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海洋红藻龙须菜对2种逆境温度胁迫的应激生理响应



全 文 :第37卷 第3期 水 生 生 物 学 报 Vol. 37, No.3
2 0 1 3 年 5 月 ACTA HYDROBIOLOGICA SINICA May, 2 0 1 3

收稿日期: 2012-04-23; 修订日期: 2013-01-08
基金项目: 国家自然科学基金(31072229); 浙江省钱江人才项目(2007R10038)资助
作者简介: 孙雪(1974—), 女, 山东烟台人; 博士, 副研究员; 主要从事藻类生理生化研究。E-mail: sunxue@nbu.edu.cn
通信作者: 徐年军(1973—), 男, 湖北赤壁人; 博士, 研究员, 博士生导师; E-mail: xunianjun@nbu.edu.cn


doi: 10.7541/2013.57
海洋红藻龙须菜对 2种逆境温度胁迫的应激生理响应
孙 雪 蔡西栗 徐年军
(宁波大学海洋学院, 浙江省海洋生物工程重点实验室, 教育部应用海洋生物技术重点实验室, 宁波 315211)
PHYSIOLOGICAL RESPONSE OF MARINE RED ALGAE GRACILARIA
LEMANEIFORMIS TO TWO KINDS OF ADVERSE TEMPERATURE STRESS
SUN Xue, CAI Xi-Li and XU Nian-Jun
(Key Laboratory of Marine Biotechnology of Zhejiang Province, Applied Marine Biotechnology Key Laboratory
of Ministry of Education, College of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China)
关键词: 龙须菜; 应激生理; 超微结构; 渗透调节; 植物激素
Key words: Gracilaria lemaneiformis; Stress physiological response; Ultrastructure; Osmo-regulation; Phytohormone
中图分类号: S917.3 文献标识码: A 文章编号: 1000-3207(2013)03-0535-06

龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)是红藻门、江蓠属
海藻 , 主要用于生产琼胶和饲喂鲍鱼 , 能有效改善海洋
生态环境, 具有一定的社会效益[1]。随着海藻胶工业的发
展, 对琼胶生产原料藻的需求也日益增加。目前, 龙须菜
在我国已经成为继海带(Laminaria)、紫菜(Porphyra)、裙
带菜(Undaria)之后的第 4大栽培海藻[2]。野生龙须菜主要
生长在北方, 经过改良的龙须菜 981 品系在 12—26℃生
长较好, 目前已经在我国广东、福建、浙江、山东、辽宁
等沿海地区大面积养殖, 其生长快, 养殖技术成熟, 带动
了一个大型海藻的新兴产业链。
温度是影响海藻生长的主要生态因子, 是造成海藻
色素、蛋白质和糖类等生化组分变化的主要因素[3]。龙须
菜最适生长季节是春季和秋季, 在夏季气温较高时生长
缓慢, 持续高温可使藻体严重损伤, 生长期缩短, 造成产
量和品质下降。而在冬季海水温度过低, 龙须菜生长速度
非常缓慢。因此对龙须菜高温和低温逆境下的生理研究具
有重要意义。本文探讨了这两种温度胁迫下龙须菜生长、
细胞超微结构、抗氧化酶、过氧化产物、光合色素、渗透
调节物质及植物激素的短期应激响应规律, 为系统研究
龙须菜在温度胁迫下的应激调控机制提供了理论基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
龙须菜(G. lemaneiformis)981 于 2010 年 9 月采于福
建宁德海藻养殖场(26º36′N, 119º42′E), 在实验室保种培
养 1 个月左右。实验前于 25℃预培养 1 周。实验在光照
培养箱中进行, Provasoli培养基[4], 光照强度 60 μmol/(m2·s),
光周期 L∶D(12h∶12h), 盐度 25‰。分别设置低温胁迫
组(15℃)、高温胁迫组(33℃)和对照组(25℃), 每组 3个平
行。分别于培养 0、1、3、6、10、24、48、72h取样, 蒸
馏水快速冲洗后吸干水分, 液氮快速处理后于−20℃保存,
冷冻干燥备用。
吲哚乙酸(IAA)、茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)、肉桂酸
(RA)、脯氨酸、甜菜碱标准品和三甲基硅烷基重氮甲烷
正己烷溶液均购自 Sigma公司; 脱落酸(ABA)、二氢茉莉
酸(dhJA)购自东京化成工业株式会社; 甲醇、正己烷为色
谱纯; 其余试剂为分析纯。
1.2 实验方法
相对生长速率的测定 通过测定龙须菜实验前后
藻体鲜质量的变化, 计算相对生长速率(RGR)[5].
RGR=( lnWt − lnW0 )/t×100%
536 水 生 生 物 学 报 37卷
式中:W0为实验开始时藻的鲜质量(g); Wt为实验结束时藻
的鲜质量(g); t为实验天数。
细胞超微结构的观察 龙须菜藻体用 3%戊二醛
固定, 0.1 mol/L PBS缓冲液冲洗后用 1%锇酸固定, 再用
PBS缓冲液冲洗, 经系列丙酮脱水、渗透、包埋、超薄切
片, 最后用醋酸铀-柠檬酸铅双重染色, 在日立 H-7650 型
透射电镜(TEM)观察。
SOD、POD和MDA检测 准确称取样品 0.1 g, 液
氮研磨后加 0.1 mol/L PBS 缓冲液(pH 7.8)10 mL, 7000 r/min
离心 10min, 取上清液。SOD活力测定采用氮蓝四唑(NBT)
法, POD 活力测定采用愈创木酚法, MDA 含量测定采用
硫代巴比妥酸法[6]。
光合色素的含量检测 藻红蛋白(R-PE)、藻蓝蛋
白(R-PC)和叶绿素 a含量测定参考朱招波等的方法[7]: 藻
红蛋白和藻蓝蛋白测定取龙须菜 0.1 g, 液氮研磨后 PBS
缓冲液提取, 分光光度计测定。叶绿素 a含量测定另取龙
须菜 0.1 g液氮研磨后, 80%丙酮提取, 分光光度法测定其
含量。
渗透调节物的含量测定 脯氨酸和甘露醇含量测
定参照朱招波等的方法 [7]: 游离脯氨酸采用磺基水杨酸
反应后酸性茚三酮显色法测定。甘露醇含量采用硫酸铜比
色法测定。
植物激素的含量测定 5 种植物激素含量测定参
照蔡西栗等的方法[8]。0.2 g龙须菜液氮研磨后加入含BHT
100 mg/L 的正丙醇∶水∶HCl(2∶1∶0.002)提取, 提取物
固相萃取柱纯化 , 甲醇洗脱 , 三甲基硅烷化重氮甲烷正
己烷溶液衍生化, 水浴反应后氮气吹干, GC-MS分析。
植物激素含量计算采用公式: 植物激素含量(ng/g)=
(A 激素/A 内标/a×M)/W。其中 A为峰面积, a为标准曲线的斜
率, M为内标加入量, W为样品重。
1.3 数据分析方法
采用 Excel 2003、Origin 8.0统计软件进行数据处理
及统计分析。
2 结果
2.1 逆境温度对龙须菜相对生长速率的影响
图 1 可见, 龙须菜在低温和高温下生长均受到抑制,
高温对生长的影响更明显。低温胁迫龙须菜的相对生长速
率是 4.58%/d, 为对照组的 72.93%; 在高温胁迫下龙须菜
的相对生长速率是 2.43%/d, 为对照组的 38.69%。龙须菜
在高温和低温胁迫下 , 藻体均表现出分枝减少 , 颜色变
浅等症状, 在高温胁迫下龙须菜还出现了根尖变白、易碎
等症状, 部分藻体死亡。
2.2 逆境温度对龙须菜细胞超微结构的影响
由图 2 可见, 对照组龙须菜的细胞壁结构完整, 层
次分明(图 2b); 色素体板层状结构清晰, 层次分明(图 2e);
细胞内红藻淀粉颗粒较少, 细胞间孔状联系结构清晰、完


图 1 逆境温度对龙须菜相对生长速率的影响
Fig. 1 Effects of adverse temperature on the relative growth rate
(RGR) of G. lemaneiformis

整(图 2h)。低温胁迫组龙须菜的细胞壁结构发生了褶皱,
层次模糊, 且周围有少量红藻淀粉颗粒附着(图 2a); 细胞
内出现较多的红藻淀粉颗粒, 色素体板层结构较为模糊,
有明显的肿胀现象(图 2d); 但细胞间孔状联系仍清晰、完
整(图 2g)。高温胁迫组龙须菜细胞壁结构较为完整, 但层
次模糊难辨(图 2c), 细胞内出现大量的红藻淀粉颗粒, 色
素体板层状结构较为完整(图 2f), 细胞间孔状联系扭曲变
形(图 2i)。
2.3 逆境温度对龙须菜 SOD、POD、MDA的影响
由图 3可见, 对照组龙须菜 SOD、POD活性和 MDA
含量均较稳定。SOD活性维持在 529.27—608.73 U/g, POD
活性维持在 337.52—377.56 U/g。在低温胁迫下龙须菜的
SOD 活性比对照组略低 , 72h 时最终活性为对照组的
81.74%。POD 活性先下降后上升, 最终活性与对照组无
显著差异。MDA含量前期略有升高, 6h之后恢复到正常
水平。在高温胁迫下龙须菜 SOD活性比对照组显著降低,
72h时下降到了 342.26 U/g, 为对照组的 56.23%。POD活
性有所上升, 72h时达到 705.42 U/g, 比对照组高出 95.8%。
MDA含量有较明显的升高, 72h时达到 124.41 µmol/g, 比
对照组高 89.0%。
2.4 逆境温度对龙须菜光合色素的影响
由图 4 可见, 对照组龙须菜藻红蛋白、藻蓝蛋白和
叶绿素 a含量在培养前 48h均较为稳定, 48h后均略有下
降, 这可能是培养基中的营养盐含量减少所致。红藻光合
色素含量与介质氮浓度密切相关 , 氮浓度高时 , 藻体内
光合色素含量也高; 缺氮时光合色素含量降低[9]。在低温
和高温胁迫下龙须菜光合色素均有一定程度的下降, 在
低温胁迫下藻红蛋白、藻蓝蛋白和叶绿素 a含量开始迅速
下降, 最终含量为对照组的 74.79%、74.88%和 73.86%。
在高温胁迫下龙须菜 3种光合色素在 48h与低温胁迫组基
本相同, 但 72h时进一步下降到对照组的 45.33%、59.02%
和 50.12%。可见高温对龙须菜色素的破坏作用比较强。
2.5 逆境温度对龙须菜渗透调节物质的影响
由图 5 可见, 对照组龙须菜体内脯氨酸和甘露醇含
量相对较稳定。在低温胁迫下龙须菜的脯氨酸含量随着胁
迫时间的延长缓慢增加, 72h时比对照组增加了 44.99%。
3期 孙 雪等: 海洋红藻龙须菜对 2种逆境温度胁迫的应激生理响应 537


图 2 逆境温度对龙须菜细胞超微结构的影响
Fig. 2 Effects of adverse temperature on the ultrastructure of G. lemaneiformis cells by TEM
a. 低温胁迫龙须菜细胞壁结构(×10000); b. 对照组龙须菜细胞壁结构(×10000); c. 高温胁迫龙须菜细胞壁结构(×20000); d. 低温胁迫
龙须菜细胞整体结构(×20000); e. 对照组龙须菜细胞整体结构(色素体)(×30000); f. 高温胁迫龙须菜细胞整体结构(×12000); g. 低温胁迫
龙须菜细胞间孔状联系结构(×40000); h. 对照组龙须菜细胞间孔状联系结构(×30000); i. 高温胁迫龙须菜细胞间孔状联系结构(×20000)
a. The CW of the low temperature group (×10000); b. The CW of the control group (×10000); c. The CW of the high temperature group
(×20000); d. The whole cell structure of the low temperature group (×20000); e. The whole cell structure of the control group (×30000); f.
The whole cell structure of the high temperature group (×12000); g. The Pit of the low temperature group (×40000); h. The Pit of the control
group (×30000); g. The Pit of the high temperature group (×20000)
CW: 细胞壁 Cell Wall; C: 色素体 Pigments; Fs: 红藻淀粉颗粒 Floridean starch granules; N: 核 Nucleus; Plg: 质体小球 Plastoglobules;
Pit: 细胞间孔状联系 Pit connection

在高温胁迫下龙须菜脯氨酸含量增加更快, 72h比对照组
高出了 69.78%。在低温胁迫下甘露醇含量与对照组差异
不显著(P>0.05)。在高温胁迫下甘露醇含量在 72 h时达到
108.23 mg/g, 比对照组高 34.47%。
2.6 逆境温度对龙须菜植物激素的影响
由图 6可见, 对照组龙须菜中 IAA含量变化不显著,
其他 4 种植物激素在实验过程中均有所上升, 这可能是
龙须菜在生长过程中受到营养等条件变化所致。在两种温
度胁迫下龙须菜 IAA 都有所降低, 但高温胁迫对龙须菜
IAA影响较大, 72h时比对照组下降了 39.75%, 而低温胁
迫下龙须菜 IAA 含量降低不明显。其他 4 种植物激素在
这 2 种温度胁迫下均有所升高, 并且呈先上升后下降的
538 水 生 生 物 学 报 37卷


图 3 逆境温度对龙须菜 SOD、POD活性和 MDA含量的影响
Fig. 3 Effects of adverse temperature on the SOD, POD activities
and MDA content of G. lemaneiformis


图 4 逆境温度对龙须菜藻红蛋白、藻蓝蛋白和叶绿素 a含量的影响
Fig. 4 Effects of adverse temperature on the contents of phyco-
erythrin, phycocyanin and chlorophyll a of G. lemaneiformis



图 5 逆境温度对龙须菜渗透调节物质脯氨酸和甘露醇含量的影响
Fig. 5 Effects of adverse temperature on the proline and mannitol content of G. lemaneiformis

趋势。龙须菜 ABA 含量在低温和高温胁迫下变化最大,
均高于对照组, 在低温胁迫下龙须菜 ABA 在 10h 达到最
大值, 比对照组高 98.13%; 在高温胁迫下 ABA 含量在
24h达到最大值, 比对照组高 146.37%。在低温胁迫下 JA
含量在 6—24h略高于对照组, 24h之后低于对照组, 总体
变化不大; 而在高温胁迫下 JA含量一直高于对照组, 24h
达到最高, 比对照组高 48.87%(P<0.05)。在低温和高温胁
迫下的 SA 变化趋势基本相同, 都是先上升后下降, 分别
在 10h和 6h达到最大值, 在高温下 SA含量的变化更快。
在低温和高温胁迫下 RA含量比对照组高, 到 10h达到最
大值, 随后又缓慢下降。
3 讨论
3.1 温度胁迫对龙须菜生长速率、超微结构和抗氧化系
统的影响
植物的生长受温度、光照、营养等多种环境因子的
3期 孙 雪等: 海洋红藻龙须菜对 2种逆境温度胁迫的应激生理响应 539


图 6 逆境温度对龙须菜植物激素(吲哚乙酸、脱落酸、茉莉酸、
水杨酸、肉桂酸)含量的影响
Fig. 6 Effects of adverse temperature on the phytohormone (IAA,
ABA, JA, SA, RA) content of G. lemaneiformis

影响, 其中温度主要影响代谢酶的活性和代谢速度。在低
温胁迫下龙须菜的酶活受到一定影响, 但在 15℃条件下
龙须菜仍然能够适应。在高温胁迫下龙须菜抗氧化酶活性
受到抑制 , 破坏了细胞结构 , 所以其生长受抑制程度要
高于低温组。余江 [10]研究发现龙须菜(G. lemaneiformis)
在 30℃、盐度 22‰、光照 5000 1x时藻体细胞出现明显
的质壁分离、类囊体膨胀变形、嗜锇颗粒沉积、线粒体部
分溶解等特征, 生长受到明显抑制。本实验发现在温度胁
迫下龙须菜细胞壁和色素体结构受到不同程度的损伤 ,
细胞内红藻淀粉颗粒大量积累, 这可能是细胞自我保护
的一种机制。
植物体内 SOD可以消除超氧化物自由基并将其转变
成 H2O2, 而 POD可以将 H2O2转变成 H2O和 O2, 从而彻
底消除超氧化物自由基, 它们的活性对环境变化非常敏
感。在本实验中低温胁迫下龙须菜 SOD、POD、MDA与
对照组相比差别不大, 在高温胁迫下龙须菜 SOD 活性在
前期有所提高, 后期显著下降; POD活性和 MDA含量在
胁迫后期显著上升。这一结果与柯德森等的结果相似[11],
他们报道当温度低于 25℃时龙须菜 POD活性随培养时间
变化并不明显, 但在 30℃或 35℃条件下 12d内 POD活性
上升了近 5倍。
3.2 温度胁迫对龙须菜光合色素和渗透调节物质的影响
龙须菜的光合色素主要有藻红蛋白(R-PE)、藻蓝蛋
白(R-PC)、别藻蓝蛋白(APC)和叶绿素, 其含量容易受环
境因素的影响[12]。在高温胁迫下江蓠(Gracilaria sp.)中藻
红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白和叶绿素比例发生了变化,
藻体的颜色就会发生相应的变化。在本实验中龙须菜在低
温和高温胁迫下颜色变浅, 可能是由于藻红蛋白、藻蓝蛋
白和叶绿素 a含量下降所引起的, 对这 3种光合色素的含
量检测结果验证了这一点。
植物体内脯氨酸、甘露醇不仅对细胞渗透压起调节
作用, 还对活性氧特别是 O2-和 ·OH 的产生有抑制作用,
对 ·OH 有清除作用, 表明渗透调节物质的积累对植物抗
逆性有双重作用。Chang, et al.[13]研究发现细基江蓠繁枝
变种(G. tenuistipitata var. liui)在 35℃条件下脯氨酸含量
第 2天开始逐渐增加, 第 7天后由于藻体的部分死亡含量
开始下降。在本实验中低温胁迫下龙须菜脯氨酸含量升高,
而甘露醇含量没有显著变化。在高温胁迫下脯氨酸和甘露
醇都有一定程度的升高, 表明温度胁迫造成了龙须菜渗
透压的改变, 其中脯氨酸在渗透调节中作用较大。
3.3 温度胁迫对龙须菜内源植物激素的影响
植物受到逆境胁迫时, 体内的植物激素会发生应激
性变化 , 从而激活体内的信息传递系统 , 产生抵御逆境
胁迫的生理活性物质。如逆境胁迫条件下植物启动脱落酸
(ABA)合成系统, 合成更多的 ABA, 调节体内的水分代
谢, 控制呼吸作用, 增强植株抵抗能力[14]。在植物体内的
水杨酸信号通路中, SA 主要通过诱导脂质过氧化使逆境
蛋白表达从而获得抗性, JA 也作为内源信号分子参与生
物因子和非生物因子逆境胁迫的信号传递。樊扬等[15]发
540 水 生 生 物 学 报 37卷
现龙须菜愈伤组织分化过程中内源激素 iPAs、GA、IAA
和ABA含量发生改变, 尤其是ABA的积累与高等植物在
逆境胁迫中表现相同。本实验结果显示低温对龙须菜 IAA
影响不显著, 而高温胁迫下 IAA 一直处于较低水平, 表
明高温胁迫可能抑制了 IAA 的产生, 因而对龙须菜的生
长影响较大。在 2种温度胁迫下ABA含量均有所升高, 在
高温胁迫下 ABA 变化更大, 表明高温更能刺激龙须菜在
短时间内对胁迫做出应激反应, 以减少逆境对藻体的伤
害。低温胁迫下龙须菜 JA含量变化不大, 高温胁迫下 JA
含量一直处于较高水平, 表明高温胁迫导致的伤害更大。
SA和 RA的变化趋势一致, 可能是因为 SA合成的途径之
一就是由反式肉桂酸的侧链 β 氧化生成, 在两种胁迫前
期 SA和 RA含量高于对照组, 后期呈现下降趋势。
龙须菜对温度胁迫比较敏感, 特别是高温对龙须菜
的生理影响更大。温度胁迫导致光合色素蛋白变性, 细胞
内抗氧化酶等酶活受到影响, 从而影响细胞渗透调节系
统, 最终造成细胞结构破坏, 生长减慢甚至逐渐死亡。同
时还可以通过内源性植物激素的快速响应调节缓解藻体
的抗逆生理。
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