全 文 ：1592004, Vol. 25, No. 3※营养卫生 食品科学
龙须菜藻胆蛋白的分离及其清除自由基
作用的初步研究
陈美珍，张永雨，余 杰，谢雄彬
（汕头大学理学院生物系，广东 汕头 515063）
摘 要：龙须菜藻体经细胞破碎，其水溶性提取物经硫酸铵沉淀即得藻胆蛋白粗提物。该粗提物经Sephadex G-
100柱层析，可分离出藻红蛋白(PE)，其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中仅显示一条带，用SDS-PAGE不连续电泳测定其
亚基分子量分别为18000Da和24000Da。该PE的吸收光谱有二峰一肩，最大吸收值在570nm处，属I型R-PE。分
别采用Fenton体系和邻苯三酚－鲁米诺发光体系测定藻胆蛋白粗提物及分离的PE清除·OH和O2·能力，结果表
明，藻胆蛋白粗提物和分离的PE均有清除自由基作用，但两者间存在差异。
关键词：龙须菜；藻胆蛋白；分离；吸收光谱；自由基
Studies on Sparation and Scavenging Activities on Free Radicals of
Phycobiliproteins from Grac laria Lemaneiformis
CHEN Mei-zhen，ZHANG Yong-yu，YU Jie，XIE Xiong-bin，
（Department of Biology, Shantou University , Shantou 515063，China）
Abstract : The crude phycobiliproteins were got from water extraction of smashed cells of Gracilaria lemaneiformis w re
precipitated in ammonium sulfate. Phycoerythrin could be separated through chromatographed the crude phycobiliproteins by
Sephadex G-100 column, and it appeared only one band in the polyacrlamide gel electrophoresis. Molecular weights of subunits
of the phycoerythrin are 18000Da and 24000Da that were measured by SDS-PAGE. The PE possessed an absorption maxi-
mum at 570nm and it belongs to R-PE type Ⅰ.The scavenging activities of the crude phycobiliproteins and the PE on OH of
Fenton reaction and O2· f Luminol reaction were studied.The results showed that the crude phycobiliproteins and the PE both
could scavenge free radicals, but their abilities were different.
Key words: g acilaria lemaneiformis; phycobiliproteins; separation; absorption spectrum; free radical
中图分类号：Q503 文献标识码：A 文章编号：1002-6630（2004）03-0159-04
收稿日期：2003-09-22
作者简介：陈美珍（1956－），女，副教授，研究方向为天然活性物质研究与开发。
藻胆蛋白(phycobiliproteins)为红藻和蓝藻类光合作
用的主要捕光色素蛋白，易溶于水，按光谱特性藻胆蛋白
可分为红色的藻红蛋白（phycoerythrin,PE）、蓝紫色的藻
蓝蛋白（phycocyanin,PC）和孔雀蓝色的异藻蓝蛋白
（allophycocyanin,APC）[1]。藻胆蛋白的应用越来越受到重
视，除了作荧光探针用于医学诊断、免疫学和细胞学研究
中外，还可作为理想的天然色素用于食品、化妆品以及作
为药物以提高人体免疫力等[2]。
龙须菜（Gracilaria lemaneiformis） 是一种江蓠属产琼
红藻，含有丰富的碳水化合物和蛋白质。但以往由于产量不
多，及其适口性差，很少直接食用，主要用于提取琼脂，因
此，对龙须菜的研究不多。近年来，随着广东、福建等地沿
海地区人工养殖龙须菜逐渐形成规模，产量不断增加，有关
龙须菜的研究也逐步引起人们的关注。作者对龙须菜成分分
析发现龙须菜含有19.14％（以干重计）的粗蛋白，因此对其
藻胆蛋白的研究是很有价值的。但是目前关于龙须菜藻胆蛋
白的研究报道仍很少，现有文章也多见于对其藻胆蛋白光谱
特性及其基因的研究。本文对龙须菜藻胆蛋白的提取、分离
及其清除·OH和O2·自由基的作用进行了初步的研究，以期
为合理利用龙须菜资源，提高其经济效益和龙须菜保健食品
的开发提供科学依据。
2004, Vol. 25, No. 3160 ※营养卫生食品科学
1 材料与方法
1.1 材料、仪器及试剂
1.1.1 新鲜龙须菜 2003年3～4月间采集于南澳岛，为人工
养殖。
1.1.2仪器 J2-21M 高效离心机（Bechman）、751G分光光
度计、721分光光度计、SHG-C型生物化学发光测量仪、
Sephadex G-100层析柱（ .8cm×60cm）等。
1.2 方法
1.2.1蛋白质含量的测定 采用微量凯氏定氮法。
1.2.2藻胆蛋白粗提物制备
鲜龙须菜洗净沥干，加入少量1mmol/L pH6.8的磷酸缓
冲液（PBS），在－20℃与4℃下反复冻融5次，在冰浴中匀
浆破碎，然后加入20倍蒸馏水（以鲜重计）于4℃下避光搅
拌提取24h，离心（7500r/min、30min、4℃），取粉红色上清
液，加入硫酸铵（饱和度为55％）充分搅匀，置4℃避光沉淀，
沉淀物置1mmol/L pH6.8的PBS 中充分透析，离心得粉红色
上清液即为藻胆蛋白粗提物。
1.2.3 藻胆蛋白的分离和纯度测定
藻胆蛋白的分离提纯[3]:用Sephadex G-100柱层析，以
1mmol/L pH6.8的PBS洗脱，用核酸蛋白检测仪测定洗脱曲线，
收集含藻红蛋白的粉红色洗脱液（带有明显的荧光）。
藻红蛋白的纯度测定：将过柱后收集的藻红蛋白洗脱液
进行聚丙烯酰胺不连续电泳[4]，并以相同方法比较过柱前粗
提物中藻胆蛋白的组分。
1.2.4分子量测定[ 4]
采用SDS-PAGE不连续电泳测定藻红蛋白亚基分子量，
以低分子量标准蛋白作标准曲线。
1.2.5光谱测定
上述分离的藻红蛋白在室温下用751G分光光度计测定
其吸收光谱。
1.2.6自由基清除率的测定
清除·OH自由基能力的测定[5]:采用fenton体系，参照
文献[5]的方法并略加修改。0.2ml的FeSO4-EDTA混合液加
0.5ml的2-脱氧核糖加适量样品，用PBS定容至1.9ml，其它
与文献[5]一致。
清除O2·力的测定：采用邻苯三酚-鲁米诺发光体系，参
考文献 [6，7]的方法并略作修改：1.67×10-4mol/L邻苯三酚，
以pH10.2的0.1mol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲液(含0.16mmol/
L EDTA)配制0.1mmol/L鲁米诺溶液。空白对照用0.05mol/L
的PBS（pH7.8）代替样品液，以维生素C作阳性对照。化学
发光体系及发光测量方法与文献[7]相同。
2 结果与讨论
2.1 藻红蛋白的分离纯化
藻胆蛋白粗提物经Sephadex G-100柱层析其洗脱曲线如
图1所示。藻胆蛋白粗提物和过柱后的第一个洗脱峰红色收集
液即分离的藻红蛋白进行聚丙烯酰胺不连续电泳，结果见图
2。从图1洗脱峰可见，粗提物中有两个主要组分，峰1的收
集液为粉红色且带有明显荧光，是PE组分；峰2为杂蛋白。由
图2粗提物经聚丙烯酰胺电泳时呈两条带也进一步证实了这一
点。而峰1的收集液在电泳中只显示单一条带，说明用Sephadex
G-100柱层析也可以分离出单组分的PE，但所得到的PE收集
液纯度较低（A570nm/A280nm=3.05）。若要获得较高纯度的PE
需与常用的羟基磷灰石柱等其他纯化方法配合使用。
分别测定过柱后红色与无色洗脱液的蛋白含量，两者的
比值是2.86，由此可得出洗脱的藻胆蛋白粗提物中藻红蛋白
约占74.1％左右（忽略了其纯度），这与柱层析两洗脱峰大小
关系一致，也与张学成（1996）[1]报道的野生型龙须菜藻红蛋
白占藻胆蛋白的72.1%基本相符。
2.2 光谱特性
分离纯化后的藻红蛋白吸收光谱见图3，其吸收峰为
498、545（肩峰）和570nm，最大吸收峰在570nm处，由此推
测，该藻红蛋白属于I 型R-PE[1, 2]，此结果与张学成报道的