全 文 ：第 39 卷第 12 期
2015 年 12 月
水 产 学 报
JOUＲNAL OF FISHEＲIES OF CHINA
Vol． 39，No． 12
Dec．，2015
文章编号:1000 － 0615(2015)12 － 1788 － 11 DOI:10． 11964 / jfc． 20150309742
http:∥www． scxuebao． cn
收稿日期:2015-03-02 修回日期:2015-07-22
资助项目:国家自然科学基金(31072229;41376151)
通信作者:徐年军，E-mail:xunianjun@ nbu． edu． cn
24 －表油菜素内酯对海洋红藻龙须菜琼胶合成
及其相关基因表达的影响
汤小彬1，2， 徐年军1，2* ， 孙 雪1，2， 李亚鹤1，2， 张 琳1，2
(1. 宁波大学应用海洋生物技术教育部重点实验室，浙江 宁波 315211;
2. 宁波大学海洋学院，浙江省海洋生物工程重点实验室，浙江 宁波 315211)
摘要:为了探讨外源 24 －表油菜素内酯(24 － epiBL)对不同温度下龙须菜生长及琼胶含量的
影响，并揭示琼胶含量与葡萄糖磷酸变位酶基因(pgm)和甘露糖磷酸变位酶基因(pmm)表达
量之间的关系，研究了不同浓度 24 － epiBL 对 3 种温度培养条件下龙须菜的生长、琼胶含量及
2 种琼胶合成相关基因表达的影响。结果显示在 15 和 31 ℃培养时，添加 0. 1 mg /L 的 24 －
epiBL 时龙须菜相对生长速率最高，分别为 9. 22% /d 和 11. 73% /d;而在 25 ℃培养时，
0. 5 mg /L的 24 － epiBL 对龙须菜生长促进作用最强，相对生长速率为 14. 98% /d;在 15 ℃培
养时，0. 5 mg /L 的 24 － epiBL 添加后琼胶含量最高，为 7. 76%;而 25 和 31 ℃ 时则是
1. 0 mg /L的 24 － epiBL 添加后琼胶含量最高，分别为 9. 82%和 6. 60%。本研究还扩增得到了
分别编码 585 和 249 个氨基酸的 pgm和 pmm基因，这 2 条基因都与皱波角叉菜的相应基因相
似性最高;利用实时荧光定量 PCＲ 检测 pmm 和 pgm 基因的相对表达量，结果显示在 15 ℃
时，24 － epiBL 浓度为 0. 5 mg /L 时 pgm表达量最高，为对照组的 1. 72 倍;在 25 和 31 ℃时，
24 － epiBL 浓度为 1. 0 mg /L 时 pgm表达量最高，分别为对照组的 2. 38 倍和 1. 51 倍;而 3 种
温度培养下 24 － epiBL 对 pmm 基因的表达也具有一定的促进作用。研究表明，一定浓度的
24 － epiBL能促进龙须菜的生长和琼胶合成，并且 pgm基因的表达量与琼胶含量密切相关，能
在一定程度上指示琼胶含量的高低。
关键词:龙须菜;24 －表油菜素内酯;生长;琼胶;基因表达量
中图分类号:Q 785;S 968． 4 文献标志码:A
龙须菜(Gracilariopsis lemaneiformis)是一种
大型海藻，属于红藻门(Ｒhodophyta)、江蓠科
(Gracilariaceae)、龙须菜属(Gracilariopsis)。野
生龙须菜适宜的生长温度为 11 ～ 23 ℃［1］，经过人
工筛选获得的龙须菜 981 品系适宜温度范围扩
大，最高温度为 26 ℃［2］。高温对龙须菜的生理影
响很大，会引起蛋白质变性，酶活降低，细胞结构
破坏等;而低温条件下龙须菜生长过于缓慢。
龙须菜中琼胶含量高达 20%以上，所产琼胶
经改性后质量是江蓠中最好的［3］。琼胶是一种
亲水性胶体，由 β － D-半乳糖和 3，6 －内醚-L-半
乳糖交联而成，在食品、生物工程和医药等领域都
有重要的应用价值。琼胶的生物合成过程分为 3
个阶段:第一阶段包括卡尔文循环和单糖的磷酸
化;第二阶段始于葡萄糖 － 1 －磷酸和甘露糖 － 1
－磷酸的生成，终于 UDP － D-半乳糖和 GDP-L-
半乳糖的生成;第三阶段包括聚合物的生成和修
饰，推测第二个阶段在琼胶的合成过程中发挥了
重 要 作 用［4］。 葡 萄 糖 磷 酸 变 位 酶
(phosphoglucomutase，PGM)催化葡萄糖 － 6 －磷
酸和葡萄糖 － 1 － 磷酸之间的互相转变［5］，甘露
糖磷酸变位酶(phosphomanomutase，PMM)催化
12 期 汤小彬，等:24 －表油菜素内酯对海洋红藻龙须菜琼胶合成及其相关基因表达的影响
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甘露糖 － 6 －磷酸转化为甘露糖 － 1 －磷酸［6］。
油菜素内酯(brassinolide)是迄今发现的唯一
与动物甾体激素相似的植物内源甾体类活性物
质，能促进 DNA、ＲNA 和蛋白质的合成，提高抗
氧 化 酶 活 性 等［7］。 24 － 表 油 菜 素 内 酯
(24-epibrassinolide，24-epiBL)作为人工合成的油
菜素内酯类似物，对逆境胁迫下植物的种子萌发、
幼苗生长、脂质过氧化、脯氨酸含量等都有重要的
调节作用［8］。
实验针对不同浓度 24 － epiBL 对不同温度下
龙须菜的生长速率、琼胶含量以及琼胶合成途径
中葡萄糖磷酸变位酶基因(pgm)和甘露糖磷酸变
位酶基因(pmm)表达量的变化进行研究，旨在探
讨外源 24 － epiBL 对不同温度下龙须菜生长及琼
胶含量的影响，并揭示琼胶含量与 pgm和 pmm基
因表达量之间的关系。
1 材料与方法
1. 1 实验材料与培养
实验用龙须菜 981 品系采自浙江温州海域，
用消毒海水清洗后，实验室培养。实验前，先将健
康藻体放于光照培养箱中预培养 48 h，培养条件:
光照强度 40 mol photons /(m2·s) ，光周期 L∶ D
(12∶ 12) ，盐度 30。实验设置 15、25 和 31 ℃ 3 个
温度组，用 24-epiBL 母液和灭菌海水配制 0、
0. 02、0. 1、0. 5 和 1 mg /L 共 5 个浓度的培养基，
其中 0 mg /L 为对照组。每组 3 个重复，每瓶放
入 4 g 左右经预培养、健康的龙须菜藻体。24 h
后，每瓶称取 100 mg 左右的藻体投入液氮中保
存，提取 ＲNA;剩余的藻体称量后，放 60 ℃烘箱
中至恒重，提取琼胶。48 h 后的处理方法与 24 h
实验相同。
1. 2 相对生长速率(ＲGＲ)的测定
通过测定龙须菜培养 2 d 后藻体鲜重的变化
来计算相对生长速率 (relative growth rate，
ＲGＲ)［9］:
ＲGＲ(% /d)=(lnW t-lnW0)/ t × 100%
式中，W0为实验开始时的鲜重(g) ，W t为实验结束
时的鲜重(g) ，t为实验天数(d)。
1. 3 琼胶的提取
参考文献［10］的方法，稍加改动。称量藻体，
每 0. 1 g 干重的藻体添加 4 mL 2. 5%NaOH溶液，
放入 85 ℃恒温水浴 2 h。用 2 层 300 目筛绢网过
滤洗涤藻体至 pH 值 6. 5 左右，再用蒸馏水冲洗 2
～3遍。将水洗后的龙须菜放入三角锥形瓶中，每
0. 1 g干重的藻体添加 6 mL 蒸馏水。锥形瓶用棉
花塞封口，置于 120 ～125 ℃的高压锅中煮 2 h。降
温至 80 ℃后，用 2 层纱布和 4 层 300 目的筛绢网
重叠，用力挤压过滤。过滤物在室温凝固后，放入
－20 ℃冰箱冷冻过夜。解冻后用蒸馏水冲洗，于
60 ℃烘 24 h至恒重，称量琼胶干重。
琼胶含量(%)=琼胶干重 /藻体干重 ×100%
1. 4 pmm和 pgm基因的克隆
总 ＲNA 的提取及反转录 取 100 mg 左右
新鲜的龙须菜藻体，液氮研磨后收集至含 10 L
β －巯基乙醇的 500 L ＲB 裂解液的离心管中，立
即漩涡混匀 30 s。之后按照 Plant ＲNA Kit 试剂
盒(OMEGA 公司)的操作进行 ＲNA 的提取。将
经过电泳检测和 Nanodrop 测定浓度和纯度后的
ＲNA 反转录成 cDNA(PrimeScriptTM ＲT reagent
Kit，TaKaＲa) ，－ 20 ℃冷冻保存。
pmm、pgm和 β-actin基因部分片段的获得
采用 PCＲ 的方法获得 pmm、pgm 和 β-actin 基
因的部分片段。扩增 pmm 和 pgm 所用的引物根
据本课题组龙须菜转录组测序结果而设计(表 1，
P1 ～ P4) ，β-actin 引物是根据 NCBI 数据库中相
关物种的同源序列而设计(表 1，P5 和 P6)。以
cDNA 为模板，扩增得到 pgm、pmm 和 β-actin 的
基因片段。PCＲ 扩增于 Eppendorf PCＲ 仪中进
行，采用 20 L 反应体系。2 个基因的退火温度都
为 60 ℃。PCＲ 产物用 1% 的琼脂糖凝胶电泳
检测。
回收和测序 PCＲ产物用 GenClean琼脂糖
凝胶 DNA 回收试剂盒(GENEＲAY 公司)进行回
收，将回收的目标片段连接到 pMD18-T 载体上，转
化 E． coli DH5a 感受态细胞(TaKaＲa 公司)。用
M13F /M13Ｒ为引物，进行 PCＲ 扩增反应，鉴定长
出的菌落，将检测有正确大小插入片段的重组菌落
送去测序(华大基因科技股份有限公司)。
序列分析 用 OＲF Finder(http:/ /www ．
ncbi． nlm． nih． gov /gorf /gorf． html)推测开放阅读
框，用 NCBI 的 Blast 功能进行同源性分析，用
Primer premier5. 0 把核苷酸序列翻译成氨基酸序
列，利用 Mega5. 0 中的邻接法构建系统进化树，
利用在线软件 ExPASy(http:/ /web． expasy． org /
protparam /)对氨基酸序列进行分析。
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表 1 所用引物及其用途
Tab． 1 The primers and purpose
名称 name 序列 5-3 sequence 5-3 用途 purpose
P1 GACCATCATGGCTTCGACTT pgm基因扩增的正向引物
P2 TTCAGTTCCCATTCCTGCTC pgm基因扩增的反向引物
P3 CCCTATCATGGATCCAAACG pmm基因扩增的正向引物
P4 GTCCTAGCGCAACGAAGAGT pmm基因扩增的反向引物
P5 ATGACYCAGATSATGTTYGA β-actin基因扩增的正向引物
P6 TCDGGGCANCKGAAVCKCTC β-actin基因扩增的反向引物
P7 TCTTCCTCACGCTGTGCTCC β-actin 基因 ＲT-qPCＲ的正向引物
P8 AGTTGCTGCTTGATGTCTCG β-actin基因 ＲT-qPCＲ的反向引物
P9 TCCTTCTGATTCTGTCGCTGTC pgm基因 ＲT-qPCＲ的正向引物
P10 ATTTCCAACCTGTAGGCACTTC pgm 基因 ＲT-qPCＲ的反向引物
P11 CGTTCTGGGATTACGGTCTC pmm基因 ＲT-qPCＲ的正向引物
P12 GCATAGTTTCTTCCGGGTTC pmm 基因 ＲT-qPCＲ的反向引物
1. 5 pmm和 pgm基因的相对定量表达分析
分别称取 100 mg 左右经不同浓度 24-epiBL
处理后的龙须菜用于 ＲNA 的提取，方法同 1. 4。
用 PrimeScriptTM ＲT reagent Kit with gDNA Eraser
试剂盒(TaKaＲa 公司)将提取的 ＲNA 反转录成
cDNA，－20 ℃保存。以 β-actin 基因为内参，进行
实时荧光定量 PCＲ(ＲT-qPCＲ，Eppendorf 荧光定量
PCＲ仪)扩增。根据测序结果用 Primer Premier
5. 0设计特异性引物(表 1，P7 ～ P12)。采用 20 μL
体系:SYBＲ Premix Ex TaqⅡ(2 ×)缓冲液 10 μL，
正向和反向引物(10 μmol /L)各 0. 8 μL，cDNA 模
板 2 μL，加 ddH2O 补足，使反应总体积为 20 μL。
用 2 －△△Ct法分析目的基因的相对表达量［11］。
1. 6 统计分析
数据处理和统计分析采用 Origin7. 0 软件，差
异显著水平的检验使用 One-Way ANOVA，设显
著性水平为 P ＜ 0. 05，n = 3。
2 结果与分析
2. 1 24 － epiBL对龙须菜相对生长速率的影响
经不同浓度 24 － epiBL 处理的龙须菜相对生
长速率均高于对照组，且随着浓度的升高呈现先升
后降的趋势(图 1)。25 ℃时龙须菜的生长状态最
好，平均相对生长速率为13. 75% /d，15 ℃时的平均
相对生长速率为 10. 2% /d，31 ℃时为 8. 17% /d。
15 ℃培养时，24-epiBL 浓度为 0. 1 mg /L 时龙须菜
的相对生长速率最大(11. 73% /d) ，是对照组的
1． 25倍;25 ℃ 培养条件下，24-epiBL 浓度为
0. 5 mg /L时的最大相对生长速率为 14. 98% /d，是
对照组的 1． 18 倍;31 ℃培养条件下，24-epiBL 浓
度为 0. 1 mg /L 时藻体的最大相对生长速率为
9. 22% /d，是对照组的 1． 23倍。
图 1 不同浓度 24 － epiBL对不同温度下龙须菜相对生长速率的影响
Fig． 1 Effects of different concentrations of 24-epibrassinolide on the ＲGＲ
of G． lemaneiformis at different temperatures
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12 期 汤小彬，等:24 －表油菜素内酯对海洋红藻龙须菜琼胶合成及其相关基因表达的影响
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2. 2 24 － epiBL对龙须菜琼胶含量的影响
在 3 种不同温度培养条件下，随着培养时间
增加，龙须菜琼胶含量升高，添加激素的各处理组
琼胶含量均高于对照组(图 2)。在 24 和 48 h 处
理组中，温度对龙须菜琼胶含量的影响为 25 ℃ ＞
15 ℃ ＞31 ℃。在 15 ℃培养条件下，各激素添加
组的琼胶含量均在 24-epiBL 浓度为 0. 5 mg /L 时
达到最大值，24 h 时为 6. 75%，是对照组的 1． 36
倍;48 h 时为 8. 77%，是对照组的 1． 69 倍，都显
著高于对照组(P ＜ 0. 05)。在 25 ℃培养条件下，
各激素添加组的琼胶含量均随着 24-epiBL 浓度
的升高而增加，在 1. 0 mg /L 时达到最大值，24 h
时为 7. 68%，是对照组的 1． 55 倍;48 h 时为
11. 95%，是对照组的 1． 97 倍，均显著高于对照组
(P ＜ 0. 05)。在 31 ℃培养条件下，24 h 激素添加
组中，龙须菜的琼胶含量也随着 24-epiBL 浓度的
升高而增加，1. 0 mg /L 时的琼胶含量为 6. 00%，
是对照组的 1． 33 倍;48 h 激素添加组的琼胶含
量在 24-epiBL 浓度为 0. 5 mg /L 时达到最大值
(7. 19%) ，是对照组的 1． 28 倍，与对照组差异不
显著(P ＞ 0. 05)。
图 2 不同浓度 24 － epiBL对不同温度下龙须菜琼胶含量的影响
不同小写字母表示差异显著(P ＜ 0. 05) ，下同
Fig． 2 Effects of different concentrations of 24-epibrassinolide on the agar
content of G． lemaneiformis at different temperatures
Different letters above the bars indicate significantly different (P ＜ 0. 05) ，the same below
2. 3 pgm和 pmm基因的克隆和序列分析
本研究通过 PCＲ 扩增得到了 1 868 bp 的
pgm基因片段和 837 bp 的 pmm 基因片段，其中
pgm基因片段中包含 1 个 1 758 bp的完整开放阅
读框(OＲF) ，编码 585 个氨基酸，利用 Expasy 分
析预测显示 pgm 分子式为 C2792 H4360 N750 O875 S19，
蛋白分子量大小为 63. 04 ku，理论等电点为
5. 06。从 NCBI数据库中查找部分物种的 pgm 氨
基酸序列，与本研究的龙须菜 pgm 序列一起构建
系统进化树(图 3)。龙须菜与同纲(Florideo-
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phyceae)但不同目的皱波角叉菜 (Chondrus
crispus)pgm 的序列相似性为 79. 0%，二者在进
化树中相距最近。然后龙须菜与皱波角叉菜再与
蓖麻(Ｒicinus communis)、川桑(Morus notabilis)、
小麦(Triticum aestivum)和玉米(Zea mays)组聚
在一 起，最 后 再 与 盐 生 杜 氏 藻 (Dunaliella
salina)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)和
绿藻门(Chlorophyta)的 Bathycoccus prasinos、拟
南芥(Arabidopsis thaliana)等聚类。该系统进化
树说明龙须菜与红藻门的角叉菜亲缘关系最近，
与某些高等植物的亲缘关系较近，而与绿藻和其
他高等植物的亲缘关系较远。
图 3 基于 pgm氨基酸序列构建的不同物种的进化树
Fig． 3 The phylogenetic tree based on pgm amino acid sequence
Solanum tuberosum pgm(NP 001275281. 1，马铃薯) ;Cucumis sativus pgm (KGN50397. 1，黄瓜) ;Medicago truncatula pgm (XP
003592359. 1，蒺藜苜蓿) ;A． thaliana pgm (NP 199995. 1，拟南芥) ;B． prasinos pgm (XP 007511575. 1) ;C． reinhardtii pgm (XP
001697992. 1，莱茵衣藻) ;D． salina pgm (ADD25038. 1，盐生杜氏藻) ;G． lemaneiformis pgm (KP943508，龙须菜) ;C． crispus pgm
(XP_005717288. 1，皱波角叉菜) ;Ｒ． communis pgm (XP 002527783. 1，蓖麻) ;M． notabilis pgm (XP 010101975. 1，川桑) ;T．
aestivum pgm (CAC85913. 1，小麦) ;Z． mays pgm (NP 001105405. 1，玉米)
pmm 基因片段中包含 1 个 750 bp 的完整
OＲF，编码 249 个氨基酸，利用 Expasy 分析预测
pmm 蛋白分子式为 C1285H1988N338O385 S10，分子量大
小为 28. 65 ku，理论等电点为 5. 11。从 NCBI数据
库中查找部分物种的 pmm 氨基酸序列，与本研究
的龙须菜 pmm 序列一起构建系统进化树(图 4)。
龙须菜与皱波角叉菜 pmm 序列的相似性为
82. 0%，二者在进化树中相距最近。从进化树中可
以看 出，龙 须 菜 与 角 叉 菜、木 糖 发 酵 酵 母
(Spathaspora passalidarum)、立 枯 丝 核 菌
(Ｒhizoctonia solani)、异水霉罗兹壶菌(Ｒozella
allomycis)和温泉红藻(Galdieria sulphuraria)的亲
缘关系较近，而与绿藻门的 Ostreococcus tauri、褐
藻门(Phaeophyta)的海带(Saccharina japonica) ，
以及高等植物如黄瓜和拟南芥等的亲缘关系较远。
2. 4 24 － epiBL 对龙须菜 pgm 基因表达的影响
及其和琼胶含量的关系
3 个温度下 48 h 各激素添加组 pgm 的表达
量比 24 h均有所增加(图 5)。在 15 ℃培养条件
下，24 和 48 h 2 个处理组 pgm 的表达量均在 24-
epiBL 浓度为 0. 5 mg /L 时最高，24 h时是对照组
的 1. 81 倍，48 h时是对照组的 1. 72 倍，均显著高
于对照组(P ＜ 0. 05)。在 25 ℃培养条件下，24 和
48 h处理组的表达量随着 24-epiBL 浓度的升高
而增加，在 1. 0 mg /L 时最高，24 h 时的表达量是
对照组的 1. 63 倍，与对照组有显著性差异
(P ＜ 0. 05) ;48 h 时是对照组的 3. 12 倍，与对照
组及其他处理组都有显著性差异(P ＜ 0. 05)。在
31 ℃培养 24 h，处理组中 pgm 的表达量随着
24 － epiBL浓度的升高而增加，在 1. 0 mg /L 时最
高，是对照组的 1. 47 倍，与对照组有显著性差异
(P ＜ 0. 05) ，48 h 处理组的表达量随着 24-epiBL
浓度升高先增加后减少，在 0. 5 mg /L 时最高，是
对照组的 1. 62 倍，与对照组有显著性差异(P ＜
0. 05) ，但各处理组间差异不显著。
在 15 ℃培养条件下，pgm的表达量和琼胶含
2971
12 期 汤小彬，等:24 －表油菜素内酯对海洋红藻龙须菜琼胶合成及其相关基因表达的影响
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图 4 基于 pmm氨基酸序列构建的不同物种的进化树
Fig． 4 The phylogenetic tree based on pmm amino acid sequence
Populus trichocarpa pmm(XP 006375330. 1，欧洲大叶杨) ;Gossypium arboreum pmm(KHG27673. 1，亚洲棉) ;Malpighia glabra pmm
(ACN54046. 1，西印度樱桃) ;A． thaliana pmm(NP 182103. 1，拟南芥) ;M． truncatula pmm(XP 003623887. 1，蒺藜苜蓿) ;S．
japonica pmm(AIW04131. 1，海带) ;Ostreococcus tauri pmm(XP 003074213. 1) ;G． sulphuraria pmm(XP 005704161. 1，温泉红藻) ;
G． lemaneiformis pmm(KP943509，龙须菜) ;C． crispus pmm(XP 005713596. 1，皱波角叉菜) ;Ｒ． allomycis pmm(EPZ35317. 1，异水
霉罗兹壶菌) ;Ｒ． solani pmm(CCO30834. 1，立枯丝核菌) ;S． passalidarum pmm(XP 007372278. 1，新型木糖发酵酵母)
量随着 24-epiBL 浓度的升高都呈现先增加后减
少的趋势，均在 0. 5 mg /L 时最大(图 6)。在
25 ℃培养条件下，pgm的表达量和琼胶含量随着
24-epiBL 浓度的升高而增加，均在 1. 0 mg /L 时
最高(图 7)。在 31 ℃培养条件下，24 h 处理组
pgm的表达量和琼胶含量随着 24-epiBL 浓度的
升高而增加，在 1. 0 mg /L 时最高，48 h 处理组
pgm的表达量和琼胶含量随着 24-epiBL 浓度的
升高先增加后减少，在 0. 5 mg /L 时最高(图 8)。
各处理组中 pgm 的表达量和琼胶含量在最大值
时都与对照组有显著性差异(P ＜ 0. 05)。
2. 5 24 － epiBL对龙须菜 pmm基因表达的影响
在 15 和 25 ℃下，48 h处理组 pmm表达量比
24 h时要高，但 31 ℃下 24 h 处理组 pmm表达量
高于 48 h处理组(图 9)。24 h处理组中，pmm表
达量随着温度的升高而逐渐上升，31 ℃ ＞25 ℃ ＞
15 ℃;48 h处理组中，pmm的表达量随着温度的
升高而逐渐降低，15 ℃ ＞ 25 ℃ ＞ 31 ℃。15 ℃下
处理组 pmm表达量随着 24-epiBL 浓度升高而降
低，24 h处理组在 24-epiBL 浓度为 0. 02 mg /L 时
表达量最高，是对照组的 1. 12 倍，但差异不显著
(P ＞ 0. 05) ;48 h 时 pmm 在 24-epiBL 浓度为
0. 02 mg /L 时表达量最高，是对照组的 6. 73 倍
(P ＜ 0. 05)。25 ℃下 24 h 处理组 pmm 表达量随
着 24-epiBL 浓度升高也有所增加，在 1. 0 mg /L
时达到最大值，是对照组的 1. 72 倍(P ＜ 0. 05) ;
48 h处理组中 pmm表达量随着 24-epiBL 浓度升
高先增加后减少，在 0. 1 mg /L 时达到最大值，是
对照组的 3. 14 倍 (P ＜ 0. 05)。31 ℃下 24 h处理
组中 pmm表达量随着 24-epiBL 浓度升高先增加
后减少，在 0. 5 mg /L 时达到最大值，是对照组的
2. 03 倍 (P ＜ 0. 05) ;48 h 处理组中 pmm 表达量
随着 24-epiBL 浓度升高而逐渐增加，各处理组间
及对 照 组 和 处 理 组 间 均 没 有 显 著 性 差
异(P ＞ 0. 05)。
3 讨论
油菜素内酯能促进细胞增殖和分化，调节植
物的生长发育和生理响应，包括株型、开花、衰老、
光形态发生以及对生物和非生物因素的抗性作
用［12］。Xu 等［13］发现外施 24 －表油菜素内酯能
改善变型双穗短柄草(Brachypodium distachyon
L．)的矮化症状。Sun 等［14］研究发现油菜素内酯
能促进棉纤维的成熟。Serna 等［15］发现喷洒油菜
素内酯类似物能提高莴苣(Lactuca sativa L．)的
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水 产 学 报 39 卷
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图 5 不同浓度 24 － epiBL对不同温度下龙须菜 pgm基因表达量的影响
Fig． 5 Effects of different concentrations of 24-epibrassinolide on pgm expression of
G． lemaneiformis at different temperatures
图 6 不同浓度 24 － epiBL对 15 ℃时龙须菜 pgm基因表达量和琼胶含量的影响
Fig． 6 The relationship between pgm expression and agar content of G． lemaneiformis
at different concentrations of 24-epibrassinolide at 15 ℃
产量，并且在营养和感官上都没有副作用。李静
等［16］发现 24 －表油菜素内酯能使龙须菜在高温
下维持正常的生理功能。生长速率和琼胶含量是
龙须菜最重要的选育指标，本研究首次尝试使用
24 － epiBL 来提高龙须菜的生长速率和琼
胶含量，结果显示 3种温度下 2 4 － epiBL 均
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12 期 汤小彬，等:24 －表油菜素内酯对海洋红藻龙须菜琼胶合成及其相关基因表达的影响
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图 7 不同浓度 24 － epiBL对 25 ℃时龙须菜 pgm基因表达量和琼胶含量的影响
Fig． 7 The relationship between pgm expression and agar content of
G． lemaneiformis at different concentrations of 24-epibrassinolide at 25 ℃
图 8 不同浓度 24 － epiBL对 31 ℃时龙须菜 pgm基因表达量和琼胶含量的影响
Fig． 8 The relationship between pgm expression and agar content of G． lemaneiformis
at different concentrations of 24-epibrassinolide at 31 ℃
能促进龙须菜的生长，15 和 31 ℃下 24 － epiBL 浓
度为 0. 1 mg /L 时效果最好，25 ℃下 24 － epiBL 浓
度为 0. 5 mg /L 时效果最好。总体来说，龙须菜的
生长速率在 25 ℃时最高，15和31 ℃下的生长速率
较低，与孙雪等［17］的研究结果相符。24 － epiBL 也
能提高龙须菜的琼胶含量，15 ℃下最佳浓度的
24 － epiBL处理后琼胶含量与对照组有显著性差
异;25 ℃下效果最好，处理组与对照组间都有显著
性差异;31 ℃下激素处理组与对照组间差异不显
著。造成以上结果的原因可能是 15 ℃下由于藻体
内的各种生理活动受低温抑制，普遍处于较低水
平，因此激素处理对它虽然有一定的促进作用，但
作用不是太大;25 ℃是较适合龙须菜生长的温度，
藻体内各种生理生化活动处于活跃水平，激素刺激
后能迅速反应;而31 ℃下藻体内部分生理活性物
质已经遭受高温的不利影响，因此激素对藻生长的
促进作用比较有限。由以上结果可以看出，24 －
epiBL 能促进龙须菜的生长和琼胶合成，并且在高
温条件下对龙须菜的生长也有一定的促进作用，有
利于筛选出耐高温的龙须菜品系。
红藻中的琼胶合成过程共有 9 种酶参与［18］。
张杨等［19］首次克隆出龙须菜 UDP －葡萄糖焦磷
酸化酶基因，通过比较高琼胶组藻株与低琼胶组
藻株中该基因表达量的变化，得出该基因的表达
量与琼胶含量存在显著相关性。Chang 等［20］通
过研究不同培养条件下以及不同品系龙须菜中
UDP －葡萄糖焦磷酸化酶基因的表达量和琼胶含
量之间的关系，进一步证明该基因在琼胶合成过
程中的作用。Li 等［21］克隆了龙须菜半乳糖 － 1 －
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图 9 不同浓度 24 － epiBL对不同温度下龙须菜 pmm基因表达量的影响
Fig． 9 Effects of different concentrations of 24-epibrassinolide on pmm
expression of G． lemaneiformis at different temperatures
磷酸尿苷酰转移酶基因，通过比较高琼胶组藻株
和低琼胶组藻株之间该基因表达量的高低得出该
基因表达对琼胶含量有一定影响的结论。Siow
等［22］克隆了张氏江蓠(Gracilaria changii)中的半
乳糖 － 1 －磷酸尿苷酰转移酶基因，并通过研究发
现张氏江蓠、帚状江蓠(G ． edulis)和缢江蓠(G ．
salicornia)中该基因的表达量和琼胶含量相一
致，指出该酶可能是江蓠琼胶含量的决定因素之
一。Gross 等［23］指出参与合成 GDP-L-半乳糖的
酶可能在琼胶合成途径中发挥了主要作用。
Manley 等［4］推测琼胶合成过程的第二阶段在琼
胶合成过程中发挥了重要作用。本研究克隆了琼
胶合成过程第二阶段中的 pgm 和 pmm，并研究龙
须菜 981 品系在不同温度下经 24 － epiBL 处理
后，这 2 个基因的表达量和琼胶含量之间的关系。
本研究发现在 15 ℃时随着 24 － epiBL 浓度的增
加，pgm基因的表达量和琼胶含量都呈现先增加
后减少的趋势，并且都在 24 － epiBL 浓度为
0. 5 mg /L时达到最高值;25 ℃时 pgm 基因的表
达量和琼胶含量随着 24 － epiBL 浓度的升高都逐
渐增加;31 ℃时，pgm 基因的表达量和琼胶含量
的变化趋势也相同，证明 pgm 基因的表达和琼胶
含量之间关系密切。而 pmm 基因的表达量和琼
胶含量之间相关性不大，因此 pmm基因不能用作
龙须菜中筛选琼胶含量的快捷指标。
本研究发现适当浓度的 24 － epiBL 有利于不
同温度下龙须菜的生长和琼胶合成，并且龙须菜
pgm基因表达量和琼胶含量密切相关，说明 pgm
基因在龙须菜琼胶合成过程中发挥了重要作用，
可作为培育高琼胶含量藻种时检测琼胶含量的快
捷指标之一。
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Effects of 24-epibrassinolide on the agar synthesis and expression of genes
involved in marine alga Gracilariopsis lemaneiformis
TANG Xiaobin1，2，XU Nianjun1，2* ，SUN Xue1，2，LI Yahe1，2，ZHANG Lin1，2
(1. Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology of the Ministry of Education，Ningbo University，Ningbo 315211，
China;2． Key Laboratory of Marine Biotechnology of Zhejiang Province，School of Marine Sciences，
Ningbo University，Ningbo 315211，China)
Abstract:The effects of 24-epibrassinolide on the expression level of two genes，pgm encoding
phosphoglucomutase (PGM)and pmm encoding phosphomannomutase (PMM) ，involved in agar synthesis
at different temperatures as well as the correlation between genes expression level and agar content were
investigated in marine red alga Gracilariopsis lemaneiformis 981 strain． The open reading frames (OＲF)of
pgm and pmm were obtained by PCＲ，encoding 585 amino acids and 249 amino acids，respectively． The
deduced amino acid sequences showed significant similarity to the pgm and pmm sequences of Chondrus
crispus． Ｒeal time quantitative PCＲ technique was used to detect the relative expression levels of PGM and
PMM． Ｒesults showed that the highest growth rate of G ． lemaneiformis was observed under the treatment of
0. 1 mg /L 24-epibrassinolide at 15 and 31 ℃，while the highest growth rate was at 0. 5 mg /L 24-
epibrassinolide treatment group at 25 ℃ ． The agar content and pgm expression of G ． lemaneiformis were the
highest at 0. 5 mg /L 24-epibrassinolide treatment group at 15 ℃，and those of G ． lemaneiformis was higher
than the control and other treated groups when treated at 1. 0 mg /L 24-epibrassinolide at 25 and 31 ℃ ．
Besides，24-epibrassinolide could also improve pmm expression level at different temperatures． The results
indicated that 24-epibrassinolide can improve the growth and agar synthesis of G ． lemaneiformis，and pgm
expression level is closely related with agar content，which may be useful in screening for high-agar-content
strains．
Key words:Gracilariopsis lemaneiformis;24-epibrassinolide;growth;agar content;gene expression
Corresponding author:XU Nianjun． E-mail:xunianjun@ nbu． edu． cn
Funding projects:National Natural Science Foundation of China (31072229;41376151)
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