全 文 ：[ 文章编号] 1000-8861(2009)02-0117-05
龙须菜对小鼠脾脏淋巴细胞内 TGF-β表达的影响
余　江1 ,2 ,林　羿3 ,狄静芳3 ,杨宇峰2＊
作者单位:1.广东药学院公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学系;
2.暨南大学水生生物研究所 广东省教育厅水体富营养化与赤潮
防治重点实验室;3.暨南大学组织移植与免疫研究中心
收稿日期:2008-09-01;修回日期:2008-12-08
基金项目:国家 863项目(2007AA09Z436), 国家基金委-广东省联
合基金(U0633006),国家自然科学基金面上项目(30672231)资助
＊通信作者:杨宇峰 , 暨南大学水生生物研究所 广东省教育厅水
体富营养化与赤潮防治重点实验室 , 广州 510632;Tel:020-
85226913;E-mail:tyyf@jnu.edu.cn
[ 摘　要] 　目的　研究大型海藻龙须菜提取物对小鼠脾脏淋巴细胞内 TGF-β 表达的影响 , 并初探其免疫调控作用机制。
方法　以大型海藻龙须菜为实验材料 ,采用流式细胞术对 Balb c 小鼠脾脏淋巴细胞进行表型分析 , 检测了不同浓度龙须菜提
取物共培养条件下CD45+细胞内转化生长因子(TGF-β)表达水平的变化 ,并对产生 TGF-β 的细胞进行身份鉴定。结果　龙须菜
提取物不同反应浓度处理条件下 Balb c小鼠脾脏淋巴细胞中 CD45+CD83+ CD45 +及 CD45 +CD80+ CD45+细胞百分率与对照
组比较无显著性差异(P>0.05), 但 CD45 +TGF-β CD45+细胞百分率与龙须菜提取物反应液浓度则呈明显的线性剂量依赖关系
(r2=0.814 5 , P<0.05), 最适反应相对百分浓度为 2%。TGF-β 主要来源于 CD3 +T 细胞(约占 35.4%)和 CD49b+ NK 细胞(约
占 46.6 %)。结论　提示龙须菜提取物具有通过 TGF-β 进行免疫抑制或生物调节的功能。
[ 关键词] 　龙须菜;CD45;TGF-β;流式细胞仪
[ 中图分类号] 　R931.77;R967　　　　[ 文献标志码] 　A
Effects of Gracilaria lemaneiformis on TGF-β expression in the splenic lymphocytes of Balb c mice
YU Jiang , LIN Yi , DI Jingfang , YANG Yufeng
School of Public Health , Guangdong Pharmaceutical University , Guangzhou 510006 , China
[ Abstract] 　Objective　To explore the effects of Gracilaria lemaneiformis extraction on the expression of transforming growth factor β
(TGF-β)in the splenic lymphocytes of Balb c mice and to investigate the immunomodulatory mechanisms of the seaweed.Methods　Lympho-
cyte phenotyping was performed with flow cytometry.The expression of TGF-β in CD45+ cells was detected under Gracilaria lemaneiformis ex-
traction of different concentrations and those TGF-β producing cells were identified.Results　No statistical difference in CD45+CD83+ CD45 +
and CD45+CD80+ CD45 + cell percentage was observed between the Balb c mice treated with Gracilaria lemaneiformis extraction of different
concentrations and the control group(P>0.05).The CD45+TGF-β CD45+ rate was obviously related with the seaweed extraction concentra-
tion in a dose-dependent manner(r2=0.814 5 , P <0.05), and the best relative concentration of Gracilaria lemaneiformis extraction for reac-
tion was 2%.TGF-β was mainly derived from CD3 + T cells and CD49b+ NK cells , accounting for 35.4% and 46.6%, respectively.Con-
clusion　The research indicts the effective components of the seaweed have different immunomodulatory effects.
[ Key words] 　Gracilaria lemaneiformis;CD45;TGF-β;flow cytometry
　　红藻是一类极具开发潜力和重要生物医学作用
的大型海藻 。大量的动物实验和临床试验表明红藻
提取物有免疫调节 、抗肿瘤 、降血脂 、抗氧化 、抗凝
血 、抗病毒 、抗菌 、抗炎等生理活性[ 1-4] 。以往的研
究主要对紫菜多糖提取物的免疫调节及抗肿瘤作用
进行了较为深入的研究 ,而对其它红藻如龙须菜等
免疫调节作用的研究则未见系统性报道 。
龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)是一种重要的
产琼胶大型经济红藻 , 其藻体含胶量高达 20%～
30%。近年来随着人工养殖规模的不断扩大和产量
的迅速增加 ,龙须菜功能与应用已逐渐受到广泛的
关注。目前对龙须菜的研究多集中于形态学 、琼胶
化学 、藻胆蛋白的基因表达 、光谱特性及其作为环境
生物作用材料等方面[ 5-8] 。而关于龙须菜生物医学
方面的研究报道甚少 ,目前仅限于采用微核实验 、抗
精子畸变实验等观察龙须菜提取物对环磷酰胺(CP)
诱发的突变有明显抑制作用 ,并表现出一定的量效
关系。也有学者采用称重法研究发现龙须菜提取物
具有一定的抗肿瘤作用[ 9-10] 。
龙须菜可能具有免疫调节和抑制肿瘤活性的能
力 ,但以往的研究所采用的方法过于笼统单一 ,而且
所测定的指标也不能完全和准确地反映出龙须菜提
取物的免疫调节和抗瘤肿水平 。本研究采用流式细
胞术对 Balb c小鼠脾脏淋巴细胞进行表型分析 ,检
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DOI :10.13431/j.cnki.immunol.j.20090034
测在不同浓度的龙须菜提取物影响下 CD45+细胞内
TGF-β表达水平的变化 ,并对产生TGF-β的细胞进行
身份鉴定。旨在研究龙须菜提取物对小鼠脾脏淋巴
细胞内转化生长因子 β(TGF-β)表达的影响 ,从分子
水平揭示龙须菜提取物的免疫调节及抑制肿瘤活性
的能力。
1　材料与方法
1.1　龙须菜　采自广东省南澳县 。
1.2　实验动物及试剂　清洁级 Balb c 小鼠 ,10 ～ 12
周龄 ,雌雄各半 ,由中山大学实验动物中心提供。除
特殊标明外 ,单克隆抗体均购于美国 eBioscience 公
司:FITC-和 PE-结合的抗 CD45(简称 FITC-CD45 和
PE-CD45)、PE-CD3 、PE-CD14 、PE-CD49b 、PE-CD83 、
PE-IL12 、FITC-CD3 、FITC-CD11c 、FITC-49b 、FITC-TNF-
α、APC-MHC-Ⅱ 、TGF-β 、FITC-antimouse Ig 。
1.3　龙须菜提取物反应液配制　称取龙须菜鲜重
0.5 g ,剪碎置于研钵中 ,用 5 mL PBS研磨成匀浆并
反复提取 ,获得龙须菜提取物母液相对百分浓度为
100%。用 0.22μm 孔径过滤器(Millipore公司产品)
过滤除菌后配制反应溶液 ,设置 4个相对百分浓度
分别为 0.08%、0.4%、2.0%、10%,另设一个空白
对照 。
1.4　小鼠脾脏淋巴细胞制备　引颈脱臼法处死小
鼠以 75%的乙醇溶液浸泡消毒 。取出脾脏后用 PBS
缓冲液清除血液 ,研磨脾脏并挤压过 200 目筛网 。
反复冲洗网膜 ,用淋巴细胞分离液收集细胞悬液 ,离
心(4 ℃,1 500 r min , 15 min)。重复上述操作 2次 ,
以清除可能混杂的红细胞。用 RPMI-1640 培养液轻
轻吹打细胞制成悬液 ,按 4×105 mL-1将细胞转入细
胞培养瓶中 , 于 37 ℃、5%的 CO2 细胞培养箱中
培养 。
1.5　抗体染色方案
1.5.1　抗体双色 、三色染色方案 1　1)FITC-CD45
(绿色),PE-CD45(红色);2)FITC-CD45 ,PE-CD83(红
色);3)FITC-CD45 , PE-IL12(红色);4)PE-CD45 ,
FITC-TNF-α(绿色);5)FITC-CD45 , PE-CD83 , APC-
MHC-Ⅱ(蓝色);6)FITC-CD45 , PE-CD83 ,APC-80(蓝
色);7)PE-CD45 ,TGF-β ,FITC-anti mouse Ig(绿色)。
1.5.2 　抗体双色染色方案 2　1)FITC-CD45(绿
色),PE-CD45(红色);2)FITC-CD45 ,PE-CD3(红色);
3)FITC-CD45 , PE-CD14(红色);4)PE-CD45 , FITC-
CD3(绿色);5)PE-CD45 ,FITC-CD11c(绿色);6)PE-
CD45 , FITC-CD49b(绿色);7)PE-CD3 , TGF-β , FITC-
anti mouse Ig(绿色);8)PE-CD49b(红色), TGF-β ,
FITC-anti mouse Ig(绿色)。
将经过 1.4方法培养 1 ～ 2 d的小鼠脾脏淋巴细
胞接种于 24孔板 。孔板加样按空白对照 、龙须菜提
取物 4个反应液浓度梯度及不同染色条件共采用
32个孔 。每孔加细胞悬液 100 μL ,并加入不同浓度
的龙须菜提取物使最终浓度达到所需浓度。置 5%
CO2培养箱中 37 ℃培养 。将经过 6 ～ 7 d培养的淋巴
细胞多次吹打 , 细胞吹散后转入流式管 。离心
(1 200 r min ,5 min),弃上清液 ,每支管加入经 37 ℃
孵育的裂解液 2 mL , 并在恒温箱孵育 10 min ,离心
(1 200 r min ,5 min),弃去上清液 。按 1.5.1的染色
方案 1 , 将纯化后的细胞用细胞膜通透液(美国
eBioscience公司)悬浮 ,4 ℃孵育 1 h ,离心后弃上清
液 。加入 PE-、FITC-或APC-标记的抗小鼠细胞因子
10μL 。室温下避光孵育 20 min ,采用 FACSCalibur
流式细胞仪检测 , 专用 CellQuest 软件进行分析
(美国 Becton Dickinson公司)。
1.6　细胞内细胞因子检测　将经过上述方法培养1 ～
2 d的小鼠脾脏淋巴细胞接种于 24孔板 。孔板加样
按空白对照 、龙须菜提取物最佳反应液浓度及不同
染色条件分为 11组 。每组 2个复孔。每孔加细胞
悬液 100 μL ,并加入最佳反应浓度的龙须菜提取物
使最终浓度达到所需浓度 , 调总反应浓度相同 , 置
5%CO2 培养箱中 37 ℃培养 。将经过 6 ～ 7 d培养的
淋巴细胞多次吹打 ,细胞吹散后转入流式管 。离心
(1 200 r min ,5 min),弃上清液 ,每支管加入经 37℃
孵育的裂解液 2 mL ,并在恒温箱孵育 10 min ,离心
(1 200 r min ,5 min),弃去上清液。按 1.5.2的染色
方案 2 , 将纯化后的细胞用细胞膜通透液(美国
eBioscience公司)悬浮 ,4 ℃孵育 1 h ,离心后弃上清
液 。加入 PE-、FITC-标记的抗小鼠细胞因子 10 μL 。
室温下避光孵育 20 min ,用流式细胞仪检测。
1.7　双阴性对照　用 FITC-、PE-或APC-标记的同
型抗体(美国 eBioscience 和BD公司)染色 ,设置适当
的阈(gate threshold)用以捕获淋巴细胞 ,检测结果作
为双阴性对照。
1.8　统计学分析　应用 SPSS 11.0 统计软件 , t 检
验分析实验结果 。
2　结果
2.1　CD45+细胞组成(或亚群)分析　检测龙须菜
提取物不同反应浓度处理条件下 Balb c小鼠外周血
单个核细胞(PBMC)中 CD45+CD83+ CD45+细胞百
分率 、CD45+CD80+ CD45+细胞百分率 ,发现各浓度
梯度组的上述百分率与对照组相比 ,无显著性差异
(P >0.05)。
对龙须菜提取物相对百分浓度为 2%处理
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Balb c小鼠的 CD45+细胞亚群进行检测 ,结果见图 1
和图 3。CD45+CD3+ CD45+细胞百分率显著高于其
它细胞百分率(P <0.05), 其次是 CD45+ CD14+
CD45
+细胞百分率较高 ,但与 CD45+CD49b+ CD45+
细胞百分率比较无显著性差异(P>0.05)。
图 1　Balb c小鼠 CD45 细胞亚群分析
Fig 1　Analysis of CD45 cell subsets in Balb c mice
2.2　脾淋巴细胞内细胞因子表达　用流式细胞术
检测龙须菜提取物不同反应浓度处理条件下 Balb c
小鼠脾脏淋巴细胞内 TNF-α、IL-12 、TGF-β等细胞因
子表达 。结果显示 ,不同反应浓度处理后 , CD45+
TNF-α CD45+ 、CD45+ IL-12 CD45+脾淋巴细胞百分
率与对照组比较无显著性差异(P >0.05)。而
CD45
+
TGF-β CD45+脾淋巴细胞百分率与对照组比
较则有显著性差异(P <0.01 , 图 2), 并且 CE45+
TGF-β CD45+脾淋巴细胞百分率与龙须菜提取物反
应液浓度呈明显的剂量依赖关系(图 2g),即随着龙
须菜提取物反应液浓度增加 ,TGF-β调控水平增强 ,
提示龙须菜提取物可能存在免疫抑制剂功能 ,具有
抗炎 、抗过敏或抑制肿瘤活性等作用。由图 2 还可
证实龙须菜提取物使脾淋巴细胞 TGF-β因子表达增
强的最佳相对百分浓度为 2%。
图 2　Balb c小鼠脾脏淋巴细胞内TGF-β 流式细胞仪检测结果
Fig 2　TGF-β in the splenic lymphocytes of Balb c mice detected with flow cytometry
2.3　TGF-β 阳性细胞身份　分别采用 PE-CD3 和
TGF-β ,FITC-anti mouse Ig 以及 PE-CD49b 和 TGF-β ,
FITC-anti mouse Ig染色发现 ,用龙须菜提取物相对百
分浓度为 2%处理 Balb c 小鼠外周血单个核细胞
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(PBMC)中 , CD3+ TGF-β CD3+ 和 CD49b +TGF-β
CD49b
+细胞百分率分别为 40.2 %、73.4 %,与对照
组0.4 %比较均有显著性差异(P <0.05)(图 3)。
提示 Balb c小鼠 TGF-β主要来源于 CD3+T 细胞(约
占 35.4%)和 CD49b+NK细胞(约占 46.6%)。结合
CD3
+和 CD49b+细胞在CD45细胞亚群中所占比例 ,
发现CD45细胞中占较小比例的 CD49b+细胞却在促
使 TGF-β表达上调节方面可能起着更主要的作用 。
图 3　相对百分浓度 2%龙须菜提取物处理 Balb c小鼠脾脏淋巴细胞流式细胞仪检测结果
Fig 3　Flow cytometric analysis of Balb c mouse splenic lymphocytes treated by 2% Gracilaria lemaneiformis extraction
3　讨论
医学研究表明 ,机体组织细胞的凋亡 、疾病的发
生与机体免疫系统的结构组成和免疫功能有关 ,如
果正常机体的免疫系统不能对细胞的凋亡进行调
控 ,相应组织器官就会发生病变 ,所以通过提高患者
免疫功能来增强机体抗病力的治疗方法受到了前所
未有的关注。从研制创新药物角度出发 ,研究开发
以传统中药为来源的新型免疫活性药物成为当前的
热点 ,海洋免疫药物的研究即为其中一个重要方向 。
在海洋药物中 ,具有清热解毒 、活血化瘀 、泻下驱虫
之功效的海藻很多 , 如石莼 、浒苔 、蜈蚣藻等[ 11] ,因
此对海藻进行免疫活性研究很有必要。
流式细胞术能够对大量细胞(本研究每份样品
检测 104 个细胞)及多种细胞因子进行检测 、比较 ,
并且能同时对产生细胞因子的细胞进行身份鉴定 ,
与研究细胞因子的其它方法相比 , 有其独到之
处[ 12-13] 。为此 ,本研究尝试借助流式细胞术检测小
鼠脾脏淋巴细胞表型及CD45+细胞内细胞因子的表
达 ,揭示龙须菜提取物对小鼠脾脏淋巴细胞的免疫
机理。
CD45(白细胞共同抗原)可通过自身磷酸化作用
和使其它分子去磷酸化而调节细胞信号传递 ,在绝
大多数白细胞表面有表达[ 14] 。本研究结果也证实
多数 Balb c 小鼠脾脏淋巴细胞表面 CD45+均有表
达 ,可作为鉴别淋巴细胞和其它类型细胞的标志物 。
而 CD80和 CD83 抗原作为共刺激分子在树突状细
胞(DC)表面有表达。本研究把它们用作小鼠 DC 细
胞的特异性标志物 ,发现经龙须菜提取物不同反应
浓度处理后 Balb c 小鼠脾脏淋巴细胞中 CD45+
CD83
+ CD45+及 CD45+CD80+ CD45+细胞百分率并
没有增高 ,与对照组无明显差异 ,提示无论是低剂量
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还是高剂量龙须菜提取物作用对共刺激分子的表达
无显著影响。
TGF-β在体内外具有广泛的生物学功能 ,包括
调控细胞生长 、调节细胞表型 、抑制肿瘤生长等作
用。TGF-β受体广泛表达于机体组织细胞 ,由于体
内大部分的正常细胞均表达 TGF-β家族成员的膜结
合受体 ,TGF-β与其受体具有高度特异的亲和力 ,因
此 ,TGF-β对许多细胞都发挥调节作用[ 15-16] 。本研
究发现 ,随着龙须菜提取物反应相对百分浓度的增
加 ,CD45+TGF-β CD45+细胞百分率上升 ,TGF-β调控
作用增强 ,并且在反应相对百分浓度大于 2%时 ,
CD45
+
TGF-β CD45+细胞百分率趋于稳定。表明龙
须菜的提取物具有免疫抑制增强功能 ,可调节 TGF-
β抑制作用水平 ,可能在抑制各种炎症反应 ,促进伤
口 、创面及溃疡愈合以及抗过敏抗肿瘤等方面发挥
重要作用 。近年来的研究发现 , TGF-β 对肿瘤的作
用实际上极其复杂 ,即在肿瘤的发生发展过程中表
现出两种截然相反的作用:在肿瘤生长早期 ,TGF-β
通过抑制内皮细胞增殖使肿瘤表达少量的 TGF-β ,
可作为肿瘤的抑制物 ,但随着肿瘤的进展 ,恶性肿瘤
细胞常常分泌大量的细胞因子 ,并获得了由其导致
的对生长抑制的耐受 ,造成恶性肿瘤的异常增殖 ,表
达较多的 TGF-β , 此时它成为促进肿瘤生长的物
质[ 17] 。因此 ,如何在肿瘤生长早期阶段利用龙须菜
提取物使 TGF-β 表达上调 ,充分抑制恶性肿瘤细胞
增殖 ,促使其凋亡 ,阻止肿瘤进一步发展等机理还有
待更深入的研究 。鉴于在龙须菜有效成分作用下 ,
共刺激分子的表达水平无显著改变 ,提示这些有效
成分可能是以 “非共刺激分子依赖”的模式诱导
TGF-β表达上调 。
为进一步明确 TGF-β 细胞的身份 ,本研究分别
采用 CD3和 CD49b作为 T细胞和 NK细胞的广泛标
志物 ,检测 Balb c 小鼠脾脏淋巴细胞内 TGF-β 的表
达情况 , 发现 TGF-β 主要来源于 CD3+细胞和
CD49b
+细胞 ,而其中又以 CD49b 细胞中的 TGF-β 表
达水平较高。表明在淋巴细胞中为数不多的 CD49b
NK细胞却能极好地促进 TGF-β表达 ,而 TGF-β功能
适度上调则可有效地将肿瘤细胞或癌变细胞终止在
早期生长阶段 ,但为何少量的CD49bNK细胞反而对
TGF-β表达水平上调起主要作用的相关机理也还有
待于深入的研究 。
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(编辑　侯　瑞)
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