类胡萝卜素基因转录水平的表达，其中 β－胡萝
卜素酮基化酶基因和 β－胡萝卜素羟化酶基因表达水平的上
调是水杨酸压力胁迫下雨生红球藻大量积累虾青素的原因之
一［6］。在本研究中，八氢番茄红素脱氢酶(PDS) 和β－胡萝卜
素加氧酶(crtO) 的5上游侧翼序列中可能包含水杨酸调控相
关的顺式反应元件即水杨酸反应元件，水杨酸对斜生栅藻中
虾青素的积累具有一定影响，推测 3． 5 mg /L的水杨酸的加入
会诱导开启这些作用元件，诱导这 2 个非关键限速酶基因大
量表达，从而明显增加了藻细胞虾青素的积累量，这也是它积
累虾青素比雨生红球藻少的原因之一。
综合上述试验结果，分析得出如下 3 点结论: (1) 在
3． 5 mg /L 水杨酸胁迫培养下，斜生栅藻的细胞形态出现明显
的变化;(2) 用3． 5 mg /L的水杨酸诱导 18 d后斜生栅藻细胞
胀大变椭圆且颜色呈红褐色，此时虾青素积累最快、最多、最
佳;(3)3． 5 mg /L的水杨酸溶液对于斜生!藻细胞来说是一
种逆境胁迫因子，藻细胞内积累高达 1． 123 mg /g 的虾青素来
形成一种自我保护机制。
在产业化实践中，除了对产虾青素的斜生栅藻藻种进行
培育［15］外，可以考虑在诱导初期添加 3． 5 mg /L 的水杨酸溶
液来提高斜生!藻的饲料用价值。
致谢:本论文在美国费城完成，感谢美国农业部 (USDA)
东部研究中心(EＲＲC)John Nghiem研究员的指导和帮助。
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