全 文 ：龙须菜微卫星 DNA 标记筛查及系统分析
张学成 , 贺　扬 , 徐 　涤
(中国海洋大学海洋生命学院, 山东 青岛 266003)
摘　要:　利用生物信息学方法 ,从龙须菜(Gracilaria lemanei formis)公共核苷酸数据库中筛查到 8 条含有微卫星 DNA 的
序列 ,并根据筛查出的微卫星DNA序列设计合成了5 对引物 , 此外还使用了细江蓠的4 对已知微卫星 DNA 引物共 9 对引
物在采集自青岛的 26 株野生龙须菜个体中进行扩增 , 结果筛选到 2 对引物可扩增出具有多态性的产物。然后利用 5 对龙
须菜的微卫星引物对 6个龙须菜品系和另外2 个种外物种细基江蓠和菊花心江蓠进行系统学分析 。根据计算得到的不同
样品之间 Nei氏遗传相似系数进行聚类分析 ,显示青岛野生龙须菜 QD 与栽培品系 981 、石岛的龙须菜样品 SD 与龙须岛
的龙须菜样品 LD 之间的遗传相似系数最高 ,而来自委内瑞拉的龙须菜样品 LV 与青岛野生龙须菜之间的差异远远高于
种内水平的差异。
关键词:　龙须菜;微卫星 DNA;多态性分析;系统分析
中图法分类号:　Q341　　　　　文献标识码:　A　　　　　文章编号:1672-5174(2009)02-259-06
　　龙须菜(Graci laria lemaneiform is)是江蓠属的 1
个重要的产琼胶物种 ,具有生长速度快 、抗逆性强 、琼
胶含量高 、质量好等优点。龙须菜栽培业已经发展成
我国第三大海藻栽培业 。另外 ,近十年的栽培实践还
证明 ,大规模栽培龙须菜在改善 、修复近岸海水富营养
化方面有重要的作用[ 1] 。开展龙须菜大规模人工养殖
的关键在于龙须菜种苗的来源及龙须菜优良品系的选
育。通常情况下仅靠龙须菜外部形态和生殖结构等特
征 ,难以对其同种材料不同来源的种苗进行区分[ 2] 。
因此 ,有必要建立有效的分子标记鉴定方法 ,对其种苗
进行鉴定 ,同时对养殖种群的遗传与变异进行分析 。
微卫星 DNA(Microsatelli te DNA)是一类由 2 ～ 6
个核苷酸经多次串联形成的 DNA 序列[ 3] 。微卫星
DNA 标记之所以倍受研究人员青睐 ,除了其高度多态
性和在基因组中的高丰度外 ,还在于微卫星 DNA标记
按孟德尔方式遗传 ,呈共显性 ,可区分纯型合子与杂型
合子 。目前 ,微卫星 DNA在群体遗传学 、分子生态学 、
谱系和发育研究[ 4] 、疾病检测[ 5]等研究领域中广泛应
用的分子标记之一。
微卫星 DNA标记应用的前提是开发重复序列两
翼的特异性引物。开发微卫星 DNA 引物的方法有几
种:经典的筛选基因组文库的方法 、微卫星 DNA 富集
法 、选择性扩增微卫星 DNA(SAM)、生物信息学方法
(Data mining)及近缘种的交叉扩增(Cross amplif ica-
tion)等 。获得微卫星 DNA 最简捷的途径就是通过公
共数据库(GenBank 、dbEST 等)查找微卫星 DNA[ 6] 。
微卫星 DNA的 1个具有潜在价值的特征是从 1个物
种得到的引物可以应用于相关的分类群 ,这意味着利
用近缘种的已知微卫星 DNA引物进行交叉扩增筛选
也可获得一定的有效微卫星 DNA 引物[ 7] 。从公共核
酸数据库及近缘种的已知微卫星 DNA 中筛选微卫星
DNA 既简便迅速又能节约大量的时间和经费[ 8] 。
目前 ,微卫星 DNA标记在藻类中的应用主要集中
在褐藻和绿藻中 ,在红藻门江蓠属(Graci laria)的应用
报道只有 3例 。Wattier等[ 9]用从细江蓠(G.graci lis)
中分离到的 4个微卫星 DNA标记对世界范围内的细
江蓠进行了分析 ,并筛选到 2个多态性的微卫星 DNA
标记 。Luo等[ 10]对 G.graci lis进行微卫星 DNA分析
得到了 9 个多态性微卫星 DNA 位点 。Guilllemin
等[ 11]从智利江蓠(G.chilensis)基因组 DNA文库中分
离到 6个多态微卫星 DNA 位点 ,同时对 2个种群的遗
传多样性分析显示种群内杂合度较低(0 ～ 0.51),此 6
个微卫星 DNA位点可用于对智利沿海遭过度开发的
江蓠资源进行评估 。
本研究采用了 2种方法对龙须菜微卫星 DNA 标
记进行筛查和应用研究 ,以期为龙须菜群体遗传结构
分析和遗传资源保护利用 、为构建龙须菜连锁图谱和
进行分子标记辅助育种提供实验基础 。
1　材料和方法
1.1 材料
对微卫星标记引物的多态性检测使用的是 26株
基金项目:国家自然科学基金项目(40606034 , 30671603);国家高技术研究发展计划项目(2006AA10A413)资助
收稿日期:2008-09-05;修订日期:2008-11-28
作者简介:张学成 ,男 ,教授 ,博士生导师。 E-mail:xczhang@ouc.edu.cn
　 第 39卷　第 2期 　
2009年 3月　
中 国 海 洋 大 学 学 报
PERIODICAL OF OCEAN UNIVERSIT Y OF CHINA
39(2):259～ 264
Mar., 2009
采自青岛湛山湾的野生龙须菜;使用所筛选微卫星标
记引物对龙须菜不同品系及其他江蓠属物种的系统学
分析所采用的材料共 8种(见表 1)。
表 1　实验材料的名称及其采集来源
Table 1　Names and original sampling places of the Gracilaria materials used in this experiment
样品名称
Sample s name
来源
Origin
生长状态
Life situation
数量(株)
Number(ind.)
龙须菜
(G.lemaneiformis)
QD 青岛湛山湾(zhanshan Bay , Qingdao) 野生 wild 26
SD 威海石岛(Shidao , Weihai) 野生 wild 1
LD 威海龙须岛(Longxudao , Weihai) 野生 wild 1
981
福建莆田 ,原始物种采自青岛
(Fujian , originally from Q ingdao) 栽培 cultured 1
SA 南非(South A frica) 野生 wild 1
LV 委内瑞拉(Venezuela) 野生 wild 1
细基江蓠
(G.tenuistipitata) GT 广东汕头(Shantou , Guangdong) 野生 wild 1
菊花心江蓠
(G.lichenoides) GL 广东汕头(Shantou , Guangdong) 野生 wild 1
1.2 方法
1.2.1 从龙须菜公共核酸数据库中查找微卫星 DNA
序列并进行 PCR 扩增的引物设计 　　以 Gracilaria
lemanei formis 为关键词 , 在 NCBI 公共核酸数据库
(ht tp://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/ index .html)
中搜索龙须菜相关序列。下载的文件以 FAS TA 格式
保存。使用同源性分析软件 InforMax ,对下载的全部
龙须菜序列进行相似性比较 ,找出其中具有重复部分
的 2条或几条序列 ,将他们拼接后得到 1 条序列 。经
过整理后得到的序列中不含重复的序列。本实验采用
“SSR EXPERT”程序 ,对下载的经同源性分析后的全
部龙须菜序列中进行微卫星 DNA 序列的查找 。作者
搜索了所有可能的核心序列为双碱基 、三碱基 、四碱
基 、五碱基及六碱基的微卫星 DNA 序列 。并将结果记
录下来。搜索标准是:5次以上的双碱基重复(包括 5
次)、4次以上的三碱基重复(包括 4次), 3次以上的四
碱基重复(包括 3次)[ 12] 。
对含有微卫星 DNA 的序列 , 用 Primer Premier
5.0 软件(PREMIER Biosoft International)根据重复
片断两翼设计用于 PCR扩增的引物。
1.2.2 查找文献并获得近缘种已知微卫星 DNA 位点
　　为了获得更多的微卫星 DNA 位点 ,文中将Watt i-
er等[ 9]从细江蓠(G.gracilis)中分离到的 4个微卫星
DNA 标记(见表 2)用在了龙须菜群体中进行引物种间
转移扩增研究 。
表 2　从 G.gracilis中分离到的 4 对微卫星 DNA 引物
Table 2　Characterization of the four microsa tellite primers from G.gracilis
SSR 标记
SR name
引物序列(5-3 )
Primer sequence(5 -3 )
核心序列
Core motif type
Gv1CT
F:TCGTGGGCCTATT TGTGAGATATC TTCG
R:TTCATTGGGCTAGCGAACTCTCGAAAC CT , perfect
Gv2CT
F:AGTGGAGGCACATGGTCAACGAGC
R:ACCGCACNTTGCGATATCGCTTCG CT , imperfect
Gv1AAC
F:GTGCGTCAAGCGCTCCTTC
R:CTTATTGTCCTGACTATCATCATCCG AAC , imperfect
Gv1AAG
F:GGCAGTTCCTTCCTTCGACCTCTCC
R:GACCTTAGAAGCGTCAGTAGCGGCG AAG , perfect
1.2.3基因组 DNA的提取　　本实验采用 DNA提取
试剂盒 Universal Genomic DNA Ex traction Kit Ver.
3.0(购自 TAKARA)进行龙须菜基因组 DNA的提取。
1.2.4微卫星 DNA位点的多态性检测　　利用所获得
260 中　国　海　洋　大　学　学　报 2 0 0 9 年
的所有引物分别对 26株野生龙须菜进行 PCR扩增 ,检
测其微卫星 DNA位点的多态性 。优化后的 PCR反应体
系为 50 ng·μL-1模板 DNA 1 μL ,10×Buffer 2.5μL ,25
mmol/L MgCl2 1.5 μL , 10 mmol/ L dNTPs 0.5 μL , 20
p mol/L引物各 1μL ,5 U·μL-1 Taq DNA聚合 0.2 μL ,
加17.3μL三蒸水补足至总体积 25 μL。来自于龙须菜
的引物 PCR反应条件为:94 ℃预变性 5 min ,94 ℃变性
30 s ,退火 30 s(退火温度依引物而异),72 ℃延伸30 s ,经
35个循环后 ,72 ℃延伸 10 min ,4 ℃保存。通过文献查
找到的微卫星 DNA 引物则根据原始文献中所使用的
扩增反应条件进行 PCR扩增 。扩增产物先在 2.0%琼
脂糖凝胶上检验扩增效果 ,然后在 6%聚丙烯酰胺凝胶
上 75 W恒功率 1.5 h 。银染法检测多态性。
1.2.5 利用微卫星位点进行系统学分析　　以筛选到
的扩增主带清晰 、单一的微卫星 DNA 引物对龙须菜不
同品系及 2个种外对照(GT 、GL)(见表 1)进行PCR扩
增。反应体系及反应条件同上 。反应产物使用 2%琼
脂糖凝胶电泳柬测。
使用分析软件 MSAnalyser对每个微卫星 DNA 位
点等位基因的数量进行统计 ,计算下列统计量:等位基
因数 、观测杂合度(Ho)与期望杂合度(He)。用 PIC-
CALC软件进行多态性信息含量(PIC)的计算 。用
GenPop软件计算 Hardy-Weinberg 平衡。
以电泳后扩增带的清晰度 、可重复性为标准用于标
记分析 。利用种群遗传分析软件包 TFPGA(Tools for
Population Genetic Analyses , Mark P.Miller , 1999)进行
遗传相似性 、遗传距离计算以及聚类分析绘制群体间
系统演化树。
2　结果
2.1 龙须菜微卫星 DNA序列搜索结果及引物设计
截至 2008 年 3 月 , 在 NCBI 数据库中共搜索到
178条龙须菜(G .lemanei form is)ES T 序列和 19 条
Co reNucleotide序列。使用同源性分析软件 InforMax ,
对下载的全部龙须菜序列进行相似性比较 ,得到 153
条非冗余序列。经计算机筛选和人工选择 ,利用 SSR
EXPERT 软件对搜索到的 153条非冗余龙须菜序列进
行微卫星 DNA查找。最终获得 8条含微卫星 DNA重
复单元的序列 ,占整个龙须菜已知数据库的 4.06%。
在这 8条序列中 ,共发现 13个微卫星 DNA 位点 ,占整
个龙须菜已知数据库的 8.50%。利用 Primer Primier
5软件 ,对查找出来的 8条包含微卫星 DNA 位点的序
列进行了引物设计 。最终 ,成功设计并合成了 5对引
物(见表 3)。
表 3　根据龙须菜公共核酸数据库所设计的 5 对引物
Table 3　Characteriza tion of 5 pairs of designed primers based on public nucleotide resources of Gracilaria lemaneiformis
引物名称
Name
引物序列(5 -3 )
P rimer sequence(5 -3 )
退火温度/ ℃
Tm
核心序列
Core motif
预期产物长度/ bp
Length of
product
序列类型
Type of sequence
登陆号
Accession No.
A
F:GGCGCGAAGAAGAAGAAG
R:GCAAGGACGGATGGAGTG 55 (GAA)4 136 EST BI544215
G
F:AAGTTATTCGCAACGCTC
R:AGTCGCCTAGTTTGTATGTG 52 (GA)5 105 EST BI544182
T
F:TTGCGGAGGAAGGGGGAC
R:CGGTTTACTTACGACAACGACGA 57 (TTG)4 101 EST BI455179
C
F:CACACCGTCCAAGTAACCAC
R:ACGCCACAGACAGCACAG 55 (AC)5 180 EST BI544089
E
F:GCACCTCTGGCAGGAAAT
R:GCACCAAAGCATCGCATA 50 (GA)6 348 CoreNucleo tide AY551085
2.2 多态性微卫星 DNA位点的筛选
本实验共合成 9对引物 ,其中 5对设计自龙须菜
公共核酸数据库(见表 3),另外 4对则转移自 Wattier
从细江蓠中分离得到的微卫星 DNA引物(见表 2)。
经 PCR扩增 、琼脂糖电泳检测 、聚丙烯酰胺凝胶
电泳和银染色检测后 ,5对来自龙须菜的引物都有扩增
产物 ,但其扩增条带图谱在本次实验所采集的 26株野
生龙须菜中完全一致 ,未发现多态性。而另外 4 对来
自细江蓠的引物中只有 3 对有扩增产物 ,经过多态性
分析 ,最终筛选获得 2个多态性微卫星 DNA 位点 ,其
引物对分别是 Gv1CT 和 Gv1AAG。从表 4 可以看出 ,
Gv1CT 和 Gv1AAG的等位基因数都是 6 ,具有多态性;
它们的观测杂合度分别是 0.28 和 0.125 ,多态姓信息
含量的值分别是 0.625和 0.226 ,有效等位基因数分别
是 3.133和 1.3 ,说明 Gv1CT 比 Gv1AAG 具有更高的
多态性信息 。图 1 、图 2 分别为引物 Gv1CT 和
Gv1AAG在龙须菜中的扩增带谱 。
2612期 张学成 ,等:龙须菜微卫星 DNA 标记筛查及系统分析
表 4　两对多态性微卫星 DNA 引物及其评价
Table 4　Tw o polymo rphic pairs of microsatellite primers and their evaluation
SSR标记
Name
等位基因数(分布范围 bp)
Alleles number(range) HO HE PIC HW ae
Gv1CT
6
250 ～ 283 0.28 0.695 0.625 0 3.133
Gv1AAG
6
210 ～ 240 0.125 0.236 0.226 1 1.3
HO:观测杂合度;HE:期望杂合度;HW:哈迪-温伯格平衡;PIC:多态性信息含量;ae:有效等位基因数
HO:observed heterozygosi ty;H E:expected heterozygosi ty;HW:Hardy-Weinberg;PIC:Polym orphism Information Content;ae:Ef fective number of alleles
图 1　引物 Gv1CT 在龙须菜中的扩增带谱(a-z 为 26 个
青岛野生型龙须菜个体)
Fig.1　Pattern of microsatellite band in Gracilaria lemaneiformis
amplified by primer Gv1CT (a-z:26 samples of wild-ty pe
G.lemaneiformis from Qingdao)
图 2　引物 Gv1AAG 在龙须菜中的扩增带谱
(M 为 pBR322DNA/MspⅠ;a-z为 26个青岛野生型龙须菜个体)
Fig.2　Pattern of microsatellite band in Gracilaria lemaneiformis
amplified by primer Gv1AAG(M:pBR322DNA/MspⅠ;a-z:26
samples of wild-type G.lemanei formis from Qingdao)
2.3设计自龙须菜的微卫星 DNA位点引物的种间转移
扩增结果
由于设计自龙须菜公共核酸数据库的 5对微卫星
引物在采集自青岛湛山湾的野生龙须菜个体之间没有
表现出多态性 ,因此对其进行了江蓠属种间的转移扩增
及龙须菜不同品系间的扩增。
结果显示 ,除引物A在 8种实验材料中都只有 1条
扩增产物外 ,其他 4对引物在品系及种间都存在着扩增
带谱的多态性。
2.4样品间的遗传距离 、遗传相似系数及聚类图谱
用 TFPGA软件对来自龙须菜的 4对引物(C ,E ,G ,
T)在 6个龙须菜品系及 2个种外物种中的扩增数据进
行处理 ,得到各样品间的 Nei氏遗传距离和 Nei氏遗传
相似系数矩阵(见表 5)。
根据不同样品间的 Nei氏遗传距离 ,采用 UPGMA
聚类分析对8个江蓠样品进行聚类分析 ,得到亲缘关系
树状图(见图3)。从图中可以看出 ,8个江蓠样品共聚成
三大类 ,5株龙须菜(除 LV 外)首先聚类在一起 ,然后与
LV相聚 ,再与细基江蓠(GT)和菊花心江蓠(GL)聚在一
起。
表 5　8 个江蓠样品间的 Nei氏遗传距离和 Nei氏遗传相似系数矩阵
Table 5　Nei s genetic distances and genetic identity matrix among 8 Gracilaria samples
样品
Samples
QD 981 SD LD SA LV GT GL
QD ＊＊＊＊＊ 1.000 0 0.933 3 0.933 3 0.866 7 0.500 0 0.400 0 0.600 0
981 0.000 0 ＊＊＊＊＊ 0.933 3 0.933 3 0.866 7 0.500 0 0.400 0 0.600 0
SD 0.069 0 0.069 0 ＊＊＊＊＊ 1.000 0 0.933 3 0.566 7 0.466 7 0.666 7
LD 0.069 0 0.069 0 0.000 0 ＊＊＊＊＊ 0.933 3 0.566 7 0.466 7 0.666 7
SA 0.143 1 0.143 1 0.069 0 0.069 0 ＊＊＊＊＊ 0.566 7 0.466 7 0.666 7
LV 0.693 1 0.693 1 0.568 0 0.568 0 0.568 0 ＊＊＊＊＊ 0.433 3 0.500 0
GT 0.916 3 0.916 3 0.762 1 0.762 1 0.762 1 0.836 2 ＊＊＊＊＊ 0.666 7
GL 0.510 8 0.510 8 0.405 5 0.405 5 0.405 5 0.693 1 0.405 5 ＊＊＊＊＊
下对角线:Nei氏遗传距离;上对角线:Nei氏遗传相似系数
Below diagonal:Nei s genetic distance;Above diagonal:Nei s genetic identity
262 中　国　海　洋　大　学　学　报 2 0 0 9 年
图 3　8 个江蓠样品树状聚类图
Fig.3　Dendrog ram of 8 Gracilaria samples
3　讨论
本研究利用已知的公共核酸数据库进行微卫星
DNA标记的筛选。根据龙须菜公共核酸数据库微卫星
DNA序列设计了 5对引物 ,但它们在青岛野生龙须菜个
体间的扩增产物都不具多态性。分析其原因有可能有
以下几点:①在进行微卫星 DNA研究时 ,所选择的微卫
星DNA核心序列的重复次数应越多越好 ,这样就有可
能提供更多的多态性 。而本实验在筛选微卫星 DNA位
点时由于数据库中关于龙须菜的核酸数据较少因此采
用的标准较低 ,不足以获得具有很高多态性的微卫星
DNA产物;②龙须菜在全世界的分布尽管很广 ,但在 1
个采集地所采集的个体往往生长的范围很小 ,有时就仅
仅局限在几个水湾中 ,这可能与其孢子放散等繁殖方式
相关。因此个体之间有可能亲缘关系很近 ,造成了扩增
条带的相同 。
在扩增片段的长度上 ,引物 G 、C和 E的扩增产物大
小与预期相同 ,但引物 A和 T 的扩增产物大小分别为
320 bp和 500 bp ,与预期产物大小有一定差距。这与基
因组DNA中含有的一些非转录区有关系。这些区域的
存在使从基因组中扩增出的片段长度往往大于在 ESTs
中的片段长度。龙须菜的基因组研究还刚刚开始 ,在各
大数据库中可以获得的核酸序列很少 ,可供借鉴的数据
有限 ,但是随着龙须菜分子研究的不断深入 ,数据库资
源的不断丰富 ,公共数据库依然能为龙须菜微卫星 DNA
标记的筛选提供一种切实可行的方法 。
实验中利用细江蓠微卫星 DNA引物在青岛野生龙
须菜群体中进行了引物种间转移扩增研究。在 4对引
物中 ,3对引物在龙须菜中都有扩增条带 ,其中 2对具有
多态性 ,证明所选用的微卫星 DNA 位点在细江蓠和龙
须菜之间具有较好的保守性。在获得的 2对微卫星
DNA标记中 ,都在龙须菜群体扩增时出现了 1 ～ 2个体
没有扩增产物的现象。这种现象有可能是因为座位上
出现了无效等位基因所引起的。无效等位基因是指不
被PCR扩增的等位基因 ,通常是由引物结合部位的点突
变 、插入或缺失引起[ 13] 。而且这种突变并没有在群体中
被固定 ,则只有一部分等位基因没有被扩增出来 ,因此
在电泳时 ,实际为杂合的位点 ,仅出现单条电泳带而呈
现纯合现象 ,另一部分个体则可能由于含有 2个无效等
位基因而得不到相应的扩增产物。无效等位基因如果
不被识别出来 ,则会导致群体中纯合子过剩或杂合子缺
失的现象 ,从而出现观测杂合度与期望杂合度偏离的现
象。
通过计算多态性微卫星 DNA 位点的 Hardy-Wein-
berg平衡值 , Gv1CT 位点不平衡 , 且偏离严重。而
Gv1AAG位点处于平衡状态 ,没有偏离 Hardy-Weinberg
平衡。微卫星 DNA 位点的基因频率偏离 Hardy-Wein-
berg平衡说明了龙须菜在这些位点受到了选择 、突变等
因素的影响。新基因的出现往往会使基因频率在很大
程度上偏离平衡 ,虽然基因的自然突变率很低 ,但它仍
然是群体基因频率变化的一个主要原因。只要不平衡
位点的存在 ,这种标记基因对选择就有价值。而且不平
衡位点的出现具有品种特异性 。Gv1CT 的具有较高的
多态性 ,表现为较高的杂合度。但期望杂合度和观察杂
合度的差值过大。Gv1AAG的多态性较低 ,表现为较低
的杂合度 ,但是其观察值和期望值的差异小 ,进一步说
明该位点的微卫星 DNA标记是合理的 。
在利用从龙须菜公共核酸数据库设计的微卫星引
物对龙须菜不同品系及另外 2个江蓠属物种进行的扩
增实验中 ,由于样本量的限制 ,没有做跨品系及物种的
位点多态性测试 ,但从实验结果看在品系间或种间的转
移使用是可行的 。微卫星 DNA 在不同物种 、同一物种
的不同位点 ,以至于同一位点的不同等位基因之间都有
着不同的突变率。从引物A完全相同的扩增结果来看 ,
虽然实验所用的不同龙须菜品系及江蓠属不同种 ,分布
区域距离较远属于不同地理不同种群 ,但是不同地理位
置的近缘种群在微卫星 DNA位点的进化上却存在着高
度的一致性 , 表现出高度的同源性。孙雪等[ 14] 对
BI544215(引物 A 的源序列)序列在网上进行 BLASTX
比对 ,推测 BI544215功能与核糖体蛋白 S25有关 。这也
体现了江蓠属实验样品中的核糖体蛋白在进化上具有
一定的保守性。
遗传距离和聚类分析的结果表明 ,龙须菜的遗传相
似程度与地域分布相关 ,来自同一地区的个体先聚合 。
本实验所研究的龙须菜样品 ,有的生活在不同的海区 ,
有的采集自不同的大洲 ,自然环境如海水水温 、光照和
营养等都不同 ,这些因子对龙须菜的分布有很大的影
响 ,不同的环境因素可能是造成遗传变异的主要因素 。
样品 QD与 981 、样品SD与 LD的采集地点接近 ,所以相
似性最高 ,为 1.000。981作为在我国南方福建 、广东等
省推广栽培的耐高温栽培品系 ,其原始物种是从青岛湛
山湾采集的 ,虽然经过多年的驯化 ,仍然保持了同原产
2632期 张学成 ,等:龙须菜微卫星 DNA 标记筛查及系统分析
地野生物种最接近的遗传距离。本实验的结果还表明
LV与龙须菜之间的差异远远高于种内水平的差异 ,而
成为一种种间水平的差异。这与孙雪等[ 15]的结论相吻
合 ,认为应该将委内瑞拉龙须菜从龙须菜种中划分出
来。
参考文献:
[ 1] 　杨红生 , 毛玉泽, 周毅, 等.龙须菜在桑沟湾滤食性贝类养殖海区
的生态作用 [ J] .海洋与湖沼(专辑), 2003:121-127.
[ 2] 　李文红 , 姚建亭, 王继成, 等.龙须菜(Graci laria lemanei formis)选
育品系及其野生型的 ISSR指纹分析 [ J] .海洋与湖沼, 2005 , 36
(3):241-247.
[ 3] 　Schlot terer C , Tautz D.Slippage synthesis of simple sequence DNA [ J] .
Nucleic Acid Research , 1992 , 20:211-215.
[ 4] 　Nicolas B.Early effect of inbreeding as revealed by microsatellit e analyses
on Ostrea ed ulis larvae [ J] .Genetics , 1998 , 148:1893-1906.
[ 5] 　Hee S K , Byung L L.Assessment of markers for the ident ification of mi-
crosatellite instability phenotype in gastric neoplasms [ J] .Cancer Let ters,
2001 , 164:61-68.
[ 6] 　Ramsay L , Macaulay M , Ivanissevich S , et al.A simple sequence repeat-
based linkage map of barley[ J] .Genetics , 2000 , 156:1997-2005.
[ 7] 　李莉好 , 喻达辉.基因组微卫星 DNA位点的分离方法及其在水产
动物中的应用 [ J] .南方水产 , 2006, 2(5):74-80.
[ 8] 　匡刚桥 , 刘臻 , 鲁双庆 , 等.GenBank数据库中鳜鱼微卫星位点的筛
选及特征分析[ J] .动物学报, 2007 , 53(1):184-189.
[ 9] 　Rémi Wat tier , John F D , Christophe Destombe , et al.Single locus mi-
crosatellites in Gracilariales(Rhodophyta):High level of genetic variability
within Graci laria gracilis and conservation in related species[ J] .Phycol ,
1997 , 33:868-880.
[ 10] 　Luo H , Morchen M , Engel C R , et al.Characterization of microsatellite
markers in the red alga Gracilaria gracilis [ J] .Mol Ecol , 1999 , 8(4):
700-702.
[ 11] 　Guillemin M L , Destombe C , Faugeron S , et al.Development of mi-
crosatellites DNA markers in the cultivated seaw eed, Graci laria chilensis
(Gracilariales , Rhodophyta)[ J] .Molecular Ecology Notes , 2005 , 5:
155-157.
[ 12] 　Becker J , Heun M.Barley microsatellites:allele variation and mapping
[ J] .Plant Molecular Biology , 1995 , 27:835-845.
[ 13] 　Callen D F , Thompson A D , Shen Y , et al.Incidence and origin of
“ null” alleles in the(AC)nmicrosatellite markers [ J] .Am J Hum Genet ,
1993 , 52:922-927.
[ 14] 　孙雪.龙须菜 cDNA文库构建及 EST 和 ISSR分析 [ D] .青岛:中
国海洋大学, 2003.
[ 15] 　Sun X , Zhang X C , Mao Y X , et al.Identifacation of phase and sex-re-
lated markers of red alga Graci laria lemanei formis [ J] .Journal of Ocean
Univ of China , 2006 , 15:82-84.
Screening Microsatellite Sequences fromGracilaria lemaneiformis
and It s Phylogenetic Analysis
ZHANG Xue-Cheng , HE Yang , XU Di
(College of Marine Life Sciences , Ocean University of China , Qingdao 266003 , China)
Abstract:　Eight microsatellite-containing sequences of Graci laria lemanei formis were identified f rom dbEST/Gen-
Bank and 5 primer pairs have been designed from these identified microsatellite sequences.Then 4 primer pairs of mi-
crosatellite of G.gracilis were used together with the other 5 pairs to detect their polymorphism among 26 individuals
of wild G.lemaneiformis sampled in Qingdao.Only 2 pairs of primer were identified as having the polymorphic PCR
band pattern.Furthermore , those 5 pairs of primers designed from G.lemanei formis microsatellite sequences were
used to do phylogenetic analysis among 6 different G.lemanei formis strains and the other tw o outgroups of Graci laria
species.The data was analyzed by means of Nei s similarity coefficient , and a phenogram was constructed.Analyses of
data showed that G.lemaneiformis from Qingdao (QD)and the cultivated strain (981), G.lemaneiformis from
Shidao(SD)and G.lemanei formis from Longxudao (LD)displayed the highest genetic similarity of all the samples
and G.lemanei formis from Venezuela should not be clustered into the species of G.lemanei formis suggested by the
large genetic distance with the other G.lemanei formis st rains.
Key words:　Gracilaria lemaneiformis;microsatellites;polymorphic analysis;phylogenetic analysis
责任编辑　于　卫
264 中　国　海　洋　大　学　学　报 2 0 0 9 年