全 文 ：龙须菜四分孢子体 cDN A文库的构建
孙　雪　张学成 　隋正红　茅云翔
(中国海洋大学海洋生命学院 ,青岛 266003)
摘　要: 　为了研究不同世代和性别基因表达谱的差异 ,本文构建了龙须菜 (Gracilaria
lemaneiformis)四分孢子体的 cDN A文库。总 RN A提取使用 RNeasy Plant M ini Kit( Qiagen) , cDNA
文库构建使用 SM ART cDN A Librar y Constr uction Kit( Clontech) ,包装蛋白购自 Prom ega公司。该
cDN A文库含有 1. 28× 106个克隆 ,扩增文库的滴度是 1. 98× 109 pfu /m L ,重组频率是 85. 0% ,插入
片段几乎全部集中在 500～ 1500 bp之间。
关键词: 　龙须菜 ; cDN A文库 ; 四分孢子体
中图法分类号: 　 Q943. 2; Q344+ . 13　　　　文章编号:　 1001-1862( 2003) 05-727-06
构建 cDN A文库是当今真核生物分子生物学研究的基本手段之一。 cDN A文库不仅在发
现和分离新基因方面十分有效 ,还可以用来进行 EST测序以了解遗传信息的时空表达特点。
国外利用 cDN A文库进行红藻分子生物学研究的报道很多 ,如 Galdieria sulphuraria中类似
真核生物光吸收蛋白多肽的分离 ,小珊瑚藻 (Coral lina pilul if era )中钒依赖的溴代过氧化物酶
克隆 bpo1和 bpo2的分离 [1-2] ,以及进行大规模的 EST分析而构建的条斑紫菜 ( Porphyra
yezoensis )的 cDN A文库 [3-4 ]等。而国内关于藻类 cDN A文库构建的报道较少 ,仅见于绿藻中的
盐生杜氏藻 (Dunaliel la sal ina ) [5 ] ,红藻中进行 ES T分析而在条斑紫菜和龙须菜 (Gracilaria
lemaneiform is )的配子体中分别构建的 cDN A文库 [ 6-7 ]。对不同发育阶段和不同组织的 cDN A
文库进行筛查是得到差异表达基因的 1种快速且有效的手段 ,目前已在多种生物中得到应用。
如在红藻中 , Lee等 [ 8]对日本凋毛藻 (Gri f f ithsia japonica)的 4种 cDN A文库进行筛查 ,分离
到了 1个亲环蛋白 -1克隆 ,并发现该序列在凋毛藻的营养体、雄配子体和四分孢子囊的藻枝
中丰富表达 ,而在雌配子体中只有基本水平的表达。 Liu等 [9 ]从紫菜属 P . purpurea的配子体
序列丰富的减数文库 ( subtracted cDN A library )中得到 1个编码脂肪酸氧化酶的基因 ,该基
因在孢子体文库中没有检测到。 Liu等 [ 10]还从紫菜属 P. purpurea的孢子体序列丰富的减数
文库中分离出 1个孢子体特异的编码延伸因子 1的α基因 ( EF-1α)的 cDN A克隆 ,该 EF-1α
序列与目前已知的 EF-1α基因有 9个插入和缺失的差异。
龙须菜是江蓠属的 1个重要的产琼胶种。龙须菜的生活史由四分孢子体、配子体和果孢子
体 (寄生在雌配子体上 ) 3个世代互相交替完成。配子体和四分孢子体之间差异表达的基因可
能包括控制减数分裂及其相关的基因 ;四分孢子体和果孢子体间的差异主要在于生长势的不
同 ,对 2者进行比较可能得到生长调控相关的基因 ;而雌、雄配子体之间可能存在控制性别分
第 33卷　第 5期　
2003年 9月　 　　
青 岛海 洋 大学 学 报
JOU RNAL O F OCEAN UNIV ERSITY OF QINGDAO 　　　　
33( 5): 727～ 732
Sep. , 2003

通讯作者
国家自然科学基金项目 ( 30170736)资助
收稿日期: 2003-04-01;修订日期: 2003-07-02
孙　雪 ,女 , 1974年 11月出生 ,博士生。
化的基因差异。本实验以龙须菜的四分孢子体为材料 ,构建了其 cDN A文库。作者试图以该文
库为基础 ,用来自龙须菜的配子体和果孢子体的 m RNA做探针在该四分孢子体文库中筛选差
异表达的基因。如果能够找到这样的差异基因 ,将为海藻中的世代、性别和生长调控的分子机
理的阐明奠定基础。
1　材料与方法
1. 1材料和试剂
1. 1. 1材料　　龙须菜采自青岛湛山湾 ,已在实验室培养多年。其培养条件同文献 [7]。取四分
孢子体健壮的藻枝构建 cDN A文库。
1. 1. 2试剂　　总 RN A的提取使用 Qiagen公司的 RNeasy Plant Mini Ki t;用 RNase-free
DNase Set去除 RNA中的 DNA。 cDN A文库的构建使用 Clontech公司的 SM ART cDNA
Library Const ruction Kit;宿主菌为 E. col i XL1-Blue;载体为 λTriplEx2;包装蛋白为购自
Promega公司的 Packgene R○ Lambda DN A Packing Sy stem; Advantage R○ 2 PCR Kit用来进
行噬菌体插入片段的 PCR扩增。 其它试剂如培养基的各种成分等均为进口试剂或国产分析纯。
1. 2方法
1. 2. 1总 RNA的提取　　称取藻体约 100mg ,按照试剂盒的说明进行 RNA的提取。取 6μL
RNA提取液在 1. 0%的琼脂糖凝胶和 1× TBE电泳缓冲液中电泳 ,在 5V /cm的条件下电泳
约 45min后观察结果。
1. 2. 2 cDN A的合成和文库的构建　　按照 SM ART cDNA Library Const ruction Ki t的说明
进行。cDN A的合成使用试剂盒中的长距离 PCR方法 ,取 2μL第 1链 cDN A产物进行 23个循
环的第 2链 cDN A的合成 ,合成的 ds cDN A在 1. 1%的琼脂糖凝胶中进行电泳检测。取 50μL
cDN A进行蛋白酶 K消化、 Sf i I酶切和 Chroma spin-400大小分级 ,将 500bp以上的 cDN As
与载体λTriplEx2做 3个不同比例的预连接反应 ,将这 3个连接进行 3个单独的包装。比较不
同连接的滴度 ,选取其中滴度最高的连接进行扩大体积的连接反应 ,合并各个连接的包装产
物。
1. 2. 3 cDN A文库的质量评定
1. 2. 3. 1文库的容量　　将扩增前文库的包装混合物 (共 250μL)混合均匀 ,取 1μL按照试剂
盒的说明进行滴定。过夜培养后计噬菌斑数来计算克隆总数。
1. 2. 3. 2文库的滴度　　从扩增的文库中取出 10μL,进行 2次 100倍的梯度稀释 ,即稀释倍
数为 104 ,再分别取该稀释液 1μL、 5μL和 10μL铺 3个不同的上层琼脂平板 ,按照公式 pfu /m L
= 噬菌斑的数目×稀释倍数 ( 104 )× 103 (μL /mL) /涂平板的稀释的噬菌液的体积 (μL) ,计算文
库的滴度。
1. 2. 3. 3文库的重组频率和插入片段的检测　　按照与文库滴定相同的操作进行重组频率的
测定 ,只是在融化的上层琼脂中加入 IPTG和 X-gal后再倒平板。过夜培养后分别计白色和蓝
色噬菌斑的个数 ,白色噬菌斑在总噬菌斑中所占的比例即为重组频率。又用另 1种方法即从平
板上随机取 20个噬菌斑 ,经过 PCR扩增来检测插入 DNA的有无来计算重组子所占的比例。
以试剂盒中的 5’和 3’ 测序引物为引物 ,用 Advantage 2 PCR Kit中的各种成分进行扩增。
PCR程序如下: 95℃预变性 2min后 ,再按照 95℃ 30s→ 68℃ 3min的程序进行 30个循环 ,最后
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68℃延伸 3min。 PCR产物在 1. 1%的琼脂糖凝胶中电泳 ,检查插入片段的有无及大小。
2　结果与讨论
2. 1总 RNA的提取　　龙须菜四分孢子体总 RNA的电泳结果见图 1。图 1中 28S rRN A条
带约为 18S rRN A条带亮度的 2倍 ,说明所提 RNA的完整性较好。 RNA的提取是基因转录
水平研究的首要环节 ,是进行 mRNA的分离、 cDN A的合成、 Northern杂交和体外翻译等实
验的必要前提。因此 ,完整的、高纯度的 RNA是后续实验成功的基本保证。
图 1　总 RNA的电泳结果
Fig . 1　 Elect ropho resis of to tal RN A
( 1为龙须菜四分孢子体的总 RNA;
M ,λDN A/EcoRI+ Hin dⅢ marker;
1 To ta l RNA iso la ted fr om
th e tetra spo rophy te of G. lemaneiformis )
图 2　 cDN A的电泳结果
Fig . 2　 Elec tropho resis o f cDNA
( 1为龙须菜四分孢子体的 cDNA;
M ,λDN A/EcoRI+ HindⅢ marker;
1 cDNA synthesized from the
tet raspo r oph yte o f G. lemaneiformis
然而由于 RNA的不稳定和 RNase的高度稳定及广泛存在的特点 ,使得 RNA的提取工
作比较困难。虽然试剂盒的使用已经大大简化了 RNA提取工作的复杂性与难度 ,但是目前还
没有专门用于藻类 RNA提取的试剂盒。本实验选用了 Qiagen公司的微量植物 RNA提取试
剂盒 ,取得了较好的结果。该试剂盒操作简单、快速 ,减少了 RNA降解的机会。用该试剂盒提
取 RNA,有几点经验提出以供参考:第 1是关于操作中的涡旋步骤 ,涡旋时间短 (如 15s)基因
组 DNA剪切不彻底 ,而涡旋时间长 (超过 30s)又易引起 RNA的降解 ,使得 2条 rRN A条带
亮度几乎相同 (图未给出 )。 为解决这一问题 ,本文使用了 RNase-free DNase Set ,在进行短时
间的涡旋 (如 10s)后再用 DNase来消化剩余的 DNA。第 2是关于藻体的研磨 ,研磨时尽量选
取藻体的幼嫩部分 ,因为这部分 RNA含量高而多糖较少。同时尽可能地使其保持在有液氮的
状态 ,如果有融化则应放弃。 第 3是关于 RNA的电泳 , RN A电泳通常用变性的甲醛凝胶 ,但
是这种胶的制作稍显繁琐 ,需要配置无 RNase的 MOPS电泳缓冲液和甲醛凝胶。而且由于后
续实验不需要回收或转膜 ,因此在本实验中使用普通的琼脂糖凝胶和 DEPC处理的 TBE电
泳缓冲液 ,达到了快速检测 RNA的目的。
2. 2 cDN A的合成　　在本试剂盒提供的 2种 cDN A合成方法—长距离 PCR法和引物 PCR
法中 ,作者选用了长距离 PCR法。该方法对起始 RNA的用量要求不高 ,只要> 50ng以上即
7295期 孙　雪 ,等:龙须菜四分孢子体 cDN A文库的构建
可。在 cDN A的合成过程中 ,合成 cDN A第 2链的 PCR扩增的循环数的确定是 1个关键 ,循
环数过多 ,容易产生非特异的 PCR产物 ;而循环数过少则产量不足。因此进行 cDN A合成时
根据总 RNA的含量 (约 250 ng ) ,文中使用了 23个循环进行 cDN A第 2链的合成。从 cDN A
的电泳结果 (图 2)可见 cDN A的大小从 100～ 5 100bp成弥散状分布 ,最密集的 cDN A集中在
500～ 2 500bp之间。
2. 3文库的质量检测
2. 3. 1文库的容量　　按照平均每个平板上 256个噬菌斑计 ,再乘以稀释倍数 ( 20)和总的包
装体积 ( 250μL) ,共有 1. 28× 106个独立的克隆。按照公式 N = ln( 1- P ) /ln( 1- 1 /n ) (其中 N
为实际克隆数 ,P为筛选到某 1个克隆的几率 ,n为某 1稀有 mRNA在总 RNA中所占的相对
比例 ) , 1个文库中至少应该有 1. 70× 105个克隆才可以克隆到某低丰度 mRNA[11 ]。可见该文
库容量已足够用于检测某 1稀有基因。
2. 3. 2文库的滴度　　从 104倍稀释的扩增文库中分别取出 1μL, 5μL和 10μL进行滴定 ,其噬
菌斑数依次为 252, 942和 1 546,由这 3个值算出的平均文库滴度为 1. 98× 109。该试剂盒的使
用说明认为用该试剂盒构建的成功文库滴度应该> 1010 ,但这可能与不同的包装系统等有关。
李太武等 [12 ]认为一般的文库滴度能够达到 105 pfu /m L以上即为有效文库。
图 3　重组子的检测
Fig. 3　 Identification of r ecombinants
( 1～ 20分别为检测的 1～ 20个克隆 ;
M , 100 bp ladder ma rker;
1～ 20 represent 1～ 20 clones, r espectiv ely )
2. 3. 3重组频率的计算　　用 IPTG和 X-gal
涂平板进行蓝白斑筛选 ,平均每个平板上 156
个克隆中有 2个蓝色的噬菌斑出现 ,由此计算
出文库的重组子比例为 98. 7%。 又从平板中
随机挑 20个噬菌斑进行 PCR扩增 (其电泳检
测结果见图 3) ,共扩增出 17个 (其中 8、 9和
12的扩增条带很浅 ,当作未扩增出来计 ) ,据
此计算的重组子比例为 85% 。该值与殷志新
等 [13 ]用相同的文库构建试剂盒在石斑鱼白细
胞文库中的 82%的重组频率比较接近。
2. 3. 4文库中插入片段的检测　　在扩增出
的 17个噬菌斑中 ,插入片段大小约 450bp的
有 1个 , 500～ 600bp之间的有 2个 , 700～
1 000bp和 1 000～ 1 500bp的各 7个。 由此可
见 700～ 1 500bp片段 ( 82. 4% )是文库中的优
势克隆 , 400bp以下的小片段和 1. 5 kb以上
的长片段未检测到。 殷志新等 [ 13]用相同的文
库构建试剂盒构建的石斑鱼白细胞的 cDN A
文库中 ,其插入子范围在 0. 5～ 2. 3kb之间 ,他们所随机挑取的 8个克隆中有 1 /2的大小在
500～ 750bp之间 , 3个在 1～ 2kb之间 ,仅 1个超过了 2kb。 由此可见 , 2者的插入片段大小基
本类似。由图 2的 cDN A电泳结果可以看出 , 500～ 2 500bp是 cDN A密集的区段 ,插入克隆的
大小也应该集中在该区段 ,但该文库的插入片段集中在 700～ 1 500bp,这可能与连接过程中
载体优先与较小片段的连接有关。
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参考文献:
[1 ]　 Marquardt J, Wans S, Rhiel E, et al. In t ro-exon s t ructure and g ene copy number of a g ene encoding fo r a
member-ins tric light-harv es ting polypept ide of th e red alga Galdieria sulphuraria [ J ]. Gene, 2000, 255 ( 2 ):
257～ 265
[2 ]　 Shimonishi M , Kuwamo to S, Inoue H, et al. Cloning and exp ression of the gene fo r a v anadium-d ependent
b romop eroxidase f rom a marine macro-alga, Corall ina p ilul i f era [ J] . FEBS Let t , 1998, 428 ( 1-2): 105～ 110
[3 ]　 Nikaido I, Asamizu E, Nakajima M , et al. Generation of 10, 154 express ed sequence tag s f rom a leafy
gametoph yte of a marine red alga, Porph yra yezoensis [ J] . DNA Res , 2000, 7: 223～ 227
[4 ]　 Lee E K, Seo S B, Kim T H, et al. Analysi s of ex press ed sequence tags of Porphyra yezoensis [ J ]. Mol Cel ls ,
2000, 10 (3): 338～ 342
[5 ]　周冀明 ,白林含 ,吴晓蓉 ,等.盐藻磷酸甘油脱氢酶基因 cDN A文库的构建 [ J] . 四川大学学报 , 1997, 34( 6): 839～
842
[6 ]　杨官品 ,刘永健 ,孙　雪 ,等 .条斑紫菜丝状孢子体 cDNA文库构建及抗病相关基因鉴定 [ J ].青岛海洋大学学
报 , 2003, 33( 1): 47～ 52
[7 ]　 Sun X, Yang G P, Mao Y X, et al. Analysis of exp ress ed sequence tags of a marine red alga, Graci lar ia
lemanei formis [ J ]. Progress in Natu ral Science, 2002, 12 ( 7): 518～ 523
[8 ]　 Liu Q Y, Rei th M E. Isolation of a gametoph yte-speci fic cDN A encoding a lipox ygenas e f rom the red alga
Porphyra p urpu rea [ J] . Mol Mar Biol Biotechnol , 1994, 3 ( 4): 206～ 209
[9 ]　 Liu Q Y, Baldauf S L, Reith M E. Elongat ion factor 1 alpha genes of the red alga Porph yra purpurea include a
novel, d evelopmentally speciali zed varian t [ J] . Plant Mol Biol, 1996, 31: 77～ 85
[10 ]　 Lee Y K, Hong C B, Suh Y, et al. A cDN A clone for cyclophilin f rom Gri f f i thsia japonica and ph ylogenetic
analysis of cyclophi lins [ J ]. Mol Cell , 2002, 13( 1): 12～ 20
[11 ]　王来元 ,王金星 ,赵小凡 ,等 .家蝇 cDN A文库的构建 [ J] . 动物学研究 , 2001, 22( 2): 159～ 162
[12 ]　李太武 ,相建海 ,刘瑞玉 .中国对虾 cDN A文库的构建 [ J] . 动物学报 , 1998, 44( 2): 237～ 238
[13 ]　殷志新 ,翁少萍 ,叶巧真 ,等 .斜带石斑白细胞 cDN A文库的构建 [ J ].水产学报 , 2001, 25( 6): 538～ 541
7315期 孙　雪 ,等:龙须菜四分孢子体 cDN A文库的构建
Construction of a cDNA Library from the Tetrasporophyte of
Gracilaria lemaneiformis (Rhodophyceae )
Sun Xue　 Zhang Xuecheng　 Sui Zhenghong　 Mao Yunxiang
(College of Marine Lif e Sciences , Ocean University of China, Qingdao 266003, China )
Abstract : 　 In o rder to study the differentially expressed genes in dif ferent phases and
sexes o f Gracilaria lemanei formis , a cDN A library f rom the tet rasporophytic thalli w as
const ructed. Total RN A was iso lated by using RNeasy Plant Mini Kit from Qiagen.
The cDN A library w as constructed by SMART cDNA Library Const ruction Ki t f rom
Clontech, while the packing system w as purchased from Promega. The constructed
cDN A library contains 1. 28× 106 independent clones, the ti ter of the amplified libra ry is
1. 98× 109 pfu /mL and the recombinant rate is 85. 0% calculated by the ampli fica tion o f
random ly selected 20 clones. Of the amplified 17 clones, 16 insert DN As range f rom 500
bp to 1500 bp in leng th and one is about 450 bp.
Key words: 　Gracilaria lemaneiformis; cDN A library; tet raspo rophy te
海 洋 人物
托里拆里 , E. ( Evangelista Tor ricelli , 1608～ 1647)意大利物理学家、数学家。生于罗马阿
法恩扎 ,逝世于佛罗伦萨。历任加利略 ( Galileo )秘书、佛罗伦萨学院数学教授、宫廷数学家
和哲学家。气象学上 , 1643年与 V.维维西尼共同提出气压概念 ;发明水银气压计 ;断定水
银高度的变化是由大气压强引起的 ;提出风的成因 ;发明的晴雨计沿用至今。数学上 ,促进
微积分发展。物理学上 ,改进光学仪器 ,透镜磨光 ;提出有关液体运动和抛物体运动研究。
水利学上 ,解决许多实用水利工程问题 ; 1644年发现射流定理。 奥地利物理学家、科学哲
学家 E.马赫称“他实为水利学奠基人”。
(刘安国 )
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